Содержание к диссертации
Введение
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Взаимодействия азотистых оснований, нуклеозидов, нуклеотидов и полинуклеотидов
1.1 Комплементарные взаимодействия мономеров нуклеиновых кислот 10
1.2. Стэкинг-ассопиапия азотистых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов в водных растворах . 15
1.3. Внутримолекулярные взаимодействия и конфор-мапия гомополинуклеотидов 24
1.4. Взаимодействие нуклеиновых мономеров с гомополинуклеотидами 28
2. Применение метода спиновых меток для исследованиянуклеиновых кислот 40
2.1. Введение 40
2.2. Спин-меченые низкомолекулярные соединения нуклеотидной природы 44
2.3. Неспецифическое введение спиновых меток в гомополинуклеотиды, РНК и ДНК 45
2.4. Селективное спин-мечение тРНК 49
2.5. Физико-химические исследования спин-меченых нуклеиновых кислот 51
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Методика эксперимента 59
I. Спин-меченые нуклеозиды, нуклеотиды и поли нуклеотиды ...... 65
1.1. Синтез и-(2,2,5,5-тетраметил-3-карбонил-пирролин-І-оксил)-имидазола и его гидролиз в водных растворах 65
1.2. Синтез и некоторые свойства спин-меченых по 2'(3')-он группам рибозы нуклеозидов и нуклеотидов 69
1.3. Получение и свойства спин-меченых поли-рибонуклеотидов 77
1.4. Спин-меченые ДНК Т2 фага и суммарная тРНК из дрожжей 79
Изучение ассоциации нуклеозидов и нуклеотидов в водных растворах методом спиновых меток и тушения лвзминесценции 83
111.2.1. Исследование ассоциации адениловых нуклеотидов методом спиновых меток 83
111.2.2. Исследование ассоциации 2-аминопурин-рибозида, 2-аминопуринрибозид-5'-моно-и дифосфата методом спиновых меток и тушения люминесценции 100
111.3. Конформапионные изменения спин-меченых по 2'-он группам рибозы поли(А), поли(У) и поли(Ц) ИЗ
111.4. Исследование методом спиновых меток образования спиральных комплексов между полинуклеотидами и нуклеиновыми мономерами 122
111.4.1. Образование трехспирального комплекса 2 поли(У) І аденозин при разных температурах 122
111.4.2. Спиральные комплексы полиуридиловой кислоты с пиримидиновыми мономерами .... 135
стр. III.4.3* Исследование комплексообразования между
поли(У) и адениловыми нуклеотидами .... 149
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 164
ВЫВОДЫ 176
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 178
- Комплементарные взаимодействия мономеров нуклеиновых кислот
- Внутримолекулярные взаимодействия и конфор-мапия гомополинуклеотидов
- Спин-меченые нуклеозиды, нуклеотиды и поли нуклеотиды
Комплементарные взаимодействия мономеров нуклеиновых кислот
В конце 50-х годов Донохьго и Трублад /16,17/ показали, что четыре нуклеозида (аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин) могут образовать 29 водородно-связанных пар с двумя или тремя водородншли связями. Такое большое разнообразие возможных схем водородного связывания явилось стимулом для систематического изучения специфичности взаимодействия в различных парах оснований, термодинамических и кинетических закономерностей их образования. Встал вопрос о том, что же определяет уникальное комплементарное А»т(и) исс водородное связывание (рис.Іа,б) в двойной спирали Уотсона-Крика и имеют ли какое-либо биологическое значение комплементарные взаимодействия, отличные от уотсон-криковских.
Большую роль в изучении специфичности взаимодействия в парах азотистых оснований и их производных сыграли рентгеноструктурные исследования кристаллов, получаемых путем совместной кристаллизации этих соединений из органических растворителей /18-20/. Во всех кристаллах, образованных гуаниновыми и цитозиновыми производными (GC-кристаллы), найдено копланарное расположение оснований в элементарных ячейках, причем исключительно в соответствии с уотсон-криковской схемой водородного связывания (рис.Іа). В противоположность этому, в кристаллах, получаемых из различных адениновых и тимидиновых (урациловых) производных, обнаруживается несколько типов водородного связывания (рис.1в,г), во всех исследованных случаях отличающихся от уотсон-криковской схемы н-связывания в А а? парах. Естественно, что в кристаллических структурах расположениеоснований относительно друг друга определяется не только Н-связыванием, но и другими факторами, в частности межплоскостными взаимодействиями оснований, а также стереохимическими требованиями кристаллической упаковки. В этой связи можно утверждать, что в GC-кристаллах уотсон-криковское н-связьшание является доминирующим фактором, определяющим расположение оснований в элементарных ячейках, в то время как в АТ-кристаллах совокупность всех факторов приводит к энергетической невыгодности образования уотсон-криковс-ких пар.
Следует отметить, что рентгеноструктурные исследования, дающие ценную информацию о геометрических характеристиках водородно-связанных пар, а также о распределении электронной плотности на атомах оснований, не позволяют оценить энергетические параметры комплементационных взаимодействий. В этом отношении существенно больший интерес представляет исследование взаимодействий между различными основаниями и их производными в условиях, когда н-свя-зывание является единственным или доминирующим типом взаимодействия. Такая ситуация имеет место в растворах этих соединений в органических растворителях.
Основными методами исследования ассоциации оснований и их производных в органических растворителях являются ИК-, ЯМР- и УФ-спектроскопия. В ИК-спектрах азотистых оснований частота симметричных и антисимметричных колебаний НН2- и ин-групп (3500-2800 см"1), а также частота валентных колебаний с=о-групп ( 1700 см"1) существенно уменьшается при образовании водородно-связанных пар /21/. В спектрах ЯМР образование водородных связей проявляется в сдвиге в сторону более низких полей резонансных сигналов кн протонов гуаниновых и урациловых производных и NH2 протонов производных аденина и цитидина /22/. В УФ-спектрах образование водородно-связанных пар азотистых оснований проявляется в виде гипохромного эффекта, то есть уменьшения на 5-15$ оптической плотности смеси по сравнению с суммарным поглощением исходных компонентов /23/. Изучение изменения ИК-, ЯМР- и УФ-спектров различных пар оснований от их концентрации, соотношения концентраций компонентов, температуры позволяет не только определить схему их водородного связывания, но и получить термодинамические параметры взаимодействия -константу равновесия, изменение энтальпии и энтропии.
Внутримолекулярные взаимодействия и консрормация гомополинуклеотидов
В предыдущих разделах проанализирована имеющаяся к настоящему времени литература, касающаяся комплементарных и межплоскостных взаимодействий компонентов нуклеиновых кислот на мономерном уровне. Синтетические полинуклеотиды - поли(У), поли(А), поли(Ц) и поли(Г), содержащие в цепи лишь один тип азотистого основания, представляют собой простейшие полимерные системы, конформационные и динамические свойства которых определяются указанными выше взаимодействиями азотистых гетероциклов. Их конформация и ее изменение под действием тех или иных факторов интенсивно исследуется с помощью различных физико-химических методов /79-82/.
Полиуридиловая кислота при температурах выше комнатной представляет собой статистический клубок, по-видимому, с полным отсутствием стэкинг-взаимодействия уридиловых остатков в цепи /83-85/. Однако при понижении температуры в присутствии моновалентных катионов, таких как На+, Cs+, поли(У) образует упорядоченные шпиль-кообразные двухспиралыше структуры /84/, стабильность которых резко возрастает в присутствии двухвалентных катионов - Mg2+, этилендиамина и других /84,85/. Такие структуры, образующиеся в результате водородного связывания остатков уридина в пределах одной цепи, характеризуются кооперативным плавлением с узким интервалом перехода (дт = 3-5с). Калориметрические исследования плавления двухспиральной поли(У) в присутствии двухвалентных катионов /86/ показывают, что дн этого перехода составляет независимо от типа катиона 6,4 ккал/моль. В присутствии моновалентных катионов, согласно /87/, ДН = 2,1 ккал/моль пар оснований. Причина такого сильного различия энтальпии плавления двухспиральной поли(У) для случая моно- и дивалентных катионов до сих пор остается неясной.
Полиадениловая кислота, в отличие от поли(У), при нейтральных рН имеет довольно жесткую односпиральную конформацию с сильным стэкинг-взаимодействием адениловых гетероциклов в цепи /88-90/. Плавление односпиральной поли(А) характеризуется слабой коопера-тивностью и, как показано в работе /90/, дн этого процесса составляет 3,2 ккал/моль. При подкислении среды, в результате протонирования ш адениновых остатков, поли(А) образует двухспи-ральные структуры /78,91/ со схемой водородного связывания, представленной на рис.2А. Стабильность двухспиральной протонированной структуры поли(А) в существенной степени определяется электростатическим взаимодействием положительно заряженных остатков аденина с отрицательно заряженными фосфатными группами сахарофосфатной цепи.
Спин-меченые нуклеозиды, нуклеотиды и поли нуклеотиды
Материалы исследования. В работе использовались нуклеозиды, нуклеозид-5 -моно-, ди- и трифосфаты фирмы "Reanal" (Венгрия). Их чистота контролировалась с помощью бумажной хроматографии на Ватман-ЗММ в следующих системах:
1. Н.-бутанол, насыщенный водой - для нуклеозидов;
2. Этиловый спирт - I М ацетат аммония (75:30 по объему), рН 7,5 - для нуклеозид-5 -моно- и дифосфатов;
3. Изомасляная кислота - I М аммиак - ОД М этилендиамин-тетрауксусная кислота (100:60:0,1 по объему), рН 7,5 - для нук-леозид-5 -трифосфатов.
В этих же системах разделяли спин-меченые и немеченые нуклеозиды и нуклеотиды.
2-аминопуринрибозид и его 5 -моно- и дифосфат синтезировали в лаборатории проф. К.Л.Вежховского (Институт биохимии и биофизики ПАН, г.Варшава).
2,2,5,5-тетраметилпирролш-1-оксил-3-карбоновую кислоту синтезировали из ацетона и жидкого аммиака в последовательности реакций, описанных в монографии /136/. п -карбонилдиимидазол получали из фосгена и имидазола по методике, приведенной в /205/.
Полирибонуклеотиды - поли(А), поли(У), поли(Ц) - фирмы "Reanal" очищались от низкомолекулярных примесей путем исчерпывающего диализа против дважды дистиллированной воды. Их коэффициент седиментации, s20, составлял 4S, что соответствует молекулярному весу 30000.
Суммарный препарат тРБК дрожжей получен из Института органической химии СО АН СССР.
ДНК выделяли фенольним методом из концентрата фага Т2, выра - 60 ценного на культуре Е.СОІІ В. ДЛЯ ЭТОГО использовали свежеперег-нанный водонасыщенный раствор фенола, рН 8, очищенный от пере-кисных соединений. Фаговую суспензию аккуратно встряхивали в течение 30 мин с равным объемом фенола при 4С. Потом смесь центрифугировали 15 мин на центрифуге ЦЯР при 3000 об/мин, водный слой собирали и обрабатывали аналогичным образом еще 3 раза. Полученный раствор фаговой ДНК диализовали против 0,14 М НаСі в течение 5 суток на холоду до полного удаления фенола.
Спектрофотометрические измерения. Скорость гидролиза спиновой метки IT-(2,2,5,5-тетраметил-3-карбонилпирролин-1-оксил)-ими-дазол в зависимости от рН и температуры измеряли на спектрофотометре СФ-4, с термостатируемым кюветодержателем, по исчезновению полосы поглощения при Я = 240 нм.
УФ-спектры спин-меченых нуклеозидов, нуклеотидов и полинук-леотидов измеряли на спектрофотометрах Specord и Сагу 118. Для определения концентрации полирибонуклеотидов в водных растворах использовали следующие коэффициенты экстинкции при нейтральных значениях рН: поли (А) - Sg нм = Ю,5«103 М «см , поли (У) -6260 нм = 9,2-Ю3 М -см"1 и поли(Ц) - 267 ш = 6,6-103 М"1. см"1 /206/.
Спектрофотометрическое и потенциометрическое титрование по-лицитидиловой кислоты проводили, соответственно, на спектрофотометре VSU-2P и рН-метре ЛПУ-01.
ЭПР-измерения. Спектры ЭПР регистрировали на ЭПР-спектромет-ре 3 см диапазона РЭ 1306, соединенном с многоканальным анализатором LP-4050 (Финляндия) и снабженном термостатирующим блоком, позволяющим поддерживать постоянную температуру в резонаторе с точностью +0,5С. Условия записи спектров ЭПР в большинстве случаев были следующими: СВЧ-мощность - 5 мвт, амплитуда ВЧ-модуля-пии - 0,5 гс, скорость развертки магнитного поля - 0,5 гс/сек, постоянная времени - 0,1 сек, время регистрации спектра - 8 мин. Исследуемые образцы помещались в кварцевые капилляры с внутреннигл диаметром 0,5 мм.
