Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Спектроскопия ЭПР ионов и комплексов марганца и роль марганца в фотосинтезе высших растений
1. Спектроскопия ЭПР ионов и комплексов марганца 8
2. Роль Мп в системе фотосинтетического разложения воды 15
3. Спектроскопические свойства марганца в системе фотосинтетического разложения воды 19
Глава 2. Материалы и методы.
1. Материалы и реактивы 24
2. Препаративные методы 24
3. Измерение активности хлоропластов 29
4. Характеристика препаратов 30
5. Радиоспектроскопические измерения марганца. Использование трицина 32
Глава 3. Исследование методом эпр мл - содержащих комплексов в некоторых видах высших растений.
1. Исследование спектроскопических характеристик сигнала ЭПР комплекса марганца 39
2. Локализация центров, ответственных за аномальный сигнал ЭПР марганца 52
3. Типы СТ расщеплений в синтетических комплексах... 62
Глава 4. Ингибирование и реконструкция кислородовццеляющей функции хлоропластов.
1. Введение 70
2. Подавление реакции Хилла холатом натрия. Влияние света и меркаптоэтанола 72
3. Анализ продуктов, солюбилизированных холатом натрия из хлоропластов 89
4. Характеристика белковой фракции, солюбилизованной холатом натрия 93
5. Экстракция марганца из хлоропластов. Характер связи его с белками 99
6. Реконструкция кислородвццеляющей функции в хлоропластах, экстрагированных холатом натрия 105
Выводы 111
Литература 115
- Спектроскопические свойства марганца в системе фотосинтетического разложения воды
- Радиоспектроскопические измерения марганца. Использование трицина
- Локализация центров, ответственных за аномальный сигнал ЭПР марганца
- Подавление реакции Хилла холатом натрия. Влияние света и меркаптоэтанола
Спектроскопические свойства марганца в системе фотосинтетического разложения воды
Марганец (П) в водных растворах, как уже рассматривалось в I, образует гексакомплексы с водой и дает при комнатной температуре спектр ЭПР с хорошо разрешенной СТС. Марганец в более окисленном состоянии обычно не дает сигнала ЭПР в нормальных фи- зиологических условиях наблюдения. При связывании марганца (П) с мембраной или макромолекулами происходит исчезновение сигнала ЭПР вследствии уширения сверхтонких компонент по причинам, приведенным в I. Соответственно, марганец, находящийся в функционально активном центре разложения воды сигнала ЭПР не дает [57,4б] . После обработок, инактивирующих систему разложения воды, марганец освобождается в раствор и появляется сигнал ЭПР аквокомплекеа марганца. Авторы работы [I09J полагают, что в комплексах марганца с макромолекулами, когда молекулярные движения заторможены, из пяти компонент тонкой структуры четыре не видны вследствие анизотропии ( I), и наблюдается компонента, соответствующая переходу М + 2 " " 2 Ри обработке хло-ропластов, освобождающей марганец, молекулярные движения небольших аквокомплексов марганца ускоряются, происходит усреднение анизотропии кристаллического поля и все пять компонент "собираются" в одну, при этом ее интенсивность увеличивается в 3,9 раза по сравнению с исходным сигналом. Авторы [і09 J полагают, что слабый шестикомпонентный сигнал марганца, наблюдаемый в интакт-ных хлоропластах, принадлежит функционально активному. Однако в работе Г24J показано, что интенсивность сигнала ЭПР марганца, освобожденного из хлоропластов кислотой (рН 4), возрастает значительно сильнее по сравнению с сигналом, наблюдаемым в интактньк хлоропластах, чем это следует из их расчетов. Вопрос о валентности функционально активного марганца дебатируется уже много лет.
Отсутствие сигнала ЭПР марганца, связанного с центром разложения воды некоторые авторы принимают, как указание на то, что марганец находится в этой системе в более окисленном состоянии. Опыты по реактивации хлоропластов после обработки 0,8 М трис проводят добавлением к ингибированньм хлоро- пластам свободных ионов Ми (П). При этом для встраивания марганца в систему разложения воды необходима, по крайней мере,одна короткая вспышка света [45 1. Некоторые авторы Гі25] связывают это с тем, что необходимо перевести марганец в более окисленное состояние. Предполагают, что валентность марганца может быть +3 или 44. На основании химической модели Шафирович и Шилов с соавторами ГI08J предложили механизм реакции разложения воды при участии ионов марганца с валентностью +5 и -Ї7.
Однако, последние данные, полученные с помощью метода 3XAFS /Extended Х-ray absorption fine str./ который регистрирует спектр поглощения рентгеновских лучей, возникающий при взаимодействии рентгеновского излучения с атомами металла и несет информацию как об этом атоме, так и о его окружении [79,80 ] , указывают на то, что марганец в системе, разлагающей воду имеет смешанную валентность +2 - +3. Работы Зауэра с соавтор, [і05] также предполагают, что в этой системе функционируют два иона марганца, которые в состоянии фермента S0 имеют валентность +2 и +2, затем участвуют в окислении воды, донируя электроны и принмая в промежуточных состояниях ( , О2 » v3 , У ) валентности +3 и н-4. В их опытах исследовали методом ЭПР количество марганца, освобождаемое из системы разложения воды в хлоропластах тепловым шоком, в импульсном режиме освещения хлоропластов. Была получена периодическая кривая, отражающая количество освобождаемого в раствор Ми (П) в зависимости от количества вспышек.
Радиоспектроскопические измерения марганца. Использование трицина
Спектры ЭПР регистрировали на спектрометрах Х-диапазона РЭ-1306, Вариан Е-4, Брукер - ЕР220ДЛР при комнатной температуре и при 77К. Измерения в Q-диапазоне проводили на приборе Вариан И-4506 при Ю0К.Ряд опытов выполнен с гелиевым термостатом . Спектры ЭПР при 77К регистрировали с использованием специального кварцевого сосуца Дьюара.
Опыты, в которых определяли концентрацию марганца в образцах, проводили с боковым стандартом. В качестве бокового стандарта использовали нитроксильный радикал 2,2,6,6-тетра-метил-4-оксипипери-дин-1-оксил. Измерения проводили при модуляции частотой 100 кГц и амплитудой 4 Гс, при ослаблении модности СВЧ-поля W 20 дБ (за исключением опытов, в которых условия регистрации сигналов оговариваются особо).
Измерение концентрации марганца в хлоропластах методом ЭПР проводили на препаратах, промытых ЭДТА, как указано в І. В приготовленных таким образом препаратах свободного марганца не было. Концентрацию связанного марганца определяли после добавления к суспензии хлоропластов НСІ до концентрации 0,5 М. При рН 4 весь марганец освобождается из тилакоидных мембран в среду и присутст-вует в растворе в виде свободных ионов Мп +. Если марганец освобождали из хлоропластов обработкой трис-буфером (к 0,6 мл хлоропластов добавляли 0,2 мл 3,2 М трис, рН 8), путем нагревания (57С, 5 мин), действием холата натрия, то после указанной обработки хло-ропласты отмывали от освободившегося марганца гипотоническим раствором Нерех-буфера с добавлением I мМ ЭДТА, центрифугировали 5 мин, 3000 J и ресуспендировали в Нере -буфере с 0,2 М сахарозой до концентрации хлорофилла 3 мг/мл. Концентрацию марганца, не освобожденного из хлоропластов после указанной обработки, определяли методом ЭПР после закислення среды до рН 2. Концентрацию марганца в белках определяли методом ЭПР после аналогичных процедур.
Использование метода ЭПР для количественного определения марганца в растворе возможно ввиду того, что концентрация марганца пропорциональна интегральной интенсивности спектральной линии, а в широком диапазоне концентраций (І»І0 М-Ю М) ширина и форма линии заметным образом не меняется, поэтому амплитуда первой производной линии поглощения является линейной функцией концентрации и может служить для ее измерения. На рис. 3 представлена зависимость амплитуды первой производной линии поглощения ЭПР от концентрации MnCIg в буфере (Hepes, 20 мМ). Точки на этой кривой получали после усреднения первых трех сверхтонких компонент (в низкопольной части спектра относительно J= 2,0). Кривая линейна от I до 100 мкМ MnCIg и экстраполируется в нуль при Мл + = 0. Ошибка измерения в количественном определении концентрации Ми + не более 10%.
Важно отметить, что для такого определения концентрации марганца существенно учитывать рН, при котором проводятся измерения, т.к. при подщелачивании до рН от 5 марганец гидролизуется. Гидроокись марганца нерастворима в воде и наблюдаемый сигнал ЭПР марганца уменьшается (см. рис. 4). Поэтому необходимо проводить корректировку рН модели и рН исследуемого раствора.
В части опытов для увеличения чувствительности использовали другой метод определения концентрации марганца. Спектры регистрировали не при комнатной температуре, а при 77К (в жидком азоте). Вследствие этого чувствительность возрастала приблизительно в 15 раз. Как известно, СТС спектра ЭПР марганца в воде в процессе замораживания раствора исчезает, т.к. имеет место выкристаллизация соли марганца. При исследовании содержания марганца в белках использовали комплексообразование марганца с трицином
Локализация центров, ответственных за аномальный сигнал ЭПР марганца
Выше уже упоминалось о характерном сигнале ЭПР комплексов Си-Мл с производным N-окиси пиридина. Из лигандов, которые можно рассматривать в качестве возможной модели биогенных комплексов марганца, следует назвать Н-группы, азот-содержащие группы, порфирины. Спектры ЭПР синтетических комплексов Мл (П) с этими группами известны [67] . Мы рассмотрели возможность моделирования комплекса марганца из растительного материала с помощью хелатного комплекса Мл 4" с этилксантогенатом, описанного в работе № . Комплекс марганца с этилксантогенатом сигнала ЭПР не дает, по-видимому, вследствие димеризации и образования диамагнитных агрегатов с антиферромагнитным взаимодействием между атомами марганца. Однако в присутствии \0, возникает спектр ЭПР. Газообразный N0, полученный разложением нитрита натрия кислотой, пропускали через толуоловый раствор этилксантогената и хлорида марганца. Полученный нами сигнал ЭПР комплекса подобен сигналу, зарегистрированному в работе [7J . Однако в нашем спектре можно наблюдать разрешение дополнительной СТС от ядер азота, видимо, вследствие того, что марганец вводился в виде безводного хлорида (рис. 20). Поскольку ядерный спин азота I = I, а компоненты СТС марганца дополнительно расщепляются на 5 линий, можно заключить, что комплекс обладает динитрозильной структурой в отличие от структуры, предложенной в [7 J . Таким образом, динитрозильный комплекс марганца с ксантогенатом выглядит следующим образом: Мы попытались заменить А/0 в этом комплексе на атом CI, имея в виду, что такая замена была достигнута под действием ультрафиолетового света в комплексах железа [9б] . Хлор вводили в систему в виде растворителя ССІ или в газообразном виде Clg. На протяжении этой процедуры раствор освещался ультрафиолетовым светом, что способствовало образованию атомарного хлора. В результате этих воздействий динитрозильный комплекс разрушался, спектр ЭПР постепенно деградировал с образованием обычного шестикомпонентного сигнала ЭПР марганца, однако зарегистрировать дополнительное расщепление СТС на ядре хлора нам не удалось. Другая попытка создать модель комплекса марганца с дополнительным расщеплением СТС на хлоре была предпринята на основе результатов, полученных в работе [I9J . В этой работе проведен синтез комплексов меди с двумя лигандами 0-бутил- N -метил-тиокарбо-натом (БМТК) и тетраэтилтиокарбаматом (ДТ ). Мы синтезировали такой комплекс из раствора хлорида меди и БМТК в толуоле. В растворе комплекс меди с БМТК сигнала ЭПР не дают в связи с сильным обменным взаимодействием между соседними атомами меди.
При введении в лигандную сферу меди ДТК образуются комплексы: Сигнал ЭПР раствора этих комплексов в толуоле представлен на рис. 21. Ядро меди имеет магнитный момент J = 3/2, мультиплет-ность 4, поэтому СТС состоит из 4 линий. Каждая СТО компонента дополнительно расщеплена на четыре в связи с взаимодействием не-спаренных электронов с ядром хлора. В некоторых отношениях, этот сигнал аналогичен исследуемому нами сигналу ЭПР "комплекса марганца", однако попытка создания аналогичного комплекса марганца с двумя лигандами ВяТЕС и ДТ и получить сигнал ЭПР с дополнительным расщеплением на ядре хлора не удалась. По-видимому, это связано с тем, что марганец образует менее устойчивые комплексы из-за больших размеров иона Mr» по сравнению с О і ионом Си и отсутствия стабилизации кристаллическим полем. Исходная функционально активная структура комплекса, разлагающего воду, по-видимому, содержит марганцевые кластеры, в которых эффективное спин-спиновое взаимодействие между ионами приводит к суммарному электронному спину, равному нулю в темноте и отличному от нуля на свету, когда валентные состояния магнитно взаимодействующих атомов марганца различны. В последнем случае должна наблюдаться сложная СТС, обусловленная расщеплением на дву$ ядрах марганца. Такого характера картину наблюдали недавно в синтетических биядерных комплексах марганца Купер и др.[47] . Спектр ЭПР бипиридильных комплексов марганца воспроизведенный нами, представлен на рис.22а. Обработка синтетического ког.шлекса . гидроксиламином вызывает восстановление марганца, что приводит к деградации спектра ЭПР в обычный шестикомпонентный сигнал (рис. 226). Добавление гидроксиламина к хлоропластам вызывает аналогин-ные эффекты[12б] .
Подавление реакции Хилла холатом натрия. Влияние света и меркаптоэтанола
Холат натрия подавляет фотохимическую активность хлоропластов. На рис. 24 представлена зависимость скорости фотовосстановления ДШШ хлоропластами, подвергнутыми экстракции холатом в течение 5 минут, от его концентрации в среде. С увеличением концентрации холата натрия усиливается инактивация транспорта электронов, при 50мМ концентрации кривая инактивации практически достигает насьпцения. Поэтому все наши опыты проводились при этой концентрации детергента. Достаточно длительная (более 10 минут) обработка холатом натрия приводила практически к полной (до 95%) инактивации фотовосстановления ДХШФ. Этот процесс, однако, различным образом развивался во времени в зависимости от адаптации хлоропластов к свету или темноте в период, предшествующий введению холата (рис.25). Скорость инактивации выше, если хлоропласти перед обработкой подвергались освещению (рис.25, кривая б), а введение дифенилкарбазида (ДФК), гидрофобного донора фотосистемы П [72 J , обеспечивает лишь 50%-ную реактивацию фотохимической активности в первые минуты действия детергента (рис.26 б). Для хлоропластов, предварительно адаптированных к темноте наблюдается 90 -ная реактивация электронного потока с постепенным снижением степени реактивации по мере обработки детергентом (рис.26 а ). Представленные кривые построены модифицированным методом наименьших квадратов (для нелинейных функций [іб] , среднеквадратичная ошибка апроксимации многочленом второй степени не превышает 5%. Ускорение инактивации освещенных хлоро-. пластов проявляется уже при 15-секундном предварительном освещении (освещенность 10000 лк). Зависимость степени инактивации хлоропластов выходит на насыщение при временах предварительного освещения около 2 минут (рис.27). Качественно различается и сама форма кинетических кривых инактивации (рис.26). В темноте кривая инактивации фотовосстановления ДХШФ хлоропластами в присутствии ДФК имеет сигмоидальную форму и характеризуется периодом индук ции, что свидетельствует о нарушении работы фермента, не определяющего скорости процесса в целом Г 4 J . На свету аналогичная зависимость не имеет таких особенностей, то есть нарушение электронно транспортной цепи происходит в другом звене. Исследования в хлоропластах сигнала ЭПР П, тесно связанного с фотосистемой П 119 , показали, что экстракция хлоропластов холатом натрия уже в течение нескольких первых минут подавляет стационарный сигнал ЭПР П. (рис.28).
Наблюдение измнений амплитуды сигнала ЭПР I, обусловленного окисленной формой пигментного комплекса Р700+, в условиях одновременного и раздельного действия света Д 700 нм (возбуждающего фотосистему I) и Я 640 нм (возбуждающего обе фотосистемы) демонстрирует последовательный перенос электрона от фотосистемы П к фотосистеме I. Сигнал ЭПР, индуцированный в хлоропластах светом 707 нм, поглощаемый фотосистемой I, частично подавляется при включении дополнительно к свету 707 нм источника света с коротковолновой компонентой, возбуждающей фотосистему П ( в нашем опыте белый свет) - рис.29а. В хлоропластах, обработанных холатом натрия в течение нескольких минут, связь между системами нарушается, что следует из отсутствия изменений сигнала ЭПР І в ответ на включение одиночной вспышки белого света на фоне света с длиной волны 707 нм - рис.29 б,в. Однако, сохранение быстрого спада сигнала ЭПР I после выключения белого света при сохранении освещения при 707 нм (рис.29 б,в) свидетельствует о частичном сохранении электронного тока между фотосистемами, так как восстановление центров Р700 происходит за счет восстановленного пласто-хинона в условиях, когда скорость поступления квантов в фотосистему I уменьшена по сравнению с исходной. Холат натрия подавляет фотохимическую активность хлоропластов. На рис. 24 представлена зависимость скорости фотовосстановления ДШШ хлоропластами, подвергнутыми экстракции холатом в течение 5 минут, от его концентрации в среде. С увеличением концентрации холата натрия усиливается инактивация транспорта электронов, при 50мМ концентрации кривая инактивации практически достигает насьпцения. Поэтому все наши опыты проводились при этой концентрации детергента. Достаточно длительная (более 10 минут) обработка холатом натрия приводила практически к полной (до 95%) инактивации фотовосстановления ДХШФ. Этот процесс, однако, различным образом развивался во времени в зависимости от адаптации хлоропластов к свету или темноте в период, предшествующий введению холата (рис.25). Скорость инактивации выше, если хлоропласти перед обработкой подвергались освещению (рис.25, кривая б), а введение дифенилкарбазида (ДФК), гидрофобного донора фотосистемы П [72 J , обеспечивает лишь 50%-ную реактивацию фотохимической активности в первые минуты действия детергента (рис.26 б). Для хлоропластов, предварительно адаптированных к темноте наблюдается 90 -ная реактивация электронного потока с постепенным снижением степени реактивации по мере обработки детергентом (рис.26 а ). Представленные кривые построены модифицированным методом наименьших квадратов (для нелинейных функций [іб] , среднеквадратичная ошибка апроксимации многочленом второй степени не превышает 5%. Ускорение инактивации освещенных хлоро-. пластов проявляется уже при 15-секундном предварительном освещении (освещенность 10000 лк). Зависимость степени инактивации хлоропластов выходит на насыщение при временах предварительного освещения около 2 минут (рис.27). Качественно различается и сама форма кинетических кривых инактивации (рис.26). В темноте кривая инактивации фотовосстановления ДХШФ хлоропластами в присутствии ДФК имеет сигмоидальную форму и характеризуется периодом индук ции, что свидетельствует о нарушении работы фермента, не определяющего скорости процесса в целом Г 4 J . На свету аналогичная зависимость не имеет таких особенностей, то есть нарушение электронно транспортной цепи происходит в другом звене. Исследования в хлоропластах сигнала ЭПР П, тесно связанного с фотосистемой П 119 , показали, что экстракция хлоропластов холатом натрия уже в течение нескольких первых минут подавляет стационарный сигнал ЭПР П. (рис.28).
Наблюдение измнений амплитуды сигнала ЭПР I, обусловленного окисленной формой пигментного комплекса Р700+, в условиях одновременного и раздельного действия света Д 700 нм (возбуждающего фотосистему I) и Я 640 нм (возбуждающего обе фотосистемы) демонстрирует последовательный перенос электрона от фотосистемы П к фотосистеме I. Сигнал ЭПР, индуцированный в хлоропластах светом 707 нм, поглощаемый фотосистемой I, частично подавляется при включении дополнительно к свету 707 нм источника света с коротковолновой компонентой, возбуждающей фотосистему П ( в нашем опыте белый свет) - рис.29а. В хлоропластах, обработанных холатом натрия в течение нескольких минут, связь между системами нарушается, что следует из отсутствия изменений сигнала ЭПР І в ответ на включение одиночной вспышки белого света на фоне света с длиной волны 707 нм - рис.29 б,в. Однако, сохранение быстрого спада сигнала ЭПР I после выключения белого света при сохранении освещения при 707 нм (рис.29 б,в) свидетельствует о частичном сохранении электронного тока между фотосистемами, так как восстановление центров Р700 происходит за счет восстановленного пласто-хинона в условиях, когда скорость поступления квантов в фотосистему I уменьшена по сравнению с исходной.
