Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 5
Спектроскопия магнитного резонанса и метод спин-метки 5
Методы решения обратной задачи спектроскопии ЭПР 5
Описание быстрой хаотической переориентации спин-метки 9
Динамические модели движения, использующиеся при интерпретации спектров ЭПР. 12
Численные методы моделирования 14
Метод Молекулярной Динамики , 15
Метод Монте-Карло 21
Методы Оптимизации 22
Исследования макромолекул методом молекулярной динамики 26
Глава 2 Исследование локальной динамической структуры белка в спин-меченом тетрагональном кристалле лизоцима методом спин-метки ЭПР 28
Условия эксперимента 28
Результаты и обсуждение 30
Глава 3. Обнаружение спин-спинового взаимодействия при введении в иммуноглобулин М и G спин-метки по углеводной части 39
Условия эксперимента 39
Результаты исследования 40
Обсуждение результатов 45
Глава 4 Моделирование спектров ЭПР 48
Вычисление спектров ЭПР монокристалла для низкомолекулярных соединений 52
Вычисление спектров ЭПР спин-меченых макромолекул в составе монокристалла 55
Глава 5. Постановка вычислительного эксперимента на основе метода молекулярной динамики 63
Построение модельной системы и оптимизация 63
Расчеты методом МД 68
Глава 6. Вычисление спектров ЭПР спин-меченых макромолекул по данным МД 75
Заключение 79
Выводы 80
Список литературы , 81
- Методы решения обратной задачи спектроскопии ЭПР
- Результаты и обсуждение
- Результаты исследования
- Вычисление спектров ЭПР спин-меченых макромолекул в составе монокристалла
Введение к работе
В настоящее время наблюдается повышенный интерес к применению метода спин-метки в молекулярной биологии, в связи с тем, что можно избирательно вводить спин-метки по любому аминокислотному остатку молекулы белка или основанию в ДНК [1,2]. Анализ формы спектра ЭПР таких спин-меченых макромолекул позволяет получить информацию о молекулярном движении и представляет собой доступный подход к изучению как конформационных изменений, так и биологических функций макромолекул.
Однако, несмотря на огромное количество полученных экспериментальных спектров ЭПР, корректной, недвусмысленной, единой для всех, кто использует метод спин-метки, интерпретации этих спектров до сих пор не существует. Нет единого подхода к решению обратной задачи ЭПР спектроскопии в методе спин-метки [3]. Основная причина отсутствия единого подхода к истолкованию спектров ЭПР заключается в следующем: нет четкого ответа на вопрос, как связывать экспериментальные параметры, определяемые из спектров ЭПР (для той или иной модели движения спин-метки), с наблюдающимися локальными коиформациопными изменениями структуры макромолекулы или с движением всей структуры макромолекулы в растворе.
При анализе спектров ЭПР необходимо учитывать, что вводимая в молекулу белка спин-метка не является статическим объектом, и характер ее собственного движения во многом определяет форму линии ЭПР спектра. С одной стороны мы имеем спектр ЭПР, отражающий локальную структуру макромолекулы в динамике, а с другой стороны -«застывшую» структуру по данным реитгеноструктурного анализа. При моделировании спектров ЭПР на ЭВМ используют различные модели быстрого переориентационного движения спин-метки. Однако, существует метод молекулярной динамики, который позволяет напрямую моделировать поведение сложных динамических систем [4,5], опираясь на данные реитгеноструктурного анализа. Метод молекулярной динамики представляет собой численное решение уравнений Ньютона для системы атомов, с учётом взаимодействия между ними. То есть метод молекулярной динамики в данном контексте можно рассматривать, как «мост» между экспериментальными данными ЭПР и данными реитгеноструктурного анализа. Иными словами, результаты, полученные методом молекулярной динамики с использованием в качестве начальных координат атомов данные метода реитгеноструктурного анализа, можно сопоставлять с данными экспериментальных методов магнитного резонанса, в том числе и ЯМР.
В настоящей работе методом молекулярной динамики оценивается влияние локальной структуры молекулы белка, уже известной по данным рентгеиоструктурного анализа, на подвижность репортерской группы (нитроксила), присоединенной к выбранному аминокислотному остатку, и анализируется вклад собственного хаотического движения спин-метки относительно белка на спектр ЭПР. В качестве объекта исследования выбран спин-меченый монокристалл лизоцима [6]. Молекулы белка неподвижны в структуре монокристалла, но сама структура не препятствует локальной подвижности поверхностных групп. Поэтому белковый монокристалл можно рассматривать в качестве удобной модели для исследования характера движения аминокислотного остатка (или спин-метки) относительно белка. Ожидается, что сравнение теоретического спектра ЭПР, полученного методом молекулярной динамики, с экспериментальным будет критерием корректности развиваемого здесь физического подхода для решения биологических задач в рамках метода молекулярной динамики.
Наблюдение за характером быстрых движений боковых остатков в монокристаллах белков осуществлялось с помощью метода спин-метки [7,8]. Интерпретация спектров ЭПР монокристаллов спин-меченого лизоцима (при наличии различных ориентации тетрагонального кристалла белка относительно направления магнитного поля) проводилась с привлечением метода молекулярной динамики (МД). Предложена простая модель, согласно которой расчет траекторий движения спин-метки методом МД реализуется за сравнительно небольшое время. В рамках предлагаемой модели рассматривается «замороженная» в целом молекула белка и «размороженный» спин-меченый аминокислотный остаток. Для расчёта траекторий в вакууме была собрана модель спин-меченого лизоцима и заданы параметры силовых потенциалов атомов молекулы белка, включая спин-метку. Из проведенных расчётов следует, что белковое окружение стерически ограничивает область возможных угловых переориентации репортерской N0 группы нитроксила в составе спин-метки, что в свою очередь влияет на форму спектра ЭПР. Однако, как оказалось, разброс положений репортерской группы в угловом пространстве соответствует распределению Гаусса. Используя координаты атомов спин-метки, полученные методом МД в выбранном временном интервале и учитывая распределение состояний спин-метки по ансамблю спин-меченых макромолекул в кристалле, мы смоделировали спектры ЭПР монокристаллов спин-меченного лизоцима. Полученные теоретические спектры ЭПР оказались сходными со спектрами, полученными экспериментальным путем.
Методы решения обратной задачи спектроскопии ЭПР
Попытки получить информацию о динамической структуре макромолекул в растворе с помощью техники спиновых меток предпринимались сравнительно давно. В самом начале существования метода для извлечения количественной информации из спектров ЭПР предполагалось, что подвижность ковалентно связанной с макромолекулой спин-метки непосредственно отражает подвижность этой макромолекулы. Более того, считалось, что метка, связанная с макромолекулой, вращается как бы изотропно. Поводом для такого предположения послужила форма спектра ЭПР (состоящая из трех острых линий разной интенсивности), аналогичная форме спектра ЭПР для изотропного вращения радикала (свободного в растворе) в диапазоне времени корреляций от 3 до 0,01 не. Исходя из этого для расчета времени вращательной корреляции т применяли формулу Кивельсона [12] с последующим построением аррениусовских зависимостей определенного таким образом т. сегмента макромолекулы [ІЗ]. В тех случаях, когда спектр ЭПР имеет иммобилизованную форму с хорошо выраженными крайними широкими пиками, расчет времени корреляции т в области изотропных медленных вращений радикала проводили методом Кузнецова [14], Макконела [15]. Однако все эти способы моделирования спектров ЭПР противоречивы и не вполне адекватно учитывают процесс быстрой хаотической переориентации нитроксила относительно макромолекулы.
На сегодняшний день существуют, в основном, две модели описания движения нитроксила, прикрепленного к макромолекуле. Первая модель разработана американским исследователем Фридом [16], и заключалась в том, что движение объемной молекулы нитроксильного радикала, присоединенного к макромолекуле, описывается эллипсоидом вращения, где параллельная компонента характеризовала быструю переориентацию нитроксила относительно носителя, а перпендикулярная - медленную диффузию самого носителя.
Эллипсоидная модель описания движения нитроксильного радикала. Перпендикулярные компоненты характеризуют медленное движение радикала вместе с макромолекулой, параллельная -быстрое движение самого радикала. Фрид развил метод интерпретации спектров для неизотропно вращающихся радикалов, вводя в стохастическое уравнение Лиувилля двухкомпонентный тензор диффузии и несовпадение магнитных тензоров нитроксила с тензором диффузии. Затем он перенес этот подход на спин-меченые макромолекулы, предположив, что перпендикулярная компонента тензора диффузии соответствует изотропному времени вращательной корреляции глобулы белка, а перпендикулярная - времени корреляции метки относительно белка, при этом угол несовпадения осей Z диффузионного и магнитных тензоров соответствует параметру упорядоченности S.
Иными совами, подход Фрида представляет быстрое движение радикала относительно макромолекулы и медленное движение макромолекулы в целом с помощью одного сложного движения. Однако на самом деле быстрое хаотическое движение метки никак не зависит от изотропного Броуновского движения ее носителя, более того, они различаются по своей природе.
Модель, предложенная, В.П.Тимофеевым [3,17,18] независимо рассматривает быстрое хаотическое движение нитроксила и медленное изотропное вращение радикала. В результате движения нитроксила относительно макроносителя усредняются компоненты магнитных тензоров нитроксила. Суть моделирования сводилась к замене неизвестного хаотического процесса быстрого движения спин-метки на простой, описываемый с помощью математического аппарата процесс.
Для полной характеристики спектров ЭПР спин-меченных макромолекул важен факт одновременного участия нитроксила в двух независимых стохастических процессах: анизотропном вращении относительно макромолекулы и в изотропном вращении вместе с её сегментом. Таким образом, динамическое поведение нитроксила, ковалентно связанного с макромолекулой, должно описываться, как минимум, тремя динамическими параметрами, учитывающими высокочастотные колебания нитроксила, их амплитуду и т сегмента.
Для получения этих параметров необходимо добиваться от исследуемых биологических образцов спектров ЭПР иммобилизованного вида, снижая температуру и увеличивая вязкость среды. Другими словами, необходимо уменьшить разброс по углам и частоту быстрой анизотропной переориентации нитроксила, т. е. снизить температурную активацию метки и увеличить т сегмента макромолекулы настолько, чтобы в спектрах ЭПР появились крайние широкие пики. Простой моделью такого движения является модель быстро вращающегося волчка на медленно вращающейся сфере. В этой модели учитывается быстрая переориентация метки, но природа этого движения не конкретизируется [19]. Характер движения спин-метки относительно макромолекулы и время вращательной корреляции спин-метки по шкале времени ЭПР в Х-диапазоне СВЧ таковы, что приводят к строгой аксиальной симметричности тензоров g (g-фактора) и А (сверхтонкой структуры). Быстрое анизотропное движение спин-метки относительно макромолекулы модулируется гораздо более медленным движением глобулы белка или сегмента макромолекулы.
Спектры ЭПР можно моделировать на основе различных динамических моделей [16,20]. Обычно рассматривается три общих модели движения относительно процесса переориентации метки: броуновская вращательная диффузия, скачкообразная диффузия (случайные скачки на конечный угол) и свободная диффузия (учитывается эффект инерции). В простых случаях наблюдается достаточно хорошее соответствие эксперименту. Если, однако, спин-метка связана с белком, то её движение может быть чрезвычайно сложным, и необходимо учитывать взаимодействия с основой белка, со смежными боковыми цепями, и столкновения с молекулами раствора. Кроме того, пространственные ограничения движения боковой цепи спин-метки влияют па спектр ЭПР как увеличение корреляционного времени переориентации из-за различий локального трения. Всё это сложно учесть на основе динамических моделей.
При исследовании макромолекул методами ЯМР и спин-метки ЭПР, в общем случае, могут проявляться различные формы и характеристики молекулярного движения, как для вращательной, так и для поступательной диффузии частиц. В ЯМР или ЭПР молекулярное движение модулирует магнитные ядерные, электронные или электронно-ядерные дипольные взаимодействия спинов, находящихся во внешнем магнитном поле. Иными словами, молекулярное движение изменяет локальные магнитные поля, в которых находятся электронные и ядерные спины, изменяет энергии уровней и вероятности переходов между ними.
Результаты и обсуждение
Экспериментально были получены спектры ЭПР спин-меченого лизоцима в растворе [рис.4] и в монокристалле тетрагональной формы [рис.6]. Строение элементарной ячейки этого кристалла представлено на рисунке 5. Изменение формы спектра ЭПР кристаллов Lyz-Hisl5-SLI и Lyz-Hisl 5-SLII зависит от ориентации кристаллографических осей относительно направления магнитного поля. Анализ этой зависимости позволил сделать вывод о том, что Z _оси нитроксильных радикалов SLI и SLII ориентированы вдоль кристаллографических осей а и Ь. Введем следующие обозначения: NRa -нитроксильный радикал, оси -Z которого ориентированы вдоль кристаллографической оси a; NRb -нитроксильный радикал, оси Z которого ориентированы вдоль кристаллографической оси Ь. Угол поворота кристалла относителыю направления магнитного поля обозначим через %. При =0 ось а кристалла ориентирована параллельно направлению магнитного поля. Таким образом, спектры ЭПР (рис.6) являются суперпозицией спектров от взаимно перпендикулярных нитроксилов NRa и NRb, лежащих преимущественно в плоскости [001]. При =0 вклады нитроксилов NRa и NRb в центральную компоненту спектра ЭПР (рис. 5а) условно обозначены как 1а и lb. Ориентация молекулярной оси Z нитроксила относительно осей кристаллов Lyz-Hisl5-SLI и Lyz-Hisl5-SLII была определена нами из рентгеноструктурных исследований этих кристаллов с высоким разрешением. Направление оси Z рассчитали как нормаль к плоскости, в которой расположены атомы имидазолидинового кольца и N0 - группы нитроксила. Направляющие косинусов оси Z : сх= - 0.912; су=- 0.486; cz= 0.184 для SLI и сх - -0.106; су = 0.937; cz = -0.086 для SLII. Значения величин направляющих косинусов по X (для SLI) и по Y (для SLII) близки к единице, следовательно, ориентация нитроксилов, полученная по данным ЭПР, полностью подтверждается.
Значение заселенности спин-метки (10%), полученное из данных рентгеноструктурного анализа, хорошо совпадает с коэффициентом модификации спин-меткой, вычисленным посредством двойного интегрирования спектров ЭПР.
На рис.6 (а, б, в) выборочно представлены спектры ЭПР кристаллов Lyz-Hisl 5-SLI и Lyz-Hisl 5-SLII при значениях влажности от 97 до 40%. Спектры ЭПР на рисунке За соответствуют ориентации кристалла %-0 и представляют суперпозицию двух разных по форме спектров от нитроксилов NRa и NRb. Кроме того, видно, что дегидратация кристалла вызывает уменьшение интенсивности компонентов lb и 1а, при этом их отношение (lb/ la) также претерпевает изменение.
Если выставить кристалл под углом =45 к направлению магнитного поля (рис.66) или под углом =90 (рис.бв), то 2" - оси нитроксилов NRa и NRb в кристалле будут составлять почти один и тот же (в пределах точности ориентации кристалла в капилляре) угол относительно направления магнитного поля, и поэтому спектр ЭПР, который представляет суперпозицию спектров от NRa и NRb, имеет одинаковую форму. Интенсивность центральной компоненты (1о) отражает интегральный вклад всех нитроксилов в кристалле. Сравнение спектров при разных значениях влажности показывает, что уменьшение влажности приводит к снижению интенсивности и уширеиию компонентов спектра. 1,0
На рисунке 7 для кристалла Lyz-Hisl5-SLI, ориентированного под углом =45, представлены зависимости изменения интенсивности Іотн (рис.ба) центральной линии 1о спектра ЭПР и ее ширины ДНотн (рис.7б) от влажности. Резкое падение интенсивности Іотн до 0.06 и увеличение ДНотн до 0.78 наблюдается в интервале от 100 до 75% О В, а плавное снижение Іотн почти до нуля и дальнейшее увеличение ДНотн почти до 1 происходит в интервале 75 - 40% ОВ. Из такого характера зависимости можно предположить, что дегидратация кристалла до 75% ОВ обусловлена удалением основной массы разупорядоченных молекул внутрикристаллической воды. Более пологий участок зависимости (от 75 до 40% ОВ) отражает удаление как оставшейся объемной воды, так и возможным изменением положения слабо связанных с белком молекул воды, что подтверждается рентген оструктуриыми исследованиями кристаллов лизоцима при пониженной влажности.
Представляется интересным определить, влияет ли структура спин-метки на характер изменения спектра ЭПР в зависимости от влажности. Поскольку для Lys-Hisl5-SLI были получены спектры ЭПР только при =0 и 45, а для Lyz-Hisl 5-SLII только при =0 и 90, то па рисунке 5 представлена зависимость относительной интенсивности lab двух центральных компонентов lb и 1а спектра ЭПР (рис.5а) от влажности при =0 для обоих кристаллов. lab - есть разность интенсивиостей между максимумом lb и минимумом 1а. Из рисунка 5 видно, что независимо от типа спин-метки наблюдается резкое падение интенсивности спектра ЭПР в интервале от 100 до 75% ОВ. Следовательно, наблюдаемые при дегидратации различия в спектрах ЭПР определяются только изменением водного окружения спин-меток в кристалле.
Результаты исследования
Введение спин-метки в углеводную часть IgM. Все процедуры проводили при 4С. К 1.5 мл раствора IgM в 0.006М фосфатном буфере рН 7.0, содержащем 0.15М NaCl (буфер А) добавляли NaI04 до концентрации 20мМ (4.28 мг/мл), закислившийся раствор доводили вновь до рН 7.0 с помощью 0.1 п. NaOH, выдерживали ночь в темноте, диализовали в диализной трубке "Viskmg" около 2 суток против буфера А с частой сменой буфера (общий объем буфера 0.5 л на 1 мл раствора белка), добавляли SL в весовом соотношении SL - белок = 1:1 и одновременно NaCNBH до концентрации « 0.1М (6.5 мг/мл) и диализовали против буфера А (0.7 л), как указано выше. Полученный раствор пропускали через колонку 1x20 см с сефадексом G-25 medium, уравновешенную буфером А, собирая фракции по 0.2 мл, при этом немедленно снимали спектр ЭПР каждой фракции.
Спектры ЭПР. Запись осуществляли на ЭПР-спектрометре "Varian Е-104 А" (США) при амплитуде ВЧ модуляции 1- 2 Гс, уровне СВЧ 5 мВт и различном коэффициенте усиления (Gain). Развертка магнитного поля составляла 100 и 200 G за 8 и 4 мин соответственно. Результаты исследования Спектр ЭПР препарата спин-меченого IgM после диализа при коэффициенте усиления (Gain) 2 І03. Отдельно покачан фрагмент спектра ЭПР, записанный при большем усилении (1.25 104). Амплитуда ВЧ модуляции для обоих спектров равна 1 G.
Как следует из рис.9, представляемый спектр ЭПР препарата IgM-SL, полученного сразу после диализа, уже является "пятиполосным". В двух промежутках между острыми линиями спектра наблюдаются добавочные линии (полосы) - характерные синусоидальные искажения базовой линии. Между второй и третьей острыми линиями отдельно при большем усилении (в 6 раз) показано, что искажение базовой линии есть не что иное, как добавочные линии в спектре ЭПР. Эти две линии в спектре ЭПР свидетельствуют о наличии быстрого обменного взаимодействия между нитроксилами (спинами) в составе спин-меток, как в бирадикалах. Поэтому мы и называем такой спектр ЭПР "пятиполосным". Наличие трех острых линии на рис.о свидетельствует о томтчто-в отдиализованном препарате, помимо спин-меченого белка, присутствует не отделившаяся свободная спин-метка. Это означает, что диализ не является исчерпывающей процедурой для отделения свободной спин-метки в растворе. Только гель-фильтрация позволила окончательно отделить примесь свободной спин-метки и одновременно выявить источник появления пятиполосного спектра ЭПР. Отдиализованный препарат (рис.9) подвергли гель-фильтрации и сразу провели сквозной ЭПР-мониторинг всех фракций. При этом были выявлены два пика .
Профиль элгоции при гель-фильтрации отдиализованного препарата спин-меченого IgM на колонке с сефадексом G-25 (левая ордината), (б) то же (правая ордината). 10 - интенсивность центральной линии спектра ЭПР каждой фракции. I- интенсивность добавочной линии справа от центральной каждого спектра ЭПР. Gain - коэффициент усиления. Спектры записаны при постоянной амплитуде ВЧ модуляции 2 G. Фракции 13-19 пика I имеют спектры ЭПР, состоящие из одинаковых по форме трех широких линий разной интенсивности (рис.11, фракция 19). Это типичный спектр ЭПР чистого IgM-SL. В 20 и 21 фракциях пика I уже заметны изменения формы линии высокополышй компоненты спектра (рис.11).
Начиная с фракции 23, спектр резко меняется: в нем появляются три одинаковых по форме линии с чуть заметными добавочными линиями по обе стороны от центральной. В последующих фракциях (рис.Юа) спектр не меняется по форме, но добавочные две линии постепенно растут, а затем исчезают. Это уже «пятиполосный» спектр ЭПР, наиболее выразительно представленный на рис.10, фракция 30. Вместе с тем во фракциях 25-45 пика II (рис.Юа) обнаруживается наложение «пятиполосного» спектра ЭПР и спектра свободной SL, который имеет только три линии равной интенсивности (рис.11, фракция 47).
В чистом виде этот спектр проявляется во фракциях 47-56. Таким образом, приведенный выше анализ ЭПР мониторинга при гель-фильтрации позволяет сделать предположение, что «пятиполосный» спектр ЭПР обусловлен более низкомолекулярным фактором, поскольку выявлен главным образом во фракциях пика II (рис.Юа), где IgM-SL отсутствует. Мы назвали этот носитель этого «пятиполосного » спектра ЭПР «фактор 5».
Хотя из изложенного видно, что «фактор 5» в наших условиях не отделяется полностью от свободной SL в растворе, нам удалось показать его присутствие, как самостоятельной компоненты. Если построить зависимость отношения интенсивности добавочной линии к центральной в «пятиполосном» спектре по фракциям, то выявляется один единственный пик III (рис.106), максимум которого совпадает с максимумом «пятиполосного» спектра при мониторинге. Логично предполагать, что пик III и есть «фактор5».
Если спектр ЭПР бирадикала состоит из пяти линий, то фактически реализуется предельная ситуация сильного обмена между одинаковыми нитроксилами, время корреляции которых не превосходит 0.1 не. Такой бирадикал совершает переходы между двумя конформациями с одинаковыми временами жизни; в одной конформации обменный интеграл равен нулю и возникает спектр с тремя линиями, а в другой обменный интеграл в десятки раз превосходит величину изотропной константы сверхтонкого взаимодействия спина электрона со спином ядра азота в нитроксиле и возникают добавочные две линии ЭПР. Чем выше температура, тем больше частота обмена и тем больше добавочные две линии (рис.12). Этот процесс обратим.
Рассмотрим теперь в свете сказанного выше условия возникновения спин-спинового взаимодействия в SL-меченом "факторе 5". Очевидно, что оно возможно либо за счет взаимодействия нитроксилов от двух SL, включенных в ОГ и расположенных на взаимно близком расстоянии в пределах гликопептида (вариант I), либо в пределах одной ОГ, содержащей две SL (вариант 2), либо реализуются оба варианта одновременно. Поскольку "фактор 5" является, по-видимому, спутником IgM, логично предположить, что их ОГ имеют одинаковое или сходное строение. Тогда вариант 1 мог бы реализоваться при вхождении SL в концевые остатки N-Ac-Neu или Gal ОГ комплексного типа и/или в концевые остатки Man маннозобогатых ОГ. Поскольку SL входит в ОГ "фактора 5" даже при очень низкой концентрации NaI04, вначале представлялось вероятным, что это происходит за счет окисления наиболее лабильного остатка моносахарида в составе ОГ, а именно: N-Ac-Neu. Однако даже после практически полного ферментативного отщепления остатков N-Ac-Neu в исходном IgM, SL входит в "фактор 5" и спин-спиновое взаимодействие наблюдается. Таким образом, реализация варианта 1 возможна даже при отсутствии на концах ОГ остатка N-Ac-Neu. Не исключено, что ОГ "фактора 5" вообще не имеют концевых остатков N-Ac-Neu. Существование такого рода ОГ комплексного типа в Ig имеет место. К тому же не надо забывать о наличии в Ig маннозобогатых ОГ, которые также не имеют в своем составе остатков N-Ac-Neu, но могут окисляться NaI04, и, следовательно, "принимать" SL.
Вычисление спектров ЭПР спин-меченых макромолекул в составе монокристалла
Процедура расчета спектров ЭПР значительно усложняется, если в узлах решётки кристалла расположены молекулы белка, а спин-метка ковалентно привязана к боковому остатку белка [6,7,8]. В этом случае, очевидно, молекулы белка неподвижны, но спин-метка, как и ее ближайшее белковое окружение, может двигаться в потенциальном поле белка.
В любой спектроскопии существует проблема прямой и обратной задач. Прямая задача ЭПР спектроскопии (более узко: метода спин-метки) включает решение соответствующих уравнений для получения формы линии ЭПР спектра при определенном физическом состоянии образца. Обратная задача включает нахождение адекватной теории или физической модели, в рамках которой с помощью вычисленных параметров, рассчитывается теоретический спектр ЭПР сходный с экспериментальным. Обратная задача решается методом симуляции, т.е. путем расчета спектров ЭПР по выбранной модели поведения спин-метки. Обратная задача может решаться с привлечением методов имитации (симуляции) молекулярного движения на ЭВМ (метод молекулярной динамики (МД), метод броуновской динамики (БД) и динамический метод Монте-Карло (МК)). Методом молекулярной динамики рассчитывается траектория движения спин-метки, присоединенной к боковому остатку молекулы белка. По этим данным, используя конкретный вид спин-гамильтониана нитроксила рассчитывается спектр ЭПР.
При моделировании спектров ЭПР спин-меченых макромолекул необходимо выбрать модель быстрого движения спин-метки и учесть распределение по ансамблю. Наиболее простой (минимальной по числу параметров) моделью для симуляции спектров ЭПР является модель либрационного движения нитроксила (в пределах углов ±сс) вокруг оси R, направление которой в молекулярной системе координат нитроксила задается углами в, (р . Либрационное движение приводит к частичному усреднению тензоров А и g, которое наблюдается экспериментально.
Величину параметра упорядоченности Макконела SMCC можно получить из данных по зависимости спектров ЭПР от вязкости при постоянной температуре. Выбор параметров S, к, а задает частичное усреднение обоих тензоров (см. табл.1) согласно уравнениям (43). Второй шаг - усреднение положений нитроксилов по всему ансамблю спин-меченых молекул лизоцима во всем объеме кристалла белка. Весь ансамбль спин-меченых молекул разбивается на кластеры (скопления молекул). В каждом кластере питроксил имеет определенное положение по отношению к магнитному полю Н, то есть Qn Pi, с весом рув Ф-) (см. (42)). Для выбранных значений OQ,(PQ подбирается разброс величин #,-,# ,, т.е. дисперсии JQ И ст , соответственно, которые приведены в приведены также все необходимые параметры для расчета этих спектров.
Моделирование спектров ЭПР спин-меченых макромолекул в монокристаллах подробно описано в работе [42], Модель строится следующим образом. Весь ансамбль нитроксилов в составе спин-меченых молекул в образце разбивается на кластеры, в каждом из которых быстрое анизотропное движение нитроксила приводит к частичному усреднению магнитных тензоров (А и g). Важно подчеркнуть, что в отличие от аксиально симметричного тензора А, тензор g строго трехосный, поэтому положения центральных компонентов СТС спектра при перпендикулярной и параллельной ориентации оси Z нитроксила к направлению магнитного поля будут существенно различаться.
Наиболее вероятный кластер с величиной частично усредненной компоненты Az (соответствующей максимальному расстоянию 2А между крайними пиками спектра ЭПР) определяет положение молекулярной системы координат нитроксила X,Y,Z по отношению к кристаллографическим осям кристалла. В работе было показано, что в случае тетрагонального кристалла ось Z совпадает с направлением кристаллографической оси а. Разброс положения оси 2 нитроксила относительно направления магнитного поля Я задается двумерным распределением Гаусса, введение которого необходимо для объяснения аномальной ширины трех пиков, из которых состоит спектр ЭПР любого ориентированного нитроксила. С этой целью для адекватного совпадения модельных спектров с экспериментальными в программу моделирования спектров ЭПР нитроксильных радикалов квазипорошкового типа вводится двумерное распределение Гаусса по углам 0, р (2) с дисперсиями тв и т (где в,(р в данном случае определяют направление магнитного поля Я по отношению к осям X,Y,Z). Дисперсии 70 и а отражают разброс нитроксила по возможным состояниям (кластерам). Для упрощения, значения частично усредненных компонент магнитных тензоров в каждом кластере принимаются постоянными. Чтобы количественно оценить связь этих изменений с динамикой спин-метки и ее водно-белкового окружения, было проведено моделирование экспериментальных спектров ЭПР кристаллов Lyz-ffisl5-SLI при двух крайних значениях влажности: 100% и 40%. При моделировании все возможные состояния для угловых ориентации нитроксила задаются его взаимодействием с ближайшим окружением белка. Вероятность нахождения радикала в том или ином состоянии задается гауссовым распределением. Радикал в каждом кластере характеризуется частично усредненными значениями тензоров А и g, которые для простоты расчетов принимаются одинаковыми по всему ансамблю спин-меченых макромолекул. При моделировании были использованы исходные параметры главных компонентов А и g магнитных тензоров для спин-метки SLI и их частично усредненные величины А и , полученные при а = 65, S - 0.70, к - - 0.5:
Похожие диссертации на Быстрые движения боковых остатков в белках по данным методов молекулярной динамики и спин-метки
