Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1.1. Ретиналь содержащие белки галофильных архебактерий 8
1.1.1. Функции и биологическое место 8
1.1.2. Общая характеристика и свойства ретиналевых белков Я salinarum 9
1.2. Бактериородопсин . 11
1.2.1. Исторический обзор и общая характеристика 11
1.2.2. Фотоцикл бактериородопсина 12
1.2.3. Стабилизация промежуточных состояний 16
1.2.4. Кристаллографические структуры основного и промежуточных состояний BR 17
1.2.5. Модели транспорта протона 21
1.3. Сенсорный родопсин II из Natronobacteriumpharaonis 22
1.3.1. Структура и фотоцикл SRII ,.„ ,...22
1.3.2. Взаимодействие с трансдьюсерным белком и передача сигнала 24
1.4. Кристаллизация мембранных белков в липидной кубической фазе 26
1.4.1. Особенности кристаллизации мембранных белков 26
1.4.2. Липидная кубическая фаза 27
1.4.3. Методика кристаллизации в липидной кубической фазе 29
1.4.4. Механизм кристаллизации в кубической фазе 29
1.5. Мероэдрическое двойникование белковых кристаллов 30
1.6. Текущие проблемы и противоречия в исследовании BR и SRI1 32
1.7. Заключение 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Материалы для кристаллизации 34
2.1.1. Моноглицериды 34
2.1.2. Октилглюкозид 34
2.2. Получение и очистка бактериородопсина 35
2.2.1. Культивация бактерий 35
2.2.2. Выделение ПМ 35
2.2.3. Солюбилизация BR 36
2.2.4. Определение концентрации и качества BR 37
2.2.5. Определение концентрации детергента 37
2.3. Кристаллизация бактериородопсина в кубической фазе 39
2.4. Расщепление двойниковых кристаллов 40
2.5. Дифракция нейтронов и определение симметрии и постоянной решетки кубической фазы 40
2.6. Установки для малоугловой дифракции и рассеяния нейтронов : ЮМО и Діб.42
2.7. Установки для рентгеновской кристаллографии белков 43
2.8. Определение фактора двойникования кристаллов 44
2.9. Принципы измерения спектроскопических данных с разрешением по времени 46
2.10. Инфракрасная Фурье-спектроскопия. Принцип пошагового сканирования 47
2.11. Установка для спектроскопии кристаллов 50
2.11.1. Спектроскопия в видимом диапазоне: статическая и с временным разрешением 50
2.11.2. Спектроскопия в ИК диапазоне 53
2.12. Определение кинетики фотоцикла: выбор модели и обработка данных 54
ГЛАВА 3. Кристаллизация бактериородоисина; исследование механизма и оптимизация условий кристаллизации
3.1. Введение 58
3.2. Изучение эволюции параметров липидной фазы в процессе кристаллизации с помощью дифракции нейтронов 59
3.2.1, Идентификация фазы 59
3.2.2. Медленная кинетика 60
3.23. Быстрая кинетика 62
3.3. Поведение кристаллизационной системы при изменении соотношения раствор/липид 63
3.4. Влияние моноглицерида: кристаллизация в МО, MB и MP 66
3.5. Влияние октилглюкозида 67
3.6. Влияние концентрации белка и рН 68
3.7. Обсуждение 68
3.8. Двойникование и скорость роста кристаллов 70
3.9. Расщепление двойниковых кристаллов на одиночные 71
3.10. Структура двойниковых кристаллов и модель возникновения двойникования 74
3.11. Основные результаты и выводы 75
ГЛАВА 4. Характеристика кристаллов спектроскопическими методами и фиксация промежуточных состояний в кристалле для рентгеноструктуриого анализа
4.1. Введение 78
4.2. Спектроскопия кристаллов BR 78
4.2.1. Характеристика основного состояния в кристалле 78
4.2.2. Характеристика фотоцикла BR в кристалле с помощью видимой и ИК-Фурье спектроскопии с разрешением по времени 80
4.3. Фиксация и характеристика промежуточных низкотемпературных состояний в кристаллах BR 85
4.3.1. К состояние 85
4.3.2. L и М состояния 86
4.3.3. N состояние 89
4.4. Обсуждение 91
4.5. Рентгеноструктурные данные основного и промежуточных состояний кристаллов BR 94
4.6. Спектроскопия кристаллов SRII в комплексе с Htrll 95
4.6.1. Спектр поглощения и фотоцикл 95
4.6.2. Фиксация и характеристика К состояния 97
4.6.3. Фиксация и характеристика М состояния 98
4.7. Кристаллографические структуры К и М состояний комплекса SRII 102
4.8. Основные результаты 104
4.9. Основные выводы 105
Основные выводы работы 107
Библиографический список используемой литературы 109
- Кристаллографические структуры основного и промежуточных состояний BR
- Дифракция нейтронов и определение симметрии и постоянной решетки кубической фазы
- Поведение кристаллизационной системы при изменении соотношения раствор/липид
- Кристаллографические структуры К и М состояний комплекса SRII
Введение к работе
Способность живых организмов эффективно преобразовывать энергию из одного вида в другой, является одним из условий, обеспечивающих сохранение и распространение жизни. Синтез наиболее распространенного переносчика энергии в живых системах - афденозин-трифосфата (АТФ) требует наличия градиента электрохимического потенциала на мембранах клеток или органелл, синтезирующих АТФ. Градиент электрохимического потенциала создается посредством контролируемых ферментами окислительно-восстановительных и фотохимических реакций [1]. Простейшим и наиболее исследованным ферментом, преобразующим энергию света в электрохимический потенциал является бактериородопин (BR). Этот трансмембранный белок археи Halobacterium salinarum, поглощая свет, переносит протоны из цитоплазмы во внеклеточное пространство. BR благодаря ряду свойств: доступности в больших количествах, простоте очистки и стабильности; в течение последних 30 лет был одним из самых интенсивно изучаемых мембранных белков [2].
Гомологичный BR сенсорный родопсин II (SRII) является фоторецептором синего света, активирующим двухкомпонентный сигнальный каскад, который является одним из самых распространенных в природе. Данная сигнальная цепь регулирует работу флагеллярного мотора и позволяет археи избегать интенсивного синего и УФ освещения, вызывающего фотоокисление и разрушение организма [3]. Актуальность. Детальные механизмы транспорта протона BR и передачи сигнала SRII остаются непонятым до конца и противоречивыми [4;5]. Причиной этого является недостаточная точность и неполнота структурной информации, поскольку для понимания молекулярных механизмов функционирования белков необходимо знать какие структурные изменения, вызванные поглощением света ретиналем, сопровождают рабочий цикл белков и приводят к направленному транспорту протона или передачи сигнала. Одно из возможных решений данной проблемы состоит в получении молекулярных структур основного и промежуточных состояний рабочего цикла BR и SRII, причем, структуры BR должны включать атомы водорода. Данная задача может быть решена с помощью рентгеновской кристаллографии при наличии высокоупорядоченных трехмерных кристаллов белка с одной стороны и методов его фиксирования в промежуточных состояниях, с другой.
Цель работы заключалась в улучшении дифракционного качества белковых кристаллов, выращенных в липидной кубической фазе, исследовании влияния кристаллического окружения белков на их функциональность спектроскопическими методами и определении условий фиксирования промежуточных состояний белков в кристаллах при низких температурах.
Состояние исследуемых проблем. Кристаллы BR, позволившие определить структуру белка на молекулярном уровне, были получены в результате нового подхода, заключающегося в использовании липидной кубической фазы для кристаллизации мембранных белков. Свойства кубической фазы, определяющие успех кристаллизации, в настоящее время активно изучаются с целью определения механизма кристаллизации белков в этой системе и оценки потенциала данного подхода для. кристаллизации мембранных белков [6],
Кристаллизация в кубической фазе позволила получить структуру основного и промежуточных состояний BR с разрешением, достигающим 1.55 А. В результате были определены детали структурных изменений, сопровождающих фотоцикл, как, например, переориентация аминокислотных остатков и движение молекул воды [7]. Однако, структуры некоторых из промежуточных состояний, полученных разными группами, сильно различаются, что ведет к противоречивым заключениям относительно механизмам переноса протона [8]. Причинами этого являются: недостаточно высокое разрешение дифракционных данных, мероэдрическое двойникование кристаллов, понижающее информативность дифракционных данных, и недостаточно полная характеристика промежуточных состояний при условиях сбора дифракционных данных с белковых кристаллов.
Структура SRII, а также его комплекса с трансдюсерным белком, были определены
с помощью рентгеноструктурного анализа, однако, их структура в сигнальном
і состоянии остается неизвестной.
Научная новизна работы. В работе впервые применен метод дифракции нейтронов для
изучения механизма кристаллизации в кубической фазе. Благодаря этому оказалось
возможным исследование эволюции свойств липидной фазы в процессе кристаллизации
и роста кристаллов на одних и тех же образцах.
В процессе оптимизации кристаллизационных условий было обнаружено, что
концентрация детргента является важным кристаллизационным параметром, и ее
оптимальный выбор позволяет существенно улучшить дифракционное качество кристаллов и воспроизводимость кристаллизационных экспериментов.
В данной работе впервые продемонстрировано, что двойниковые кристаллы белка могут быть расщеплены на одиночные без нарушения кристаллической структуры. Предложенный подход позволил получить кристалл BR без двойникования, с которого были собраны дифракционные данные с разрешением 1.35А.
В результате разработки нового экспериментального оборудования впервые удалось провести спектроскопические эксперименты с микросекундным временным разрешением в инфракрасном диапазоне на белковых микрокристаллах. Это дало возможность установить влияние кристаллического окружения и упаковки белков на их функциональность. В комбинации с низкотемпературной спектроскопией данный подход позволил наиболее детальную характеристику зафиксированных в кристалле промежуточных состояний.
Практическая ценность работы. Работа представляет общий интерес для белковой кристаллографии. В частности, результаты исследования механизма кристаллизации в кубической фазе представляются важными для кристаллизации и развития методики кристаллизации мембранных белков. Новые подходы к решению проблем двойникования могут быть использованы в других лабораториях для устранения двойникования белковых кристаллов.
Развитые в работе методики характеристики белковых кристаллов спектроскопическими методами представляют интерес для кристаллографических исследований механизмов функционирования белков, поскольку позволяют сравнивать химические и структурные изменения, сопровождающие функционирование белков в кристалле, с изменениями, сопровождающими их функции в естественном окружении. Кроме того, данные результаты могут найти применение в видимой и инфракрасной микроспектроскопии, в частности, для исследования биологических тканей и отдельных клеток. Также микроспектроскопия в комбинации с проточной кюветой может найти применение в исследованиях нециклических биореакций.
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав и заключения. Первая глава представляет литературный обзор, в котором показано, какое место исследуемые в работе белки, археродопсины, занимают в биологическом пространстве. Детально рассмотрено современное представление о механизмах функционирования
археродопсинов. Особое внимание уделено текущим проблемам в понимании данных механизмов. Также в первой главе рассматривается кристаллизация мембранных белков в липидной кубической фазе и проблема двойникования кристаллов. Во второй главе описаны материалы, экспериментальные процедуры и оборудование, использованные в диссертационной работе. Данная глава включает описание биохимических и биофизических процедур для получения белка и его кристаллизации, рентгеноструктурных методов и оборудования, использованных для исследования свойств кубической фазы и белковых кристаллов. Третья часть второй главы посвящена спектроскопическим методам исследования свойств белков. Особое внимание уделено описанию сконструированного в данной работе экспериментального оборудования, а также обработке спектроскопических данных и проблемам описания фотоцикла. В третьей главе представлены результаты исследования свойств кубической фазы в процессе кристаллизации BR с помощью дифракции нейтронов. Также описаны эксперименты по оптимизации условий кристаллизации BR в кубической фазе. В последней части представлены результаты исследования двойникования кристаллов BR и предложены методы получения кристаллов без двойникования. Исследование свойств кристаллов BR и SRII в комплексе с трансдьюсерным белком спектроскопическими методами рассмотрено в четвертой главе. Здесь обсуждается влияние кристаллического окружения и упаковки на кинетику фотоцикла и характеристики промежуточных состояний белков. Специальное внимание уделено вопросу о способности белков совершать структурные изменения в кристалле. В этой же главе рассмотрены методы получения и характеристики стабильных промежуточных состояний фотоцикла в кристалле с использованием низкотемпературной спектроскопии. Здесь также представлены структуры промежуточных состояний (К и М) фотоцикла SRII в комплексе с трансдьюсерным белком, которые были получены с использованием результатов данной главы. В заключении диссертационной работы представлены основные выводы и библиографический список цитируемой литературы.
Кристаллографические структуры основного и промежуточных состояний BR
Общий вид структуры и расположение аминокислотных остатков, принимающих участие в транспорте протона, а также молекулы воды, находящиеся внутри BR, показаны на рис.1.8.а. ШО разделяет протонный канал на две части: цитоплазматическую (ЦП) и внеклеточную (ВК). ВК часть канала образована полярными аминокислотными остатками (Асп-85 и Асп-212 и Арг-82, Глю-194 и 204) и молекулами воды (рис. 1.8.6), которые образуют разветвленную сеть водородных связей вдоль канала. Дублет Глю-194/Глю-204 изолирован от ВК среды гидрофобными остатками [18], однако, как было показано с помощью молекулярной динамики, молекулы воды могут диффундировать между данной частью канала и ВК средой в пикосекундном временном масштабе [55].
ЦП часть канала, за исключением Асп-96 и двух молекул воды, выстлана гидрофобными остатками, поэтому перенос протона между ШО и цитоплазмой в основном состоянии невозможен.
К состояние. Две опубликованные кристаллографические структуры К состояния: первая с разрешением 2,1 А [56], вторая - 1.43 А [57], сильно различаются. Из-за недостаточно высокого разрешения в первой структуре ретиналь был смоделирован в планарной конформации. Структурные изменения вблизи области изомеризации ретиналя достаточно существенные и включают разупорядочение молекулы воды W402, сдвиг бокового остатка и пептидной цепи Лиз-216, а кроме того вращение карбоксильной группы Асп-85,
В модели с разрешением 1.43 А структурные изменения напротив относительно малы и затрагивают лишь ретиналь в области между атомами углерода С]2 и С15. При этом связь Сз= См находится в 13-цис конформации, однако С5 сдвинут из плоскости ретиналя. Несмотря на 13-цис конформацию, водород ШО направлен в сторону ВК канала, поскольку торсионные углы С]4-Сіз и С5-Ышо возмущены. Хотя данная модель лучше согласуется с экспериментальными данными, полученными другими методами, торсионные углы связей ретиналя в области между С и N[UO атомами при данном разрешении имеют значительные погрешности , таким образом истинная структура ретиналя и его окружения в К состоянии остается нерешенной. Кроме того ни одна из моделей не обнаружила изменения в области Асп-115, детектируемые посредством ИК спектроскопии [56,57].
Из трех существующих кристаллографических моделей L две решены с относительно низким разрешением 2.1 (накоплено при 170К)[58] и 2.3А (накоплено при 155 К)[59]. Сравнение этих моделей показывает, что при более низком разрешении изменения больше, чем при более высоком, хотя второе было накоплено при более высокой температуре и следовательно ожидаемые изменения должны быть больше. Кроме того структурные изменения в данной модели малоотличимы от М состояния, полученного в других работах.
Третья структура определена с разрешением 1.62А [60]. В данной модели большинство наблюдаемых изменений не превышает точности определения положения атомов, которая составляет 0.2-0.3А. При этом, в активном центре существенные изменения не наблюдаются, конформация ретиналя изменяется по сравнению с К состоянием несущественно и остается не планарной, более того, торсионный угол связи Ci4-Ci5 равен 50, что ближе к цис конформаци. Это представляется странным, поскольку в К и М [61] состояниях конформация данной связи ближе к транс.
Структура М состояния наименее противоречива на данный момент, хотя между двумя опубликованными структурами с разрешением 1.43 и 2.0А [61;62] нет полного согласия, основные структурные изменения имеют одинаковый характер. В М состоянии ретиналь принимает релаксированную 13-цис конформацию, хотя направление ШО противоречиво в двух существующих структурах. Структурным изменениям подвержена ВК часть протонного канала (рис. 1.8): молекула воды W402 разупорядочена, таким образом соединение ОШ с аспарагиновыми кислотами 85 и 212 разорвано. Арг-82 повернут в направлении ВК пространства и приближается к двум глютаминовым кислотам 194 и 204. Этот эффект, видимо, имеет электростатическую природу, поскольку Асп-82 заряжен положительно и таким образом реагирует на перераспределение зарядов в активном центре. Перемещение положительного заряда в направлении ВК пространства может, служить причиной высвобождения протона с ВК поверхности BR во время формирования М состояния. изменения при переходе М[— М2 затрагивают ЦП часть протонного канала и состоят в сдвиге центральной части спирали F на 0.8 А в ЦП направлении и изгибе ее ЦП части наружу с максимальной амплитудой 1.3 А [7]. Также изменения затрагивают спираль G (рис.1.10). В результате структурных изменений в ВК канале образуются полости, временно заполняемые молекулами воды. Кристаллографические структуры зафиксировали появление трех и более дополнительных молекул воды. Предполагается, что, именно благодаря структурным изменениям, в М2 состоянии образуется связь ШО с ВК пространством посредством молекул воды осуществляющих перенос протона между Асп-96 и ШО при переходе в N состояние.
Кристаллографическая структура О состояния отсутствует. В работе [65] предлагается использовать структуру основного состояния мутанта Асп85Сер в качестве модели О состояния, поскольку один из зарядов активного центра (Асп-85") при этом нейтрализован. Однако третичная структура ВК части BR значительно возмущена в данном мутанте, тогда как из ИК спектроскопии следует, что значительных изменений в структуре полипептидной цепи в О состоянии нет [47]. Следовательно структура данного мутанта не отражает действительных изменений, сопровождающих формирование О состояния. 1.2.5. Модели транспорта протона
Для рационального объяснения транспорта протона ретиналевыми белками при большом разнообразии условий были предложены две модели. В обеих центральную роль в транспорте протона играет ШО ретиналя.
В первой, 1ST модели [66] фотоцикл представляется в виде последовательности ключевых событий, состоящих из изомеризации (I для фото- и I для термической), переключения доступа ШО между ЦП и ВК каналами (S) и переноса иона (Т). Первым событием является фотоизомеризация. Переключение ШО (S) вызывается изомеризацией, однако не обязательно совпадает с ней, тогда как перенос иона определяется доступностью донора/акцептора. Основной принцип модели состоит в том, что переключение и транспорт протона - кинетически независимые события. Следствием этого предположения является то, что направление транспорта иона определяется соотношением между временными константами каждого из событий.
Во второй модели - модели локального доступа [67], предполагается, что в изомеризованном состоянии (13-цис, 15-анти) доступ ШО колеблется между СР и ВК каналами. При этом направление переноса протона определяется сродством донора/акцептора в каждом из каналов к ШО. В то же время сродство, выраженное например в рКд, зависит от зарядового состояния остальных групп и меняется при переносе протона с одной на другую группу. Таким образом, в данной модели, в отличие от 1ST модели, каждый последующий шаг переноса заряда определяется предыдущим.
Дифракция нейтронов и определение симметрии и постоянной решетки кубической фазы
Для измерения кинетики фотоцикла кристаллов с помощью видимой спектроскопии использовался аппарат импульсного фотолиза (рис.2.8.а).
В данной конфигурации для монохроматизации белого света ксеноновой лампы использовались интерференционные фильтры (Jenaer Glaswerk Schott & Gen, Mainz, Германия) с шириной пропускания 10 нм. Фотореакция возбуждалась с помощью второй гармоники Nd:YAG лазера с модулятором добротности1 (Spectra-Physics GCR12).
Для ослабления интенсивности рассеянного лазерного света на детекторе использовался голографический узкополосный режекторный фильтр1, помещенный между образцом и детектором. Прошедший через образец свет детектировался фотоумножителем и после усиления сигнала оцифровывался с помощью осциллографа2, синхронизованного с лазером. Контроль над экспериментом осуществлялся с помощью GPIB интерфейса и программы написанной на Lab View 7.0 (National Instruments Corp., Austin, TX, США).
Система детектирование света состояла из фотоумножителя R3788 (185-700 нм, Hamamatsu, Япония), в качестве источника и распределителя высокого напряжения для которого использовался модуль С6270 (Hamamatsu) с линейным диапазоном 0-140 мкА. Выходной сигнал фотоумножителя преобразовывался в напряжение и предусиливался модулем М8879 (Hamamatsu)3. Далее сигнал усиливался 20 кратно операционным усилителем LT1028 (Linear Technology). Выходной сигнал разделялся на два канала: один соединялся с осциллографом напрямую, другой после прохождения через пассивный высокочастотный фильтр4. Линейность системы детектирования была проверена посредством сравнения спектров поглощения BR, полученных с помощью ПЗС камеры и данного детектора. Временной ответ системы не превышал 1 мкс, однако из-за неполного подавления рассеянного лазерного излучения детектор "ослеплялся" на несколько микросекунд лазерной вспышкой, поэтому практическое разрешение установки составляло 10 мкс.
Измерение данных и первичная обработка. Для каждой длины волны зависимость выходного напряжения измерялась в двух перекрывающихся временных окнах: 10 мкс-4 мс и 0.1/1 мс - 0.8/8 с. После этого данные объединялись и усреднялись с 16000 точек линейно распределенных вдоль оси времени до 200 линейно распределенных на логарифмической временной шкале с помощью процедур написанных на MatLab 6.0 (The Math Work Inc., США). Количество усреднений для первого временного интервала составляло 1024 или 521, для второго - 512 или 256. Частота вспышек лазера варьировалась от 2 до 0.1 Гц. Время измерения на одной длине волны составляло от -15 мин до 2 ч. Зависимость изменения поглощения от времени рассчитывалась как : - зависимость выходного напряжения системы детектирования от времени и V() - значение напряжения в самой поздней измеренной временной точке, в которой образец находился в исходном состоянии.
Приготовление образцов. Измерения ъ видимом диапазоне выполнялись в горизонтальных стеклянных кюветах , на дно которых помещался образец, и покрывался раствором буфера. Белковые кристаллы фиксировались на дне кюветы с помощью нерастворенных остатков кубической фазы, окружающих кристалл. При использовании белков в липидных мембранах образец готовился в виде пленки, получаемой высушиванием раствора белка на дне кюветы. Толщина пленки подбиралась так, чтобы оптическая плотность в максимуме поглощения хромофора составляла 1. 2.11.2. Спектроскопия в И К диапазоне
Для измерения инфракрасных спектров подвижные зеркала микроскопа перемещались в положение, позволяющее инфракрасному излучению от ИК спектрометра попадать в микроскоп и фокусироваться на образце (рис.2.8.б). Прошедшее через образец излучение фокусировалось на Mg-Cde детекторе, сигнал с которого после предусиления направлялся в спектрометр.
Стационарные измерения разностных ПК спектров выполнялись с разрешением 4 см"1. Эксперименты с временным разрешением методом пошагового сканирования выполнялись с разрешением 4.5 см"1. Фотореакция инициировалась Nd:YAG лазером (п.2.11.1) с частотой 5.9 и 4.0 Гц для ПМ и кристаллов BR, соответственно. При каждом положении зеркала данные регистрировались в 942 временных точках равномерно распределенных в логарифмическом масштабе вдоль временной оси между 7 мке и 160 мс. Последовательность импульсов, синхронизующих регистрацию точек, генерировалась программируемым генератором сигналов (Wavetek model39) [130]. Для уменьшения количества точек интерферограммы использовался широкополосный интерференционный фильтр (OCLI2), ограничивающий спектральный диапазон от 1900 до 1000 см"1. При данных условиях измерения выполнялись для 844 положений подвижного зеркала интерферометра. От 5 до 10 циклов фотореакции усреднялось для каждого положения зеркала. От 10 до 25 таких измерений выполнялось для одного кристалла BR. В конечном итоге были усреднены данные, собранные с двух кристаллов.
Приготовление образцов. Для измерений при температурах выше 0С кристалл помещался в 10 мкл буфера между двумя стеклами из BaF2. Стекла сдавливались до минимально допустимого зазора, при котором кристалл не разрушается. Образцы мембранных белков в липидах готовились в виде тонких пленок помещенных между стеклами из BaF2. Для измерений при низких температурах кристалл помещался в нейлоновую криопетлю, замораживался и его температура контролировалась с помощью азотной криоструи. 2.12. Определение кинетики фотоцикла; выбор модели и обработка данных
Выбор модели. Спектроскопия с временным разрешением является фактически единственным методом, позволяющим исследовать фотоцикл при физиологических условиях. В наиболее общем случае задача решения кинетики фотоцикла имеет целью определение следующих параметров: - количество промежуточных состояний; - временные константы переходов между состояниями; - спектров промежуточных состояний. Подходы к решению данной проблемы можно разбить на два основных класса. К первому относятся методы, использующие факторный анализ [131], ко второму -методы, использующие глобальную экспоненциальную аппроксимацию данных. Преимуществом первого подхода является минимальное количество начальных условий, требующихся для определения спектров состояний и их временных зависимостей. Однако, полученный результат чувствителен к накладываемым условиям, и полученные временные зависимости концентраций промежуточных состояний трудно интерпретировать, используя простую модель фотоцикла [132; 133]. Данный подход наиболее продуктивен на первичном этапе анализа спектроскопических данных, особенно в случае белков с неизвестным фотоциклом, и полученные с его помощью данные могут служить хорошим приближением для более детального анализа.
Поведение кристаллизационной системы при изменении соотношения раствор/липид
Данные кристаллы часто имели слоистую структуру, были неустойчивы при отделении от кубической фазы и не дифрагировали до высокого разрешения. Кристаллы, полученные в MB и МО, представляют гексагональные пластинки, толщина которых обычно значительно меньше их размеров в плоскости шестиугольника (рис.3.8.в,г). Эти кристаллы имеют пространственную группу симметрии Рбзи параметры элементарной ячейки: «==61 А, с=109 А, ос=Р=90с, у=120. При остальных эквивалентных условиях кристаллизации скорость роста кристаллов в MB значительно больше, чем в МО. Кроме этого, в MB кристаллы вырастают больших размеров (до 250 мкм), но их толщина не превышает 5-10 мкм, что в 3-4 раза меньше, толщины кристаллов, выращенных в МО, размер которых при данных условиях не превышал 100 мкм при толщине до 30 мкм. Тонкость кристаллов свидетельствует о слабости межслойного взаимодействия вдоль кристаллографической оси с (рис. 1.15), и как правило, такие кристаллы имеют высокую мозаичность вдоль данного направления. Кристаллы, полученные в МО, давали наилучшую дифракцию, поэтому для дальнейшей оптимизации условий был выбран МО. 3.5. Влияние октилглюкозида
Изначально считалось, что детергент не оказывает существенного влияния на результат кристаллизации [143], однако позднее было замечено, что в некоторых случаях добавление раствора ОГ к кристаллизационной пробе улучшает результат кристаллизации [62; 144]. Также результаты кристаллизационных экспериментов, рассмотренных в п.3.2, указывают на существенную роль детергента в кристаллизационном процессе. С целью исследования роли детергента были проведены кристаллизационные эксперименты, в которых все параметры, кроме концентрации детергента и соли, были фиксированы.
Эксперименты были проведены для соотношений МО/(раствор белка) 1:1.5 и 1:2 (w/v). Результаты двух независимых экспериментов представлены на рис.3.9 в виде контурной карты зависимости среднего размера кристаллов в пробе от концентрации ОГ в растворе белка и конечной концентрации соли в пробе. Представленные результаты свидетельствуют о том, что размер кристаллов существенно зависит от концентрации ОГ. Кристаллы наибольших размеров 250-350 мкм были получены при концентрации ОГ от 10 до 16% и концентрации соли от 0.9 до 1.1 М. При этих условиях кристаллы растут в течение трех месяцев. Стоит отметить, что пробы, приготовленные с концентрацией ОГ 18% и более, были как правило мене прозрачными, что, свидетельствует о присутствии существенных количеств ламеллярной фазы.
Рост гексагональных кристаллов симметрии Р63 наблюдался в диапазоне рН между 5.1 и 6.5. Кристаллы наибольших размером росли при рН между 5.5 и 6.0, поэтому в большинстве экспериментов в качестве осадителя использовалась сухая фосфатная соль, насыщенный раствор которой имеет рН 5.6.
При соотношении МО/(раствор белка) 1:4 (w/v), концентрации ОГ -10% и рН 6.5 были получены игольчатые кристаллы BR (рис.3.8.е). Кристаллы данного типа дифрагировали до разрешения 2.6 А и предположительно имеют симметрию С2 с параметрами решетки а=85, =51, с=54А.
При кристаллизации также варьировалась концентрация белка между 7 и 22 мг/мл. При этом оптимальным условиям роста соответствовала концентрация от 12 до 15 мг/мл. При более низких концентрациях размер кристаллов не превышал 100-150 мкм, тогда как при концентрациях -20 мг/мл, размер кристаллов достигал 200-300 мкм, однако толщина кристаллов не превышала 5-10 мкм.
Исследование кубической фазы при помощи дифракции нейтронов показало, что кристаллизация BR происходит в кубической фазе МО симметрии РпЗт. В данных экспериментах присутствие отличных липидных мезофаз в кристаллизационных пробах зафиксировано не было, таким образом, данное наблюдение противоречит ранее высказанному предположению о необходимости дестабилизации кубической фазы в направлении ламеллярной фазы для кристаллизации белка [145]. Более того, описанное в пп.3,2-3.3 поведение кубической фазы согласуется с данными, полученными при изучении фазового поведения идентичной липидной системы без белка (МО/ОГ/вода/соль) [98]. Причем, в данном случае результаты свидетельствуют о том, что добавление соли стабилизирует липидную кубическую фазу. Однако, появление и рост белковых кристаллов может сопровождаться локальным возмущением кубической и появлением ламеллярной фазы вокруг растущего кристалла, как было отмечено в работе [145]. Такие микроскопические количества иной фазы были вне пределов чувствительности нейтронных экспериментов.
Повышение концентрации детергента в растворе белка от 2 до 12-16% позволило увеличить размер кристаллов от 70 до 350 мкм. Присутствие ОГ в кубической фазе МО модулирует свойства кубической фазы. С одной стороны, увеличение концентрации детергента в данном интервале приводит к увеличению постоянной решетки кубической фазы от 100 до 160 А (табл.3.1, 3.3). В результате средняя кривизна бислоя кубической фазы уменьшается, что приводит к уменьшению упругой энергии локальной деформации бислоя кубической фазы, вызванной присутствием белка [102]. Следствием этого является более свободная диффузия белка вдоль бислоя кубической фазы. С другой стороны, встраивание ОГ в кубическую фазу МО приводит к уменьшению толщины гидрофобной составляющей липидного бислоя, поскольку эффективная длина алифатической цепи МО составляет 17.3 А [109], тогда как для ОГ она не превышает 12.3 А. Данный эффект приводит к уменьшению гидрофобной составляющей свободной энергии ассоциации молекул BR в кристалл. Данная энергия возникает, как результат несоответствия толщины гидрофобных областей липидного бислоя кубической фазы (34 А) и белка (-30 А, [22]), следовательно, добавление ОГ уменьшает данное несоответствие. В результате, скорость роста и плотность зародышеобразования кристаллов уменьшается, тогда как размер кристаллов увеличивается. Данные результаты указывают на то, что свободная энергия, возникающая в результате взаимодействия белка с липидпой фазой, вносит существенный вклад в энергетику процесса кристаллизации и может непрерывно модулироваться посредством изменения концентрации детергента в кристаллизационных экспериментах.
Интересно отметить, что при больших концентрациях ОГ (30%) наблюдался рост ромбических кристаллов (рис.3.8.е). Похожие кристаллы были получены при кристаллизации в кубической фазе МП (рис.3.8.а), эффективная длина алифатической цепочки которого составляет ( 16 А [146]), отсюда можно предположить, что симметрия кристаллов определяется толщиной бислоя кубической фазы, из которой происходит кристаллизация. 3.8. Двойникование и скорость роста кристаллов Кристаллам BR, полученным в кубической фазе МО свойственно
Кристаллографические структуры К и М состояний комплекса SRII
Кристаллы BR, обладающие мероэдрическим двойникованием, были расщеплены вдоль плоскости гексагона на части примерно одинаковой толщины, причем в тех случаях, когда эти части давали дифракцию, их фактор двойникования был равен нулю. Этот результат является прямым доказательством того, что двойниковые кристаллы состоят из макроскопических доменов, представляющих из себя гексагональные пластинки, размеры которых в плоскости шестиугольника совпадают с размерами всего кристалла и толщина которых сравнима с толщиной кристалла. Для одного кристалла было прямо продемонстрировано, что он состоит всего из двух доменов. Во всех случаях, когда отщепленные части давали дифракцию, они не имели двойникования, следовательно, можно предположить, что кристаллы расщепляются вдоль границы контакта двойниковых доменов. Основываясь на этом предположении можно заключить, что большинство кристаллов BR состоит из двух двойниковых доменов, однако расщепление на три и большее количество частей указывает на то, что некоторые кристаллы могут состоять из большего количества доменов. При этом, размер доменов всегда сравним с размером двойникового кристалла.
Гексагональная плоскость кристаллов BR перпендикулярна кристаллографической оси с, следовательно рост кристалла вдоль этого направления происходит с большой вероятностью посредством образования двумерных зародышей на поверхности аЬ плоскости [88]. Это предположение также согласуется с моделью роста кристаллов в кубической фазе, предложенной М. Каффри [146] и подтверждается данными атомно-силовой микроскопии [103]. Плоскость контакта двойниковых доменов перпендикулярна оси с, следовательно, они должны возникать также посредством образования двумерных зародышей на поверхности ab плоскости кристалла.
Поверхность раздела двойниковых доменов может быть образована либо посредством контакта цитоплазматических (ЦП) поверхностей BR либо - внеклеточных (ВК) (рис. 1.15). Фактор двойникования большинства кристаллов BR превышает 30%, и большинство кристаллов состоит из двух двойниковых доменов. Эта особенность кристаллов может быть объяснена различием энергий взаимодействия ЦП и ВК поверхностей BR. ВК поверхность BR практически нейтральна, в то время как ЦП поверхность заряжена отрицательно (рис.3.15), Взаимодействие между двумерными слоями BR в кристалле достаточно слабое: из кристаллографических структур следует, что контакт между слоями осуществляется посредством Ван-дер-Ваальсова взаимодействия всего двух аминокислотных остатков на молекулу BR [54]. Следовательно, даже слабое электростатическое отталкивание двумерно-кристаллических ЦП поверхностей может вносить существенный вклад в общую энергию взаимодействия слоев.
Первый двойниковый домен появляется вскоре после образования зародеша или даже в процессе зародышеобразования. Причем двойниковые домены взаимодействуют ВК поверхностями. У получающегося двойникового кристалла внешние гексагональные поверхности - ЦП поверхности (рис. 1.15). Вероятность образования двойников на ЦП поверхности существенно меньше, из-за электростатического отталкивания. Следовательно, с высокой вероятностью кристалл продолжает расти без образования новых двойниковых доменов. Кроме того, поскольку вероятность возникновения двойникования уменьшается при замедлении скорости роста кристаллов, можно заключить, что энергия взаимодействия поверхностей двойниковых доменов меньше энергии взаимодействия двумерно-кристаллических слоев внутри кристалла. 3.11. Основные результаты и выводы
Использование дифракции нейтронов для исследования эволюции кубической фазы в процессе кристаллизации BR позволило получить важную информацию о свойствах липидной составляющей кристаллизационной системы: а. Кристаллизация происходит в кубической фазе симметрии РпЗгл. Данная симметрия сохраняется в течение всего процесса кристаллизации, которая не сопровождается появлением макроскопических количеств других липидных мезофаз.
Для получения структуры промежуточного состояния фотоцикла белка с помощью рентгеноструктурного анализа, кроме кристаллов белка, необходимо найти способ фиксирования исследуемого состояния в кристалле. Одним из важных условий для успешного решения структуры промежуточного состояния является его высокая населенность (занятость) в кристалле во время накопления дифракционных данных, а также отсутствие примесей иных, кроме основного, состояний. С другой стороны, поскольку окружение молекулы белка в кристалле значительно отличается от естественного, необходима как можно более точная и полная характеристика промежуточных состояний в кристалле. Для этого должны использоваться методы исследования, которые можно применить к белку как в естественном окружении, так и в кристалле, причем желательно, чтобы они давали возможность судить о структурных изменениях и функциональности в естественном окружении и в кристалле [147]. В случае светочувствительных белков, наиболее подходящими методами являются спектроскопия в видимом и инфракрасном диапазонах. В то время как спектры поглощения в видимом диапазоне позволяют определить состав и концентрации промежуточных состояний, разностная инфракрасная спектроскопия позволяет провести детальное сравнение структурных изменений, сопровождающих промежуточные состояния.
Спектр поглощения BR в видимом диапазоне является очень чувствительным к непосредственному окружению белка. Максимум поглощения BR отражает липидное окружение белка: сдвигается при солюбилизации или делипидизации [113;148]; распределение зарядов вокруг и на ретинале: смещается при депротонировании ШО или изменении заряда проти вой она [149]; а также чувствителен к количеству молекул воды вокруг и внутри BR [150], Было показано, что спектр поглощения кристаллов BR, находящихся в кубической фазе, имеет особенности, соответствующие частичной дегидратации молекул BR [151].
На рис.4.1 показаны спектры светоадаптированного BR в ПМ и кристалле, измеренные при одинаковых условиях: рН, концентрации соли и температуре. Во время измерений как кристалл, так и пленка ПМ были погружены в буфер, таким образом, гидратация образцов была одинакова. Максимум поглощения обоих спектров находится на 567 нм и при больших длинах волн спектры идентичны. При более коротких длинах волн оптическая плотность кристалла выше чем ПМ, однако разностный спектр (рис.4.1.6) имеет монотонную зависимость от длины волны. Следовательно, данное расхождение вызвано рассеянием света, причинами которого, по-видимому, являются остатки кубической фазы на поверхности кристалла. Таким образом, можно заключить, что спектры BR в ПМ и кристалле одинаковы при условиях, используемых для кристаллографии, что согласуется с данными полученными при криотемпературах [152]. В темноте ретиналь BR находится в двух конформациях: полностью-транс, 15-анти и 13-цис, 15-син. Равновесные концентрации изомеров примерно одинаковы (темноадаптированный BR). По действием света равновесие сдвигается таким образом, что практически все молекулы ретиналя имеют полностью-транс, 15-анти конформацию (светоадаптированный BR) [153]. Однако, в некоторых мутантах полная светоадаптация невозможна [154; 155]. Явление адаптации к свету и темноте имеет особое значение для рентгеновской кристаллографии, поскольку в случае неполной светоадаптации два различных конформера сосуществуют в кристалле, что должно приниматься во внимание во время обработки данных, особенно, когда целью является получение структуры промежуточного состояния.
