Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Нжроксильные спиновые метки и их применение для изучения сериковых щролаз . 9
1.1. Спектры ЭПР нитроксильных радикалов 10
1.2. Определение скоростей вращения 14
1.3. Параметры, характеризующие полярность окружения 15
1.4. Взаимодействие между парамагнитными частицами. 16
1.5. Сериновые гидролазы и метод спиновых меток... 18
1.6. cd-XTP и холинэстеразы - общие сведения... 20
1.7. Изучение оС-1'П? методом спиновых меток 23
1.8. Холинэстеразы 33
1.8.1. Использование ковалентно связывающихся спин-меченых ингибиторов 33
1.8.2. Нековалентно связывающиеся ингибиторы 37
Глава 2. Материмы и методы 42
Глава 3. Взаимодействие спин-меченого производного индола с сывороточным алъбушном 68
3.1. Експерименти по конкуренции 74
3.2. Влияние органических растворителей 76
3.3. САЧ, ковалентно модифицированный спиновой меткой 85
3.4. Влияние рН и ионной силы среды 94
3.5. Температура денатурации комплекса 1-ЬСА 96
3.6. Связывание антибиотиков и ингибиторов с САЧ... 99
Глава 4. Изучение активного центра 105
4.1. Спектр ЫГР комплекса 1І-ХТР 106
4.2. Влияние парамагнитных катионов и анионов 108
4.3. Введение спинового зонда в активный центр Фосфорил-химо трипсина 110
4.4. Концентрационная зависимость кажущейся константы диссоциации комплекса П-ХТР 111
4.5. Влияние органических растворителей на комплекс П-ХТР ±16
4.6. КонФормационное изменение при переходе от нейтральных к кислым значениям рН 120
4.7. Взаимодействие сшшовол метки II с трипсином . 129
Глава 5. Взашюле-ствие спин-ыеченнх ингибиторов с активй-ы центров БуХЭ 131
5.1. Спектр оПР соединения в присутствии Б;уХЭ 133
5.2. Локализация радикала ТІЇ в комплексе с БуХЭ...136
5.3. Сопоставление данных ЭИР и ферментативное кинетики 138
5.4. Влияние ионной силы и органического растворителя на связывание 111 с БуХЗ 143
5.5. Расположение нитроксила Пі в углублении белковом молекулы 147
5.6. Влияние рН на взаимодействие III с БуХЭ 149
5.7. Не специфические центры связывания 152
5.8. Взаимодействие нитроксила I с БуХЭ 153
5.9. Бзашлодеиствие нитроксила 1У с БуХЭ 154
5.10. Влияние спин-меченого новокаина на активность БуХЭ 158
5.11. Взаимодействие катионов парамагнитных металлов с БуХЭ 159
Заключение 167
Выводы 169
Список литературы 171
- Параметры, характеризующие полярность окружения
- Использование ковалентно связывающихся спин-меченых ингибиторов
- САЧ, ковалентно модифицированный спиновой меткой
- Введение спинового зонда в активный центр Фосфорил-химо трипсина
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время остаются невыясненными многие аспекты строения активных центров и механизма действия сериновых гидролаз. Одним из основных подходов анализа их структурно-функциональных свойств является исследование термент-ингибиторных взаимодействий. Чрезвычайно полезное в подобных исследованиях представляется возможность сопоставления данных, полученных традиционными методами суб-стратно-ингибиторного анализа с результатами применения методов непосредственно регистрации фермент-ингибиторных комплексов, таких, как метод спиновых меток. В литературе данных такого рода практически нет. Использование спин-меченых конкурентных ингибиторов позволяет в принципе определять методом ьПР константы диссоциации (Кд) фермент-ингибиторных комплексов. Ота величина очень чувствительна к конформации активного центра, изменение К непосредственным образом указывает на изменение функционального состояния белка. Однако достоверное выявление конлюрмационных эффектов требует высокой точности и воспроизводимости определения Кд, а метод оПР традиционно считается мало приспособленным к такого рода экспериментам, ото осложняло изучение некоторых тонких кон-формационных эффектов в активных центрах даже таких относительно хорошо изученных ферментов, как ОС -химотрипсин ( ОС-IT?,Ш 3.4.4.5). Весьма интересен, например, вопрос о конформационной лабильности активного центра ОС-Ї.ТР в растворе при изменении рН. Рассмотрение ьтого вопроса затруднено необходимостью учета рН-завпсимои ассоциации фермента, молекулярное строение активного центра бутирилхолинистеразы (БуХЭ, КФ 3.1.1.8) изучено значительно хуже, чем в случае РС-ХТР. В последнее время в литературе высказывается сомнение относительно правильности общепринятого понимания метаболической роли холинэстеразы (Чабб,1984 /98/). Систематического изучении активного центра БуХЭ методом спиновых меток не проводилось вообще. Получение данных такого рода позволило бы расширить наши представления о структурно-срункциональных особенностях сериновых ферментов, что важно не только для понимания механизмов ферментативного катализа, но может иметь существенное значение для медицины и биотехнологии.
Цель и задачи исследования. В соответствии с изложенной проблематикой, ОСНОВНОЙ целью работы явилось изучение с помощью конкурентных спин-меченых ингибиторов активных центров сериновых ферментов - сб-ХТР и БуХЭ. При этом фермент-ингиби-торные комплексы регистрировали методом оПР, а для анализа состояния активных центров использовали определенные по спектрам оПР К фермент-ингибиторных комплексов. В рамках поставленной цели мы решали следующие конкретные задачи:
1. Отработать методику точного определения методом ЭПР К комплексов белков со спин-меченими лигандаш.
2. Используя ату методику, с помощью конкурентного спин-меченого ингибитора оС-АТР изучить влияние рН среды на кон-формацию активного центра с учетом влияния олигомеризации фермента на кажущееся значение Кд.
3. Методами ЭПР и ферментативной кинетики провести сравнительное изучение антихолинэстеразной активности и взаимодействия с активным центром БуХЭ спин-меченых лигандов для установления локализации спиновых меток в комплексе,получения данных о строении связывающих участков и о влиянии на эти комплексы различных факторов внешней среды.
Научная новизна. Впервые показано, что при переходе к кислым рН наряду с димеризациеи в активном центре с-ХТР происходит конформационное изменение с рК, близким к 6. Определена антихолинэстеразная активность спин-меченых новокаина и метацина, установлена их локализация в активном центре БуХЭ. методами Ь11Р спиновых меток и ферментативной кинетики определены К и Кинг комплексов спин-меченых ингибиторов с БуХЭ и получено хорошее совпадение между этими величинами. Впервые обнаружено, что вблизи анионного центра Ьуіа на рас-стоянии, не превышающем 10-I2A, расположен участок связнва-ния парамагнитных катионов б и /W и зарегистрирована А О, их конкуренция с ионами Ui за место связывания. Предложена модель строения анионного центра БуХЭ.
Научно-практическая ценность исследования. Полученные в работе данные о коїіформационннх возможностях активного центра сХ.-ХТР, антихолиностеразнои активности спин-меченых новокаина и метацина к о строении анионного центра БуХЭ существеніш для выяснения механизмов действия сериновых гидролаз и структурных особенностей, обеспечивающих эти механизмы. Результаты работы ведут к пониманию природы сил, стабилизирующих комплексы ферментов с ингибиторами, выяснению топографии активного центра БуХЭ и могут иметь важное значение при построении структурно-функциональных моделей активных центров сериновых ферментов. Данные о рП-зависимости конформациоиного состояния активного центра сС-іТР и о связывании ионов двухвалентных металлов вблизи активного центра холинэстеразы необходимо учитывать в дальнейшем при анализе механизмов регуляции активности этих ферментов. Разработанные методики открывают возможность определения К белок-лигандных комплексов методом сЛР с повышенной точностью, существенно увеличивая эффективность использования метода спиновых меток для количественного изучения белок-лигандных комплексов.
Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на У совещании по конформационным изменениям биополимеров в растворе, Телави,1980; і Всесоюзном биофизическом съезде, Москва,1982; Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медицине", Черноголовка,Ї98І, а такие на конкурсах молодых ученых и заседании секции биофизической химии ученого совета ІІИИ по БЖС Мишледпрома СССР, Купавна, 1984.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано б печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав, содержащих изложение методик и экспериментальных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Диссертационная работа изложена на 124 страницах, содержит 40 рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 206 работ советских и зарубежных авторов.
Параметры, характеризующие полярность окружения
Изменение полярности растворителя сказывается как на изотропных константах 00 и Q , так и на главных значениях тензора СТВ и ( --тензора, а при возрастании полярности увеличивается, О уменьшается. Например, для ди-трет-бутидьного радикала в гексане aQ-X4,8 гс, О -2,0061, а в воде а0=16,7гс, 0-2,0056 /133/. Увеличение aQ в полярных растворителях связано с увеличением отрицательного заряда на атоме кислорода и ростом спиновое плотности на атоме азота /65/. Зависимость констант СТВ от полярности среды используется для оценки полярности окружения спиновых меток. Но пользоваться значением константы СТВ для характеристики полярности можно только в области быстрых вращении, или когда есть уверенность, что вращение предельно медленное и не ускоряется при изменении полярности среды. В области медленных вращении выяснение вклада полярности окружения в величину сверхтонкого взаимодействия связано с трудоемкой экспериментальной процедурой (вязкостный метод определения предельных параметров,/155/). Для сравнения полярности различных сред можно использовать безразмерный параметр гидрофобности окружения (ь /29/: где ав - константа СТВ в воде, Эр - в реперном гидрофобном растворителе, а - экспериментальная величина а . 1.4. Взаимодействие между парамагнитными частицами. До сих пор подразумевалось, что взаимодействия ме.лду радикалам! в рассматриваемо системе достаточно малы. При повышении локальной концентрации нитроксилов учет УТИХ взаимодействии расширяет возможности метода спиновых меток.Выделяют диполъ-дипольное и обменное взаимодействия между неспаренныг.ш электронами. Обменное взаимодействие обусловлено перекрыванием орбиталеи неспаренных электронов, является близкодействующим и изотропным и может быть заметным как в жидкой, так и в твердой фазе. Его интенсивность в растворах определяется частотой столкновения радикалов Ъ . Если V 0\ , то модуляция обменного взаимодействия тепловшл двшшнием приводит к уширению линия спектра (слабое обменное взаимодействие). При больших концентрациях радикалов обменное взаимодействие усредняет сверхтонкое, и линии спектра сливаются в одну. С увеличением концентрации радикалов эта линия продолжает сужаться /73/. В бирадикалах и полирадикалах обменное взаимодействие проявляется в спектрах сПР более сложным образом. Анализ спектров бирадикалов приведен в работах /68,165/.
Диполь-дипольное взаимодействие проявляется при ограничении подвижности спи- новых меток и приводит к дублетному расщеплению спектров разрешенных переходов(лт-г/)и к появлению линии запрещенного пе-рехода/77-.2)в слабых полях при д 4. Из величины максимального диполъ-дипольного расщепления можно найти расстояние между взаимодействующими электронами /27,34,39/. При малыхD или когда взаимдеаствуют несколько спиновых меток, диполь-дипольное взаимодействие проявляется в уширении линии спектров ЭПР. Парамагнитные атомы Й,Сц&, fifn входят в состав некоторых шерментов, или образуют комплексы с кооюрглентами и субстратами. Взаимодействие спиновых меток с отими парамагнитными центрами позволяет получать информацию о пространственной структуре и динамических свойствах биомолекул.
Теория взаимодействия нитроксплов с парамагнитными ионами подробно изложена в работе /29/, а конкретные результаты, полученные при изучении белков - в сборнике Берлинера /64/ и монографии Г.К.Лихтенштейна /39/. Для количественного изучения взаимодействия экзогенных парамагнитных ионов со спин-мечеными биополимерами определяют константу скорости обменного взаимодействия по уормуле: где С - концентрация нитроксила, А/-/ уширение, г с, К - в М-Ісек Наличие нескольких центров связывания метки, раз- личающихся по доступности, будет проявляться в виде изломов на графике й(-/с ф(С) . Крайним выражением такой ситуации является наличие 2-х вариантов локализации метки - связанной с белком и недоступной действию уширителя, и находящемся в растворе и эффективно взаимодействующей с уширяющими ионами. В такой ситуации действие уширяющего агента позволяет "про- явить" ілалоинтенсивнші сигнал от центров, расположенных в глубине белковой глобулы на фоне интенсивных линии несвязанного радикала. Особенно удобны для у тон цели парамагнетики с короткими временами релаксации улектронного спина, для которых собственный спектр не наблюдается. В работе /26/ предложен также подход, позволяющие по зависимости ширины линии несвя-знвающеися с белком спиновое метки от концентрации парамагнит-ного иона определять параметры связывания последнего с белком.
Использование ковалентно связывающихся спин-меченых ингибиторов
Холинэстеразы были в числе первых ферментов, модифицированных по активному серину метками ЇХ и ХУІ. В начальный период исследовании в литературе получили известность работы Моррисет-та и др./160,162/ и Хсиа и др./120,121/. Эти две группы исследователей модифицировали фосиюрорганическими метками большой набор сериновых гидролаз, в том числе АХЭ и БуХЭ, и провели сравнительное исследование полученных спектров. Хотя были использованы разные спиновые метки и фермент из разных источнике), были получены хорошо согласующиеся данные о быстром вращении ковалентно связанных с белком спиновых меток. Степень иммобилизации метки на холинэстеразе была минимальной по сравнению с оС-ХТР, трипсином, тромбином и остальными изученными ферментами, оти данные легли в основу представления об открытом, поверхностноїл расположении активного центра холиностераз и о том, что при локализации в этом центре нитроксильный фрагмент не имеет значительных стерических препятствий для вращения /69,84/.
Вместе с тем в 1971 г. в двух кратких сообщениях были описаны спектры холинэстеразы, модифицированной аналогичными метками, характерные для сильно затрудненного движения нитроксила /94,194/. Затем авторы /59/ описали спектр БуХЬ, который содержал сигналы как слабо, так и сильно иммобилизированнол метки ХУПа. СООТНОШЄЕІИЄ сигналов зависело от ионной силы, рН,присутствия субстратов и ингибиторов. Группа югославских ученых, использовав соединение IX, получила спектр мембранно-связанном АХЭ, соответствующий иммобилизированному шшеридилу /178/.
Было сделано предположение, что вращение ингибитора затруднено из-за того, что активний центр фермента погружен в складку поверхности белковой глобулы. 33 следующей работе тех же авторов для проверки этого предположения было изучено влияние денатурирующих агентов на спектры ЭГ1Р спин-меченой АХЭ /180/. При действии мочевины, хлороформа, при повышении температуры или уменьшении рН уменьшение активности фермента сопровождалось появлением и возрастанием "быстрых" компонент в спектрах., моди-фиуированно.і метками IX и ХУ ЛХЭ. Т.к. денатурирующие агенты, значительно изменяя коноюрмацию белка, могут устранять стери-ческие препятствия движению питроксила, данные по денатурации подтверждают предположение о погруженности активного центра в складку, "карман" на поверхности макромолекулы. Ходаковская и др. /59/ также отмечали возрастание амплитуды сигнала слабо иммобилизированнои метки при действии мочевины на БуХЭ. При изучении данных /180/ по денатурации обращает на себя внимание разная чувствительность нативного и спин-меченого фермента к действию мочевины. 5М мочевина инактивирует фермент на 100#, тогда как по спектру спин-меченого белка для такой концентрации мочевины видно, что быстро вращающаяся метка, связанная с денатурированным ферментом, составляет лишь 10-15# от общего количества связавшееся метки, ото означает, что денатурационными изменениями затронуты далеко не все участки связывания фосшо-нилирующего реагента. Видимо, мы имеем дело со стабилизацией активного центра при взаимодействии с ингибитором, хотя нельзя исключить и некоторую гетерогенность участков связывания. Причины расхождения данных /178,180/, наблюдавших медленное вращение питроксила на холинэстеразе с выводами /121,162/ об отсутствии заторможенности вращения были выяснены при сравнении методик получения спин-меченого фермента /179,187/. Оказалось, что "медленный" спектр получается при использовании концентрации метки, на несколько порядков меньшей, чем в опытах Моррисетта, и к тощ же при сокращении времени обработки в 20 раз. Изучение стехиометрии связывания ингибитора показало, что использовавшаяся первоначально методика приводила к 15 -20-кратноыу избытку связавшейся метки по сравнению с концентрацией активного серина. Использованный в /160,162/при контроле защитны,, реагент также был недостаточно специфичен. В результате обработки фермента большим избытком метки сигнал неспещнои-чески прореагировавшего соединения полностью преобладал над сигналом ингибитора., иммобилизироваьного в активном центре. Сигнал иммобилизированном метки все же заметен при внимательном рассмотрении спектров, приведенных в /162/, что и было отмечено в обзоре Берлинера /84/. Видимо, быстрьы сигнал, зарегистрированные Ходаковскои и др. также объясняется неспецифическим связыванием избытка ингибитора.
Синтез серии оюссоорорганических меток с различной длиной алифатическое цепи (XIII,рис.3) позволил той же группе югославских ученых получить данные о топографии активного центра АХЬ /168,169/. При возрастании дяины цепи происходит увеличение 2А,. Рассмотрение спектров таких меток в средах с различно полярностью и при низко- температуре позволило интерпретировать возрастание 2Ац как следствие ограничения подвижности метки, рас-положеннол внутри "кармана" активного центра. Молекулярные модели меток подтверждают возможность изгиба алифатической цепи (при достижении определенное длины) таким образом, что возникают стерические препятствия движению нитроксильной головки внутри складки поверхности макромолекулы. Компьютерная обработка различных моделеп движения метки показалд, что спектры, смоделированные в предположении быстрой анизотропной либрации нитрокси-ла лучше соответствуют экспериментальным данным, чем модели на основе изотропном броуновской диффузии. }\дя меток с двузвеннои и восьмизвеннои цепью (ХУП, fb=2, / =8) лучше всего соответствуют углы либрации 27,8 и 21,2, соответственно, при 5,5x10 сек /167/. Впоследствии те же авторы по зависимости 2А, от (Ъ оценили расстояние между активным серином и внутренней поверхностью кармана, в котором он расположен, в 0,3 нм /190/. В УТОИ серии работ остается не совсем ясным вопрос о специфичности взаимодействия меток с препаратом мембранпо-связан-нои АХЭ. Присутствие в среде озерина предотвращало связывание с препаратом меток с /Ъ - 1 4, при увеличении длины цепи защитное действие узерина ослабевало и при (Ъ =12 полностью отсутствовало/169/, ото, видимо, означает, что с ростом длины цепи уменьшается специфичность взаимодействия глеток. Пекар и др.
САЧ, ковалентно модифицированный спиновой меткой
Отмеченое в наших опытах увеличение числа мест связывания при переходе от ДМСО к ацетону можно приписать десорбции жирных кислот, усиливающейся под действием наименее полярного ацетона. 3.3. САЧ, ковалентно модифицированный спиновой меткой. При изучении взаимодействия 1 с САЧ в присутствии органических растворителей возник естественный вопрос о том, как сильно меняется кон ормация белка в исследуемом диапазоне концентрации, и не имеем ли мы дело с белком, уже денатурировавшим в результате "солюбилизации" гидрофобных участков молекулы малополярніши растворителшли. Поотому мы рассмотрели влияние различных концентрации органического растворителя на форму спектра ковалентно связанной с белком мале-имидной спиновой метки У. Спектр СЛЧ, модифицированного соединением У, приведен на рис.14.I. Общий вид спектра свидетельствует о том, что основная часть молекул метки заторможена до времен » 1-2x10" сек. Расстояние между крайними акстремумаш спектра сильно заторможенной метки 2Л„ составляет 64,4±0,3 гс. Кроме того, по обе стороны от центральной линии спектра видны узкие компоненты, свойственные быстрому вращению нитроксила.
Расстояние межлу ними составляет 34 гс, т.е. равно величине 2а для несвязанной с белком метки. По амплитуда этих компонент не уменьшается при увеличении длительности диализа препарата до 2-х суток, следовательно, они обусловлены не примесью несвя-завшенся метки. Похожий спектр пятичленнои малеимиднои метки, связанной с БСА, приведен в работе /79/, где утверждается, что "быстрый" сигнал с2а0= 34 гс полностью исчезает, если довести длительность диализа до 6 суток, и следовательно, ьтот сигнал обусловлен несвязавшенся меткой, ото рассуждение, на наш взгляд, не вполне правильное. Во-первых, практика показывает, что для полного удаления,например, несвязанной иодацета-миднол метки обычно достаточно 2-х суток диализа, следовательно, необходимость 6-ти суточного диализа означает, что взаимодействие метки с белком каким-то образом дополнительно стабилизировано. Во-вторых, при диализе длительностью шесть суток очевидно, необходимо предпринимать специальные меры для предотвращения химических и бактериальных процессов в концентрированных растворах меченого белка, и вряд ли простое охлаждение до +4С может гарантировать отсутствие таких процессов в течение 6 суток. Как известно, СЛ содержит I остаток цистеина, обладающий реакционноспособно,,. /7 -группой.Основной вклад в спектр вносит метка, связанная с этой группой, а второй сигнал, от быстро вращающейся метки, может быть обусловлен связыванием с аминокислотами, содержащими BrNHiгруппу, метка У, кроме того, гложет взаимодействовать с белком двумя способаг.ш, в т.ч. с раскрытием имидного кольца/76/.
Метка, прореагировавшая таким способом, также может давать второй сигнал в спектре. При действии на спин-мечешш САЧ метанола, этанола, ацетона или ДЖЮ МО..ЧІЮ выделить качественно общие для всех растворителей изменения формы спектра соединения У. При увеличении концентрации растворителей амплитуда сигнала от сильно / — — Я заторможенное метки с Сс 10 сек уменьшается; одновременно І— — ч начинает проявляться спектр сПР с 6а 10 "сек, который при достаточно большой концентрации растворителя становится доминирующим (рис.14.2). -юрма такого спектра для разных растворителей совпадает, время корреляции, определенное по формуле (10), составляет 2,2x10 сек для 54$ метанола, 3x10" сек для 527 этанола, 2хЮ"Ь сек для 85# ДМС0. При дальнейшем увеличении концентрации растворителей происходит, как и следовало ожидать, преципитация белка, сигнал ЭПР при этом резко уменьшается. Сигнал с 2x10" сек, видимо, дает метка, связанная с денатурированными молекулами белка. При такой денатурации происходит "расплавление" гидрофобных участков поверхности белка /50/, устранение стерических препятствия для вращения метки и переход ее из состояния с бс 2x10 сек на нативном белке в состояние с се 2x10 сек на денатурированном. Б присутствии органических растворителей спектр состоит лишь из отих 2-х сигналов, при денатурации "медленный" сигнал уменьшается, "быстрый" - возрастает. При этом не происходит плавного изменения с 2x10 до 2x10 сек, промежуточных сигналов мы не наблюдали. При росте концентрации растворителей уменьшается величина 2А( (максимально на 2,1 гс в присутствии 40# ьтанола).
Введение спинового зонда в активный центр Фосфорил-химо трипсина
Соединение II, по данным Григоряна /10/ является конкурентным ингибитором oCTF и вытесняется из комплекса с белком под действием бензамида и 2,4-дибромфенола - специфических ингибиторов, занимающих тозильнын карман, расположенный в непосредственно , близости от активного центра. Очевидно, Фенильная группа соединения її так:;е связывается с тозильным кармалюм и вытесняется оттуда при занятии его специфическими ингибиторами. ДФФ связывается ковалентно с активным серимом оС-ІТР, расположенным как бы "на краю" этого кармана. ЇНОЇЛЮ предположить, что изопропильные группы связанного с се рином остатка ДФФ будут менять доступность то-зильного кармана связывающейся группе лиганда. Но по нашим данным, связывание соединения LL с Х-ХТР , обработашпім ДФФ, не отличается от связывания с нативным ферментом. Таким образом, алкильные группы фосйорорганнческого ингиоитора локализованы в молекуле инактивироваыного фермента так, что не мешают проникновению фенилънои группы спиновой метки в гидрофобные карман, а фоапоршшрование серина не вызывает существенного изменения кон.іюрмации этого кармана. Остаток ДФФ, видимо, достаточно компактен и очень незначительно нарушает статическую структуру белка. С отим согласуются, например, данные /122/, согласно которым обработка Д Ш лишь в небольшое степени уменьшает интенсивность димеризации фермента при повышении его концентрации, хотя димеризадия происходит с непосредственным участием активного центра.
Из спектра, приведенного на рис.21 видно, что разница времен корреляции Ct для свободно и связанной с белком спиновой метки достаточно велика и высокоплевая компонента изотропного спектра свободное метки не искажается наложением компонент анизотропного спектра, ото позволило нагл определять концентрацию свободного и связанного с белком лиганда по изменению амплитуды высокополевои компоненты по сравнению с водным раствором нитроксила той же концентрации, но без белка. Эксперименты показали, что величина К , вычисляемая по тор-муле (13) / л- — (Е - общая концентрация белка, EI и I - концентрации связанного и свободного ингибитора) меняется при изменении концентрации фермента (рис.23). Это объясняется тем, что в растворе оС-ХТР присутствуют не только мономеры, но и димеры и более сложные ассоциаты, хотя известно, что II связывается лишь с мономерами /31/. Равновесие между различными формами фермента, существующее в растворе, зависит от концентрации белка. На рис.24 показана зависимость содержания олигомеров и мономеров оС-ХТР при рЫ 6,0 от общей концентрации белка. При повышении концентрации равновесие сдвигается в сторону усиления образования олигомеров, а относительная доля мономеров падает. Но конкурентные ингибиторы имеют максимальное сродство к мономерной форме. Таким образом, доступ лигандов к связывающему участку в районе активного центра при ассоциации фермента затрудняется, а усилении ассоциации при повышеніш содержания белка ведет к падению относительного содеііжания доступных лигандам активных центров. При определении К по формуле (ІЗ) в выражение кроме концентрации незанятых активных центров (Е) входят еще и концентрации олигомеров оС-ХТР, не связывающих 11, что и вызывает рост к при увеличении Е . При уменьшении концентрации белка величина К_ будет стремиться к К = —г . В наших условиях эксперимента зависимость її от Е оказалась близкой к линейной. Для определения истинного значения К мы проводили линейную экстраполяцию концентрационной зависимости К к нулевому содержанию белка и находили К по пересечению прямой с осью ординат. Полученная таким образом К соответствует предельно разбавленной системе и не зависит от вклада ассоциировавших молекул белка. При рИ 6,5 в ОДМ фосуат-цитратном буфере К составляет 9x10 М. Следует ответить, что линейный вид зависшюсти К от Е сохраняется не во всех случаях. Подбирая условия для онре-деления К и К мы оонаружили, что если использовать вместо фосфатного или фосфат-цитратного трис-буфер, широко применяемые, в биохимии, соединение II связывается с оС-ХТР значительно хуже, а зависимость К от EQ существенно отклоняется от линеянол (рис.25). Анализируя представленную на рис.25 зависимость, могіно предполо;.шть, что влияние Трис-буфера на взаимодействие LI с сС-ХТР не связано с конкуренцией молекул Трис- и XI за участки связывания с ферментом, так как при разбавлении белка и зонда при постоянном содержании Трис-буфера, величина к стремится к тому же значению, что и в фосфатном буфере, а при конкуренции определяемая при бесконечном разведении величина К должна была бы быть больше, чем в отсутствие Трис.
