Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Современные представления о строении и механизме действия Са2+-АТФазы СР 10
2. Исследование Са2+-АТФазы СР методом люминесценции. 12
3. Исследование-структуры Са -АТФазы методом спиновых зондов 23
ГЛАВА II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1. Основные реактивы 29
2. Выделение СР 30
3. Получение Са2+-АТФазы 31
4. Определение АТФазной активности 31
5. Исследование кинетики затухания фосфоресценции эритрозина и эозина 32
6. Определение степени гидрофобности нитроксильных радикалов 33
7. Исследование собственной фосфоресценции СР 34-
8. Измерение флуоресценции триптофановых остатков СР и Са2+-АТФазы 34
9. Регистрация спектров поглощения исследуемых препаратов 35
10. Исследование действия биологически-активных соединений на мембрану СР и Са2+-АТФазу методом ЭПР 35
11. Метод химической модификации триптофановых остатков с помощью N -бромсукцинимида 36
12. Определение тиоловых групп СР и Са2+-АТФазы методом Эллмана-Бенеша 36
ГЛАВА III. ИЗУЧЕНИЕ СТРОЕНИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИ-АКТИВНОГО
ЦЕНТРА Са2+-АТФазы МЕТОДОМ ТРИПЛЕТНЫХ ЗОНДОВ
1. О методе фосфоресценции 37
2. О методе триплетних зондов 38
3. Определение локализации каталитически-активного центра Са2+-АТФазы относительно мембраны СР 39
4. Определение взаимного расположения мест связывания АТФ, MCL , Са2+ в каталитически-активном центре Са2*-АТФазы СР 46
ГЛАВА ІV. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ ТРИПТОФАНОВЫХ ОСТАТКОВ В МЕМБРАНЕ СР И Са2+-АТФазе
1. Определение вклада отдельных триптофановых остатков Са -АТФазы в собственную флуоресценцию СР .55
2. Исследование локализации триптофановых остатков в районе активного центра Са-АТФазы СР 62
3. Исследование взаимного расположения триптофановых остатков Са2+-АТФазы и мест связывания ионов Са2+ методом флуоресценции 66
4. Участие триптофановых остатков Са-АТФазы СР в механизме активного транспорта Са^т 71
5. Определение взаимного расположения триптофановых остатков и мест связывания ионов Са2+ и McL в
Са2+-АТФазе СР 73
6. Исследование взаимодействия АТФ с Са2+-АТФазой СР по изменению параметров фосфоресценции триптофановых остатков фермента .80
ГЛАВА V ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ МЕХАНИЗМА
ДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА МЕМБРАНУ СР И Са2+-АТФазу
1. Исследование механизма действия неорганических соединений платины и палладия на везикулы СР 87
2. Изучение механизма взаимодействия комплексов платина-альбумин и палладий-альбумин с Са -АТФа-зой СР 93
3. Исследование механизма действия 5-сульфо-8-меркап-тохинолиновых производных платины и палладия на препараты Са2+-АТФазы СР 102
4. Изучение механизма действия на мембраны СР психотропных соединений 107
5. Исследование влияния соединений Ве2+ на мембраны
СР 109
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 114
ВЫВОДЫ 118
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА 121
- Современные представления о строении и механизме действия Са2+-АТФазы СР
- Основные реактивы
- О методе фосфоресценции
- Определение вклада отдельных триптофановых остатков Са -АТФазы в собственную флуоресценцию СР
- Исследование механизма действия неорганических соединений платины и палладия на везикулы СР
Введение к работе
Транспортные АТФазы играют существенную роль в организме. Их функция заключается в осуществлении активного транспорта ионов и протонов через мембраны против градиента концентрации за счет химической энергии АТФ. Транспортные АТФазы обеспечивают протекание таких важных биологических процессов, как проведение нервного импульса, запасание информации в нервной клетке, сокращение мышц, стимуляция процессов биосинтеза и т.д. В силу этих причин в последнее время возрос интерес к изучению транспортных АТФаз - их строения, молекулярной организации и механизма их действия. Однако на пути биофизических исследований этих ферментов встречается ряд трудностей, в частности, транспортные АТФазы представляют собой белковые компоненты, функционирующие лишь в составе мембран. Это условие затрудняет получение их в кристаллической форме и применение для изучения этих ферментов наиболее информативного физического метода рентгеноструктурного анализа. Использование других физических методов ( ЯМР, ЭПР, оптической спектроскопии) часто бывает весьма ограничено в силу сложности строения изучаемых объектов и малых концентраций получаемых препаратов.
В связи с этим при исследовании молекулярной структуры и принципов действия мембранных ферментов возникает потребность в разработке и применении новых физических методов и подходов, позволяющих получать необходимую информацию.
Объектом исследования настоящей работы является транспортная Са -АТФаза СР.Изучение строения и механизма действия Са^+-АТФазы представляет большой научный интерес по целому ряду причин. Во-первых, этот фермент выполняет одну из важнейших функций в организме: поддерживает низкий уровень внутриклеточного - 7 -Са2+(~ПГ7 М) за счет активного переноса Са2+ через мембрану при высоком уровне этого иона в окружающей среде (3»1СГ3 М). Это обеспечивает осуществление мышечной подвижности, стимуляцию процессов биосинтеза, проведение нервного импульса и ряд других биологических процессов /6/. Во-вторых, Са2+-АТФаза представляет собой самую простую систему биоэнергетического сопряжения: с помощью этого фермента, состоящего из одной полипип-тидной цепи, химическая энергия АТФ превращается в энергию осмотической работы по переносу ионов Са2+ из области меньшей в область большей концентрации. В-третьих, Са-АТФаза представляет собой пример мембранного фермента, изучение которого полезно для понимания общих закономерностей функционирования транспортных АТФаз и других мембраносвязанных белков,
К настоящему моменту сформулирована принципиальная схема химических процессов, происходящих в мембране СР с участием
Са-АТФазы; зарегистрировано взаимодействие с ферментом ионов ?. КА 2+ Саст и Ий , участвующих в ферментативном процессе. По результатам исследований составлена блок-схема работы фермента /10,18/. Однако конкретные данные о пространственной организации функционально важных активных групп, о пространственном расположении каталитически-активного центра, о расположении отдельных аминокислот, об участии их в каталитической реакции Са-АТФазы, в активном транспорте Са2+ получить с помощью традиционных методов флуоресценции и ЭПР до настоящего времени не удавалось,
В связи с этим в настоящей работе развивается оригинальный метод исследования биологических систем - метод фосфоресценции. До последнего времени явление собственной фосфоресценции белков при изучении биологических объектов применялось довольно ограниченно. В имеющихся работах исследовались такие параметры собст- - 8 -венной фосфоресценции биологических объектов, как форма и амплитуда спектров в зависимости от изучаемого объекта и условий эксперимента /7,8/, Однако эти исследования носили в основном качественный характер, в то же время такие параметры фосфоресценции, как времена жизни, изменяющиеся в диапазоне К**" - 1Сг б, скорость тушения триплетного возбужденного состояния позволяют существенно расширить информативность метода при изучении биологических систем»
Задачи исследования настоящей работы:
I* Развитие оригинального метода триплетных зондов применительно к исследованию локализации каталитически-активного центра Са2+-АТФазы относительно липидной матрицы мембраны и мест связывания функционально-важных ионов Ма и Са2+.
2. Изучение пространственного расположения триптофановых ?+ IUI 2+ остатков Сас -АТФазы СР относительно центров связывания пй и Са2+ на основании анализа кинетики тушения собственной фосфоресценции белка парамагнитными ионами и исследование дезактивации возбужденного синглетного состояния триптофановых остатков белка ионами редкоземельных элементов.
Исследование изменения конформации Са2+-АТФазы в момент образования фермент-субстратного комплекса по изменению параметров собственной фосфоресценции фермента.
Разработка методики определения квантового выхода флуоресценции отдельных триптофановых остатков мембраносвязанных ферментов на примере Са^ -АТФазы СР.
Выяснение механизма действия физиологически-активных соединений на мембрану СР с помощью физических методов люминесценции и ЭПР.
Предлагаемая диссертационная работа состоит из пяти глав. _
Первая глава посвящена анализу современных сведений о строении и механизме действия Са-АТФазы, полученных физическими методами люминесценции и ЭПР.
Во второй главе приводится описание методик, применяемых для решения поставленных задач,
В третьей главе с помощью триплетных зондов определяется локализация каталитически-активного центра Са -АТФазы относительно липидного бислоя мембраны СР и расположение центров связывания Са2+ и Ма относительно АТФ.
Четвертая глава посвящена определению квантового выхода флуоресценции и пространственного расположения триптофановых остатков Са -АТФазы, их участия в формировании активного цент-ра фермента и Саст-транспортирующего канала. Эта задача решалась с помощью комбинации методов люминесценции, спектрофотометрии и химической модификации триптофановых остатков.
В пятой главе определяется механизм действия четырех групп важных биологически-активных соединений на мембрану СР и Са -АТФазу.
На основании полученных данных предлагается структурная модель Са*1,-АТФазы и анализируется изменение конформации фермента в момент образования фермент-субстратного комплекса. Исходя из данных о структуре фермента, полученных в диссертации, установлен механизм действия биологически-активных соединений на мембрану СР и Са2+-АТФазу.
Выполнение диссертационной работы проводилось в Отделении Института химической физики АН СССР, Черноголовка, в лаборатории кинетики ферментативного катализа.
Современные представления о строении и механизме действия Са2+-АТФазы СР
Транспортная Са -АТФаза СР (К.Ф.3.6.1.3) является основным белком мембраны СР, осуществляющим активный транспорт ионов Са2+ против градиента концентрации. В настоящее время установлено, что Са -АТФаза представляет собой мембранный интегральный белок, состоящий из одной полипелтидной цепи с молекулярной массой 115 000 /51/. Две трети объема этого белка находятся в водной фазе и около одной трети локализовано в гидрофобной зоне мембраны. На долю аминокислот, расположенных в гидрофобной фазе мембраны, приходится 18 из 19 триптофановых остатков, включенных в полипептидную цепь белка. Функциональная активность фермента Сас -АТФазы проявляется лишь в составе мембран, при этом в мембране СР содержание липидов составляет 0,5 мг на I мг белка /77/.
Было показано, что ионы Са2+ активируют реакцию гидролиза АТФ, при этом в результате гидролиза одной молекулы АТФ осуществляется транспорт двух ионов Са2+ /б/.
Связывание АТФ с ферментом происходит в составе комплекса М2+ М 2+ м2+ с ионами Па или ГІН (заменяющими ТО) /ЮЗ/, причем, связывание комплекса МсиИТФ происходит независимо от Са . Это означает, что существуют два центра связывания для На и для Са т. Неизвестно, на каком расстоянии эти центры расположены относительно друг друга, хотя ясно, что они взаимодействуют между собой, так как связывание Са2 "запускает" гидролиз АТФ /10/.
Спиновые зонды являются удобным инструментом для изучения липидной матрицы везикул СР. Активность многих мембранных фермен-тов, включая Gar-АТФазу, резко зависит от микровязкости и химической природы липидов /18/. Используя зонды и метки различной природы, локализующиеся в белковой матрице, в гидрофобном слое мембраны вблизи белковой поверхности или свободно диффундирующие в мембране, и зная температурные зависимости их частот корреляции, можно установить количественную связь между ферментативной активностью белка и физическим состоянием липидов мембраны. Совокупность данных, изложенных в работах /26,18/, позволяет заключить, что в области физиологических температур (18-37) изменения кинетических параметров ферментативной активности коррелируют с изменением подвижности лишь поверхностных, связанных с белком липидов, а не свободных липидов мембраны СР. Связь кинетических параметров с микровязкостью липидного окружения также указывает на возможность конформационных перестроек в процессе каталитического акта.
До последнего времени существовало две гипотезы о механиз-не функционирования Са -АТФазы СР. Согласно первой, акт пере-носа ионов Са2+ через мембрану осуществляется благодаря вращательному движению макромолекулы белка в мембране. Гипотеза предполагает симметричное расположение белка относительно внешней и внутренней поверхности мембраны
О методе фосфоресценции
Как уже отмечалось в гл. I, традиционные физические методы - флуоресцентных и спиновых зондов позволяют изучать процессы в диапазоне времен ІО -10 с, соизмеримых со временами жизни возбужденных синглетных состояний хромофоров или спин-решеточной релаксации нитроксильных радикалов Б растворе.
Малые молекулы (тушители) за такие времена диффундируют в вязких средах типа липидных мембран на расстояния 15-30 $ /9/. Следовательно, среднее расстояние между взаимодействующими молекулами не должно превышать эти значения, а величина их локаль-ных концентраций должна составлять 10 -10 х М. Столь высокие концентрации веществ, вводимых извне в исследуемый объект, могут существенно искажать и даже нарушать его нативную структуру.
Эти ограничения могут быть устранены благодаря использованию явления фосфоресценции. Времена жизни возбужденных триплет-ных состояний фосфоресцирующих хромофоров изменяются в диапазоне 10 -І01 с. Известно, что чувствительность физических методов по отношению к исследованию процессов взаимодействия между молекулами пропорциональна характеристическому времени релаксационных процессов, свойственных используемым методам. В связи с этим применение явления фосфоресценции может на несколько порядков увеличить диапазон измеряемых параметров.
Определение вклада отдельных триптофановых остатков Са -АТФазы в собственную флуоресценцию СР
Настоящая глава посвящена исследованию триптофановых остатков Са2+-АТФазы по регистрации собственной флуоресценции и фосфоресценции белка. Предлагается методика определения квантового выхода флуоресценции отдельных триптофановых остатков белка с помощью комбинированного применения методов флуориметрии, спект-рофотометрии и химической модификации.
I. Определение вклада отдельных триптофановых остатков Са -АТФазы в собственную флуоресценцию СР
Алленом было показано, что Сас -АТФаза СР содержит 19 триптофановых остатков, из них 18 - в гидрофобной части белка и один - в гидрофильной /51/.
Известно, что СР обладает интенсивной собственной флуоресценцией при длине волны возбуждения 295 нм (рис.8).
Согласно работе /69/, основной вклад в собственную флуорес-ценцию СР вносят триптофановые остатки Сас -АТФазы,средний квантовый выход которых равен 0,3 (исходя из молекулярного веса препарата 115 000).
Добрецовым с соавторами было показано, что основная часть флуоресцирующих триптофановых остатков находится в гидрофобной области Са -АТФазы и контактирует с липидами /13/. Однако до настоящего времени не опубликовано никаких данных о роли триптофановых остатков в функционировании Са -АТФазы, участии их в формировании активного центра и вкладе отдельных триптофановых остатков в общую флуоресценцию белка.
class5 ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ МЕХАНИЗМА
ДЕЙСТВИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА МЕМБРАНУ СР И Са2+-АТФазу class5
Исследование механизма действия неорганических соединений платины и палладия на везикулы СР
Как известно, проблема отбора биологически-активных соединений для практического применения их в качестве лекарственных препаратов представляет довольно трудную задачу, которую можно решить двумя способами: первый, традиционный, исследование биологической активности соединений на экспериментальных животных. Это наиболее прямой метод, позволяющий максимально приблизить исследуемый объект к человеческому организму. Но в этом случае возникает ряд часто непреодолимых трудностей - "малая пропускная способность" в связи с ограниченностью количества животных, особенно высокоорганизованных, высокая стоимость, длительные сроки проявления эффекта, соображения гуманного характера и так далее. В связи с перечисленными факторами на экспериментальных животных возможно тестирование лишь небольшой доли вновь синтезированных химических соединений.
Существует и второй способ исследования действия этих соединений - выяснение биологического эффекта химических соединений на молекулярном уровне (ферментах, митохондриях, мембранах и т.д.). Данный способ позволяет достаточно быстро и с использованием значительно меньшего количества животных прогнозировать фармокологический эффект.
