Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Клетки иммунной системы, их роль в регуляции иммуноло гических реакций ... 13
1.1. Функциональные особенности клеток иммунной системы 13
1.2. Основные рецепторы на поверхности иммуноцитов 21
1.3. Общая характеристика цитокинов. Роль фактора некроза опухоли в иммунологических реакциях 27
1.4. УФ-индуцированные изменения структурного и функционального состояния иммуноцитов 33
ГЛАВА 2. Система комплемента: особенности строения, функционирования и регуляции активности С4 компонента 38
ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования 47
3.1.Объекты исследования 47
3.2. Методы исследования 47
3.2.1. Выделение лимфоцитов из крови человека 47
3.2.2. Получение Т-лимфоцитов 48
3.2.3. Выделение макрофагов из перитонеальной жидкости мыши 48
3.2.4. Получение супернатанта иммуноцитов 48
3.2.5. Выделение нейтрофилов из крови человека 49
3.2.6. Получение сыворотки крови 50
3.2.7. УФ-облучение исследуемых образцов 50
3.2.8. Инкубация макрофагов с фактором некроза опухоли а 51
3.2.9. Метод иммуноферментного анализа для изучения процессов взаимодействия С4 фактора комплемента с мембранами иммуноцитов 51
3.2.10. Метод иммунофлуоресценции для изучения структурных свойств мембран иммуноцитов . 53
3.2.11. Определение функциональной активности С4 фактора системы комплемента методом гемолитического титрования 54
3.2.12. Регистрация и анализ ИК-спектров белка С4 55
3.2.13. Регистрация электронных спектров поглощения белка С4 57
3.2.14. Проведение диск-электрофореза в полиакриламидном гелебелка С4 57
3.2.15. Измерение буферной емкости и снятие кривых титрованиябелка С4 58
3.2.16. Получение лимфоцитарных и макрофагальных лизатовдля определения концентрации фактора некроза опухоли а и цитоток сической активности макрофагов 60
3.2.17. Метод иммуноферментного анализа для определения концентрации ФНОа в лизатах Т-лимфоцитов 61
3.2.18. Измерение интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции иммуноцитов 62
3.2.19. Метод определения ТБК-активных продуктов в суспензии лимфоцитов 63
3.2.20. Определение пероксидазной активности лимфоцитов 66
3.2.21. Определение супероксиддисмутазной активности лимфоцитов методом люминолзависимой хемилюминесценции 67
3.2.22. Определение цитотоксической активности макрофагов 68
3.2.23. Определение жизнеспособности макрофагов с помощью трипа-нового голубого 69
3.2.24. Статистическая обработка результатов экспериментов 69
ГЛАВА 4. Влияние УФ-света на процесс взаимодействия С4 фактора системы комплемента с мембранами иммуноцитов 70
4.1. Взаимодействие С4 фактора системы комплемента с мембранами лимфоцитов и макрофагов в условиях УФО 70
4.1.1. Влияние УФ-света на функциональное состояние мембраносвя-занногоС4 72
4.1.2. Влияние УФ-света на структурное состояние CR1 -рецепторов с лигандированным С4 на поверхности лимфоцитов и макрофагов 76
4.1.3. Взаимодействие фотомодифицированных иммуноцитов с сывороточным С4 80
4.1.4. Влияние УФ-света на гемолитическую активность белка С4 S7
4.1 .5. Влияние УФ-света на сгруктурно-функциональное состояние сывороточного С4 89
4.2. Взаимодействие С4 компонента комплемента с мембранами нейтрофилов крови человека в условиях УФО 99
4.3. Определение роли фотомодификаций белка С4 и мембран имму-ноцитов в изменение антителосвязывающей способности изучаемых систем 105
ГЛАВА 5. Анализ УФ-ішдуцировашшх структурных модификаций С4 белка системы комплемента 107
5.1. Влияние УФ-света на ИК-спектральные характеристики С4 белка системы комплемента 107
5.2. Электронные спектры поглощения УФ-облученных растворов С4 109
5.3. Электрофоретические характеристики фотомодифипированного белка С4 110
5.4. Влияние УФ-света на буферную емкость растворов белка С4 114
ГЛАВА 6. Влияние УФ-света на некоторые функциональные свойства лимфоцитов крови человека 121
6.1. Уровень продукции фактора некроза опухоли а Т-лимфоцитами в условиях УФ-облучения 121
6.2. Изучение процессов ПФОЛ, протекающих на мембранах лимфоцитов 124
6.2.1. Влияние УФ-света на хемилюминесцентные свойства лимфоцитов 125
6.2.2. Дозовая зависимость накопления ТБК-активных продуктов в суспензии лимфоцитов в условиях УФ-облучения 131
6.3. Влияние УФ-света на ферментанивную активность лимфоци тов 133
6.3Л. Влияние УФ-света на пероксидазную активность лимфоцитов134
4 6.3.2. Влияние УФ-света на супероксиддисмутазную активность лим фоцитов 140
ГЛАВА 7. Исследование сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов 143
7.1. Изменение цитотоксической активности макрофагов в условиях УФ-облучения 143
7.2. Исследование сочетанного действия УФ-света и ФНОа на уровень спонтанной хемилюминесценции макрофагов 147
7.3. Исследование уровня жизнеспособности УФ- и цитокинмоди-фицированных макрофагов с помощью красителя трипанового голубого.. 148
7.4. Влияние сочетанного действия УФ-света и ФНОа на фагоцитарную активность макрофагов 150
7.5. Влияние сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли на состояние CR1 -рецепторов с лигандированным С4 на поверхности макрофагов 162
7.6. Изучение сочетанного действия УФ-света и ФНОа на супероксид-дисмутазную активность макрофагов 167
7.7. О процессах, ответственных за изменение функциональной активности фото- и цитокинмодифицированньгх макрофагов 169
Заключение 172
Выводы 179
Список литературы 182
Приложение 208
- Основные рецепторы на поверхности иммуноцитов
- Получение супернатанта иммуноцитов
- определения ТБК-активных продуктов в суспензии лимфоцитов
- Определение роли фотомодификаций белка С4 и мембран имму-ноцитов в изменение антителосвязывающей способности изучаемых систем
Введение к работе
і»
Актуальность проблемы. Функционирование иммунной системы контролируется сложной сетью взаимосвязанных информационных сигналов, опосредуемых факторами неспецифического гуморального звена иммунитета. Их продукция и направленное действие на конкретные клетки-мишени определяются сложными молекулярно-клеточными механизмами. Примером тому может служить система комплемента, играющая важную роль в нормальной и патологической физиологии человека. Белки комплемента обеспечивают опсонизацию и лизис чужеродных клеток, участвуя таким образом в формировании иммунного ответа. Связывание активных субфрагментов комплемента со специфическими клеточными рецепторами приводит к локальной модуляции физиологических процессов, координации функциональ-
* ной активности и кооперации иммуноцитов, что направлено на поддержание
местного гомеостаза. В то же время, клеточные рецепторы комплемента, например CRI -рецептор, являются естественными регуляторами активности самого комплемента.
Помимо системы комплемента в процессах иммунорегуляции задействованы и другие факторы гуморального звена иммунитета, в частности, ци-токины, обеспечивающие согласованное функционирование различных типов иммунокомпетентных клеток в процессе индукции развития иммунных
, реакций. Цитокнны секретируются многими клетками и представляют собой
единую-систему регуляции иммунных процессов, процессов воспаления, а также роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности.
Большинство цитокинов обладает плейотропным действием, сопровождающимся модуляцией различных функций, что позволяет рассматривать их как общую систему гомеостатической регуляции клеточной функции, часть сложнейшей цепи взаимосвязанных сигналов, обеспечивающих слаженную работу различных систем в живом организме. Наряду с выполнени-
Ч ем специфических функций внутри иммунной системы цнтокины формиру-
ют сеть коммуникационных сигналов и осуществляют межсистемные связи [67, 88]. Такой многофакторный контроль функций иммунной системы орга-
низма, осуществляемый цитокинами, необходим для повышения надежности и обеспечения вариабельности реакций организма в зависимости от характера агента, вызывающего эти реакции.
В современной медицине для лечения ряда заболеваний используются рекомбинантные цитокины, в частности фактор некроза опухоли а [35, 41, 42, 140]. Его мощное биологическое влияние на иммуногенез, воспалительные процессы и опухолевые клетки позволяет считать фактор некроза опухоли (ФНОа) многообещающим средством иммунотерапии онкологических, воспалительных, инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также при иммунодефицитах, трансплантации органов и тканей [134].
Несмотря на широкие перспективы использования ФИО в клинике, необходимо решить ряд проблем, связанных с подбором терапевтических концентраций, трудностью прогнозирования и контроля реакции организма на цитокиновую терапию.
Нарушения продукции цитокинов продуцирующими клетками, а также процессов взаимодействия гуморальных факторов со специфическими рецепторами иммуноцитов могут лежать в основе формирования патологии на молекулярно-клеточном уровне. В связи с этим изучение межклеточных и клеточно-гуморальных взаимодействий, опосредуемых различными зффек-торными молекулами, может внести существенный вклад в понимание патогенеза и привести к поиску новых способов регуляции и повышения эффективности функционирования отдельных звеньев иммунной системы.
Одним из возможных регуляторов процессов взаимодействия между клеточными и гуморальными факторами иммунитета является УФ-свет. Рядом авторов показано, что клеточные и гуморальные компоненты крови, подвергнутые УФ-облучению в физиологических дозах, могут оказывать регулирующее действие на иммунную систему организма в целом. Известно, что УФ-свет индуцирует быстрые структурно-функциональные изменения поверхностных структур иммуиокомпетентных клеток [21, 23, 43, 113, 247, 264], белков системы комплемента [2,3,30-32], уровня цитокинов 1121,229].
Несмотря на большое количество экспери ментальных данных, молекулярные механизмы регуляторного действия УФ-света на клеточные и гуморальные компоненты иммунной системы раскрыты недостаточно. Практиче-
\ ски не учитывается роль конформационных изменений макромолекул в оп-
ределении степени фотомодификации сывороточных факторов, в частности отдельных белков системы комплемента. Кроме того, в литературе практически отсутствуют работы, посвященные анализу взаимосвязи структурно-функциональных фотомодификаций иммунокомпетеитных клеток крови с процессами их взаимодействия с различными факторами гуморального иммунитета, такими как белки системы комплемента и цитокины. Знания об общих закономерностях и механизмах действия УФ-излучения на клеточные и гуморальные звенья иммунной системы позволят разработать научно-обоснованный теоретический фундамент практического использования УФ-света в медицине.
Представляется интересным также изучение возможности регулирования иммунологических процессов сочетанным действием на компоненты иммунной системы естественных модуляторов физической и химической природы (к примеру, УФ-света и фактора некроза опухоли). В частности, используя различные концентрации ФНОа, являющегося медиатором острой фазы воспаления, можно решить ряд проблем, связанных с повышением эффективности применения метода АУФОК при лечении воспалительных процессов различной степени тяжести.
Изучение механизмов, лежащих в основе регуляторного действия УФ-света и ФНОа на иммунокомпетентные клетки, позволит выявить причины
/. возникновения патогенеза и возможность их применения с целью иммуно-
коррекции и иммунотерапии.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение регуляторного действия УФ-света на структурно-функциональное состояние иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтро-филов) при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы,
В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:
Щ ІлИзучшь влияние УФ-света (240-390 им, 7 5,5*2265 Дж/м2) на процесс
взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофи-лов) с С4 фактором системы комплемента;
2. Исследовать структурно-функциональные фотомодификации С4
компонента комплемента;
Изучить ФНО-іфодуцирующую способность Т-лимфоцитов и цито-токсическую активность макрофагов в условиях УФ-облучения;
Оценить вклад процессов пероксидного фотоокисления липидов в изменение супероксиддисмутазной и пероксидазной активности фотомоди-фицированных лимфоцитов;
Выявить влияние сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов.
Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению регуляторного действия УФ-света на функциональную активность иммуноцитов по отношению к С4 фактору системы комплемента иФНОа.
Впервые изучено влияние УФ-света на взаимодействие мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором системы комплемента и выявлены основные закономерности, обусловливающие данный процесс. Показано, что структурно-функциональные фотомодификации мембран иммуноцитов обусловлены «кэппинг»-эффектом рецепторов с ли-гандированным СА фактором комплемента. Разработана схема УФ-индуцированных структурно-функциональных изменений С4 компонента комплемента.
Выявлено иммунокоррегирующие действие УФ-света на уровень продукции фактора некроза опухоли а Т-лимфоцитами, конечный эффект которого определяется исходной концентрацией цитокина и дозой УФ-света. Обнаружена взаимосвязь ФНО-продуцирующей способности лимфоцитов и ци-тотоксической активности макрофагов с уровнем генерации активных форм кислорода. Исследовано влияние процессов пероксидного фотоокисления липидов на уровень каталитической активности связанной с мембранами лимфоцитов пероксидазы.
Установлено, что УФ-свет и фактор некроза опухоли а оказывают ре-гуляторное действие на фагоцитарную активность макрофагов. Обсуждается вклад различных процессов (пероксидного фотоокисления липидов, активно-
ста НАДФН-оксндазы и супероксиддисмутазы, состояния CR1 клеточного рецептора) в изменение фунюшонального потенциала фото- и ФИО модифицированных макрофагов.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о молекулярно-клеточном механизме регуляторного действия УФ-света на отдельные звенья иммунной системы.
Фотоиндуцированные изменения структурно-функциональных свойств мембран нммуноцитов и отдельных компонентов комплемента необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выяснения механизмов действия УФ-света на молекулярно-клеточном уровне. Полученные экспериментальные данные позволяют выявить общие закономерности регуляторного действия УФ-света на процесс взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором комплемента.
Эксперименты с использованием фактора некроза опухоли а позволяют разработать новые подходы к иммунокоррекции патологических состояний организма при проведении фармакотерапии и определить возможность применения метода АУФОК на различных стадиях воспалительного процесса с целью повышения эффективности его использования.
Предложенная схема регуляторного действия УФ-света и ФНОа на функциональные свойства макрофагов может быть полезна для понимания молекулярных механизмов иммунокоррегирующего действия метода АУФОК.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (СПб., 2000); IV Съезде по проблемам радиационной биологии (Москва, 2001); Ш Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); ХУШ съезде физиологического общества им. И, ГХ Павлова (Казань, 2001); УШ международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «Оли-гомеры-2002» (Черноголовка, 2002); ГУ международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2002); УП Путинской школе-
конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); Ш и IV международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002; СПб., 2003);. Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2002, 2003,2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 8 тезисов, в том числе 3 статьи в реферируемых изданиях.
На зашиту выносятся следующие положения:
УФ-свет (240-390 нм) в дозах 75,5-^2265 Дж/м2 индуцирует снижение антителосвязывающей способности С4 компонента комплемента в системе из взаимодействующих иммуноцитов и белков системы комплемента, обусловленное как структурно-функциональными фотомодификациями клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови.
УФ-индуцированные структурные модификации белка С4 связаны с процессом разворачивания белковой молекулы, сопровождающимся увеличением числа ароматических аминокислот и ионогенных групп на поверхности белковой молекулы.
УФ-излучение в дозах 75,5-^2265 Дж/м2 оказывает коррелирующее действие на ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов, эффект которого в значительной степени определяется исходной концентрацией цито-кина, уровнем генерации активных форм кислорода и дозой УФ-света.
4. Интенсификация процессов пероксидного окисления липидов на
мембранах фотомодифшщрованных лимфоцитов способствует повышению
их супероксиддисмутазной и пероксидазной активности, а также снижению
каталитической активности связанной с клетками экзогенной пероксидазы.
УФ-излучение в дозах 75,5-^2265 Дж/м2 вызывает разнонаправленные эффекты в отношении цитотоксической и фагоцитарной активности макрофагов. Сочетанное действие УФ-света и фактора некроза опухоли а оказывает модулирующий эффект на функциональное состояние макрофагов.
Схема возможных регуляторних процессов, протекающих при соче-танном действии УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов.
Структура и объем диссертапии. Диссертационная работа включает 208 страниц машинописного текста, 24 таблицы, 42 рисунка. Состоит из введения, семи глав, заключения, выводов и приложения. Список литературы содержит 287 работ, из них 139 отечественных и 148 зарубежных.
Основные рецепторы на поверхности иммуноцитов
Рецепторы цитогшазматической мембраны представляют собой, как правило, белки или гликопротеины, располагающиеся на мембране и характеризующиеся высокой степенью сродства к биологическим веществам широкого спектра действия. Большое количество рецепторов, расположенных на плазматической мембране иммуноцитов, играет важную роль в регуляции распознавательной и эффекторной функции клеток. В качестве лигандов ре-цепторы связывают антигены, иммуноглобулины, компоненты системы ком-племента, медиаторы иммунного ответа» различные гормоны. На В-Лймфоцитах обнаружены Fc-рецепторы к иммуноглобулинам всех классов, за исключением IqD. Fc-рецепторы В-лимфоцитов играют важ ную роль в дегрануляции тучных клеток и базофнлов, в высвобождении из клеток растворимых медиаторов воспаления, в регуляции активации В-клеток Т-лимфоцитами, в пусковых стадиях фагоцитоза опсонизированных клеток в иммуноглобулиновой регуляции, выработки антител на уровне В-лимфоцитов. На Т-лимфоцитах человека найдены Fc-рецепторы для иммуноглобулинов IgG и IgM. Первые характерны для Т-супрессоров, вторые -для Т- хелперов [104]. v Fc-рецепторы фагоцитов способны связывать иммунные комплексы и тем самым облегчать фагоцитоз патогенных агентов, которые соединились со специфическими антителами против их антигенов [200]. Через Fc-рецептор опосредуется индукция иммунными комплексами: респираторного взрыва, продукции супероксидных радикалов в фагоцитах, синтеза и секреции ими цитокинов, лизосомных ферментов, антителозависимая клеточная цитоток-сичность [279]. На нейтрофилах экспрессированы FcRII (CD32) и FcRIH (CD16) рецепторы, на макрофагах - FcRI (CD46), FcRII и FcRHI [277,278]. Fc-рецепторы - гликопротеины с молекулярной массой около 5000-6000 Да. Не исключено, что Fc-рецепторы состоят из нескольких идентичных субъединиц, связанных дисульфидными мостиками или нековалентно [9]. /Ь
Все популяции Т-лимфоцитов, как эффекторных, так и регуляторных, несут на своей поверхности Т-клеточный рецептор для антигена (TCR). Этот рецептор не имеет иммуноглобулиновой природы, поскольку клетки Т-ряда не способны синтезировать иммуноглобулины. Выявлены два различных типа TCR, оба - гетеродимеры, состоящие из двух соединенных дисульфидными связями полипептидных цепей. Оба рецептора ассоциированы на клеточной поверхности с пятью полипептидами СБЗ-комплекса, образуя вместе с ним рецепторний комплекс Т-клетки: Показано, что TCR (TCR/CD3) принимает участие в продукции супероксид-аниона и пероксида водорода [153, 180]. На В-лимфопитах и моноцитах/макрофагах экспрессированы антигены \{ МНС класса ТІ, которые важны для кооперативных взаимодействий с Т клетками, для презентации антигена CD4+ Т-хелперам. Молекулы МНС П яв ляются интегральными белками клеточной мембраны, гетеродимерами, состоящими из двух гликопротеиновых цепей: аир [260]. На клетках имеется четыре вида рецепторов для комплемента: CR1, CR2, CR3, CR4. Рецепторы отличаются друг от друга по структуре и локализованы на разных мембранных молекулах. Рецепторы для комплемента обнаружены на эритроцитах, полиморфноядерных лейкоцитах, моноцитах/макрофагах, лимфоцитах, тучных клетках и подоцитах почечных клубочков. Рецепторы играют роль в элиминации иммунных комплексов, усилении фагоцитоза, антителозависимой клеточной цитотоксичности, хемотаксисе, «респираторном» взрыве фагоцитов, секреции и пролиферации В-клеток. Система рецепторов к комплементу играет важную роль в контроле бактериальных инфекций, способствует связыванию и последующему фагоцитозу комплементсодержащих комплексов с высвобождением лизосомных ферментов [129]. CR1 рецептор (C3b/C4b, CD35) экспрессирован на лимфоцитах, ней-трофилах, моноцитах/макрофагах, эритроцитах, связывает в качестве лиган-дов СЗЬ, iC3b, C4b, C5b и принимает участие в иммуноадгезии [196, 198]. CR1 несут 5-25% периферических Т-лимфоцитов, 60-80 % незрелых В-клеток и все зрелые периферические В-лимфоциты. В среднем количество молекул CR1 составляет 40000 Да на В-лимфоцитах, нейтрофилах, моноцитах и 500 на эритроцитах. Рецептор CR1 - одноцепочечный гликопротеин с молекулярной массой 160000-290000 Да [191]. Субфрагменты СЗЬ и ІСЗЬ оказывают опсонизирующее действие, то есть способствуют фагоцитозу бактерий, на поверхности которых идет активация системы комплемента. Такие опсонизированные комплементом бактерии прикрепляются к фагоцитирующим клеткам через CR1 рецепторы, легче захватываются и перевариваются фагоцитами. CR1 выполняет ряд биологических функций: - ингибирует активацию комплемента, связываясь с СЗЬ и С4Ь и увеличивая тем самым скорость диссоциации обеих СЗ-коывертаз (классического и альтернативного механизма); - в процессе расщепления СЗЬ и С4Ь он выступает в роли кофактора фактора I; - на эритроцитах обеспечивает клиренс СЗ-содержащих иммунных комплексов и опосредует их транспорт в селезенку, где комплексы разрушаются фагоцитами; - вместе с рецептором CD2 участвуют в активации В-лимфоцитов комплементом; влияет на секрецию гистамина и фагоцитоз бактерий, опсонированных СЗЪ [227, 275]. Рецептор CR2 (CD21), экспрессируемый В-лимфоцитами, дендритными и эпителиальными клетками, связывает ІСЗЬ, C3dg, ИНФ-а и вирус Эп-штейна-Барр. На В-лимфоцитах CR2, по-видимому, функционирует как вспомогательный рецептор при специфическом иммунном ответе.
Связывание с ним ІСЗЬ и C3dg снижает порог сигнала для активации В-лимфоцитов, происходящей в результате связывания антигена с их антигенспецифичными рецепторами. Рецептор CR2 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 145000 Да, состоящий из одной полипептидной цепи (молекулярная масса 110000 Да) и 8-11 N-связанных олигосахаридов [104, 230]. CR3 (CDllb/18) присутствует на полиморфонуклеарах, моноцитах, К-клетках и естественных киллерах и служит важным рецептором и молекулой межклеточной адгезии. Он опосредует фагоцитоз частиц, опсонизированых ІСЗЬ, и, кроме того, функционирует как лектин, способный связывать некоторые углеводы. Рецептор CR3 - мембранный гликопротеин, состоящий из двух нековалентно связанных полипептидных цепей: а-цепи (молекулярная масса 180000 Да) и Р-цепи (молекулярная масса 90000 Да) [16].
Получение супернатанта иммуноцитов
Метод получения Т-лимфоцитов основан на различной степени адгезии лимфоцитов на волокнах нейлоновой ваты. В качестве колонки использовали пластиковые трубки диаметром 5 мм и длиной 6-8 см. 50 мг ваты тщательно разволакивали, набивали ею колонку и промывали 10-15 мл раствора Хенкса. Затем по каплям в колонку приливали 0,5 мл суспензии лимфоцитов в концентрации 2-Ю6 клеток/мл. После этого колонку помещали в горизонтальное положение и инкубировали 30 минут при 37 С.
По окончании инкубации колонку промывали 5 мл раствора Хенкса. [38]. Концентрация полученной суспензии Т-лимфоцитов составляла 2-Ю4 клеток/мл. Чистота полученной суспензии Т-лимфоцитов - 93 %, что проверялось с помощью метода розеткооб-разования [47]. В работе использовали мышей-самцов линии SHK массой 25-30 г. Мышь декапитировали, закрепляли в ванночке с парафином и протирали брюшко спиртом. Слева и справа от нижней части брюшка делали два надреза, разрезали кожу до верхней части грудной клетки и снимали ее с брюшка. С помощью шприца внутрибрюшинно вводили 1,5 мл раствора Хенкса и 1,5 мл воздуха и, надавливая на брюшную полость, размешивали жидкость. Пе-ритонеальную жидкость собирали при помощи шприца в стерильную пробирку, в которую предварительно добавляли 1-1,5 мл раствора Хенкса. Процедуру повторяли 2-3 раза. Полученную суспензию центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, супернатант отбирали, осадок отбивали от стенок пробирки шейкированием, доливая 2 мл среды RPMI-1640. Для подсчёта клеток смешивали 100 мкл трипанового синего, 100 мкл эозина и 100 мкл макрофагов [103]. Чистота полученной суспензии макрофагов составляла 96 %. В работе использовали концентрации макрофагов 2-Ю6 клеток/мл и 2-Ю5 клеток/мл. Операции по выделению клеток проводили в стерильных условиях. Для получения супернатанта клетки (лимфоциты, макрофаги) лизиро-вали путем смешивания 1 мл суспензии иммуноцитов с I мл дистилирован ной воды, охлажденной до +4 С.
Смесь оставляли в холодильнике на 30 минут, затем проводили центрифугирование при 3000 об/мин на центрифуге MPW-34C в течение 40 минут для осаждения мембран. Супернатант отбирали из надосадочного слоя. Нейтрофилы выделяли центрифугированием донорской крови на двойном градиенте плотности фиколл-урографина (р=1,077 и 1,119 г/мл) [7]. Для этого готовили рабочие растворы: 1) 7„64 г фиколла, 20 мл 76 % раствора урографина, 92,56 мл дистили-рованной воды (р= 1,077 г/мл) - раствор №1. 2) 2,74 г фиколла, 10 мл 76 % раствора урографина, 35,6 мл дистилиро-ванной воды (р=1Д19 г/мл) - раствор №2. К 3 мл гепаринизированной крови (20 Ед/мл) добавляли раствор Хен-кса в соотношении 1:1. В центрифужную пробирку вносили 1 мл раствора №2, осторожно наслаивали 1 мл раствора №1 на раствор №2. Затем на двойной градиент фиколла-урографина наносили разбавленную кровь. Центрифугировали в течение 40 минут при 3000 об/мин на центрифуге MPW-340. Наблюдали три хорошо выраженные фракции (рис. 2): 1) фракция на границе плазмы и раствора №1, состоящая из моноцитов, лимфоцитов и кровяных пластинок; 2) фракция на границе растворов №1 и №2, состоящая из нейтрофилов; 3) эритроциты. Полученную фракцию нейтрофилов центрифугировали в избытке раствора Хенкса в течение 10 минут при 1000 об/мин на центрифуге MPW-340. Отмытые нейтрофилы суспензировали раствором Хенкса до рабочей концентрации 105 клеток/мл. Для проверки чистоты полученной суспензии нейтрофилов делали мазки, которые затем окрашивали по методу Романовского-Гимзе [47]. В полученной клеточной суспензии нейтрофилы составляли 93 % всех клеток, 5 % приходилось на долю лимфоцитов и около 2 % на долю моноцитов. Источником человеческой сыворотки явилась кровь доноров. Цельную кровь (без добавления антикоагулянта) отбирали в сухую стерильную посуду и оставляли на 2-3 часа при +4 С до образования кровяного сгустка. После ее центрифугирования в течение 15 минут при 1500 об/мин на центрифуге MPW-340, супернагант отбирали в чистую сухую пробирку. Для получения мышиной сыворотки мышь декапитировали, как описано в разделе 3.2.3. Кровь собирали в пробирку, содержащую гепарин (20 Ед/мл) в 0,9 %-ном р-ре КаС1 и проводили центрифугирование в течение 10 минут при 1500 об/мин.
Полученную сыворотку отбирали в пробирку. УФ-облучение суспензии иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов в соответствующих опыту концентрациях), сыворотки крови доноров и мыши (в соответствующих разведениях) и буферных растворов белка С4 в концентрации 10"6 моль/л объемом 2 мл (белок С4) и 4 мл (клетки и сыворотка) проводили в стеклянной термостатируемой (20±1 С) полусферической формы кювете (площадь облучаемой поверхности 10"3 м2) при по
определения ТБК-активных продуктов в суспензии лимфоцитов
Метод определения ТБК-активных продуктов характеризует концентрации вторичных продуктов окисления в ненасыщенных кислотных компонентах липндов, в частности концентрацию малонового диальдещда (МДА) [17, 19]. В основе метода лежит реакция между МДА и тиобарбитуровой кислотой (ТБК), протекающая в кислой среде при высокой температуре с об 1. Нативную или УФ-облученную суспензию лимфоцитов в концентрации 2-Ю клеток/мл объемом 2 мл помещали в центрифужные пробирки и осаждали белок добавлением 2 мл 17 %-ного раствора трихлорук-сусной кислоты (ТХУК). Образующийся осадок отделяли центрифугированием в течение 20 минут при 4000 об/мин. на центрифуге MPW-340. 2. Надосадочную жидкость по 2 мл переносили в пробирки и добавляли по 1 мл 1н НС1 и 1 мл 0,8 %-ного раствора ТБК. 3. Пробы помещали на 30 минут в кипящую водяную баню до появления розовой окраски. 4. У охлажденных до комнатной температуры проб измеряли оптическую плотность при 532 нм на спектрофотометре СФ-46. В качестве контроля брали пробу, содержащую вместо надосадочной жидкости равный объем буфера PBS. Концентрацию ТБК-активных продуктов (ХЕК-АЛ) рассчитывали по закону Бугера-Ламберта-Бера, используя приведенное выше значение молярного коэффициента экстинкции; О кинетике ПОЛ судили, регистрируя накопление ТБК-активных продуктов через 1 и 3 часа после УФ-облучения. Определение ферментативной активности свободной и связанной с лимфоцитами пероксидазы проводили спектрофотометрическим методом, а также при помощи твердофазного иммуноферментного анализа. При использовании спектрофотометрического метода в каждую лунку титровального планшета вносили по 50 мкл заранее проинкубированной в течение 30 мин. смеси нативных или УФ-модифицированных лимфоцитов (2-10 клеток/мл) и пероксидазы (5-Ю 9 моль/л) в объемном отношении 1:1, а также отдельно лимфоциты и пероксидазу, разведенные PBS в объемном отношении 1:1.
Методика проведения ИФА предусматривала последовательное нанесение на поверхность 96-луночных полистироловых планшет 50 мкл суспензии нативных или фотомодифицированных лимфоцитов в концентрации 2-10 клеток/мл, 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA), раствора пероксидазы хрена (Pfa, производство «Reanal», Венгрия) в концентрации 5-10"9 моль/л в фосфатно-солевом буфере (PBS, рН 7,4), их инкубацию в течение 30 минут при 37 С. Отмывку несвязавшихся компонентов производили PBS (ОД моль/л, рН 7,4) после каждой стадии инкубации. В качестве субстрата для определения каталитической активности пероксидазы в обоих случаях использовали орто-фенилендиамин (OPD) [118]. При этом в каждую лунку планшета вносили по 50 мкл субстратной смеси, включающей в себя 5%-ный раствор Н2О2 и хромоген OPD в фосфатно цитратном буфере (рН 5,0). Через 10 минут проводили остановку ферментативной реакции 100 мкл 20%-го раствора H2SO4. О концентрации окрашенного продукта реакции (окисленной формы OPD) судили по величине оптической плотности исследуемой системы при длине волны 492 нм, регистрируемой на спектрофотометрическом ИФА-анализаторе «Multiscan Titertec plus». В основу использованного метода положено ингибирование фотоинду-цированной, опосредованной супероксидными анион-радикалами, хемилю-минесценции при окислении люминола в присутствии образцов, содержащих супероксиддисмутазу [111]. В кювету хемилюминометра последовательно вносили 0,1 мл натрий-фосфатного буфера (0,05 моль/л, рН 7,4), 0,1 мл раствора тетраметилэтилен-диамина (ТЕМЭД, 0,05 моль/л) в натриевой соли этилендиаминтетраацетата (ЭДТА, 0,2 ммоль/л), 0,4 мл дистилированной воды, 0,1 мл супернатанта исследуемых иммуноцитов (лимфоцитов и макрофагов) и 0,2 мл раствора рибофлавина (0,034 ммоль/л).
В контрольную пробу вместо образца вносили такой же объем дистилированной воды. Реакцию инициировали облучением лампы видимого света (100 Вт) на расстоянии 20 см в течение 60 секунд. За 10 секунд до истечения времени облучения вносили 0,1 мл раствора люминола (0,25 ммоль/л). После облучения кюветное отделение перемещали в рабочее положение перед фотокатодом фотоэлектронного умножителя ( 1 с) биохемилюминометра БХЛ-06 М и регистрировали вспышку хемилюминес-ценции. СОД-активность (А) оценивали в процентах по формуле: где 1к - интенсивность ХЛ в контрольной кювете, 1о - интенсивность ХЛ в опытной кювете.
Цитотоксическую активность нативных и фотомодифицированных макрофагов определяли по отношению к клеткам-мишеням линии L-929. Опухолевые клетки данной линии культивировали в 96-луночных планшетах по 3-Ю4 клеток в 100 мкл на каждую лунку в среде RPMI-1640, содержащей 1 %-ный раствор L-глутамина, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (производство «Sigma», США), 100 мкг/мл стрептомицина при температуре 37 С в 5% среде СОг- После 24-часового культивирования к образованному монослою клеток L-929 последовательно добавляли 1 мкг/мл акти-номицина D (производство «Sigma», США), 100 мкл макрофагального лизата и проводили инкубирование в течение 24 часов при температуре 37 С в 5% среде СОг. После инкубации планшеты промывали фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,4) и производили окрашивание клеток-мишеней в течение 10 минут 0,05 %-ным раствором crystal violet (производство «Sigma», США). После удаления краски в каждую лунку планшета добавляли 100 мкл 1 %-ного раствора додецилсульфат натрия. Оптическую плотность изучаемой системы измеряли при 546 нм на спектрофотометре Multiscan МСС/340 (производство «Flow Laboratories», США). Цитотоксическую активность макрофагов рассчитывали по формуле:
Определение роли фотомодификаций белка С4 и мембран имму-ноцитов в изменение антителосвязывающей способности изучаемых систем
Суммируя все вышеизложенное, оказывается возможным оценить роль различных фотохимических процессов, протекающих в сыворотке и на мембранах иммуноцитов в изменение антителосвязывающей способности изучаемых систем «L+C) +At(C4)-Ph, (M+C) +At(C4 Ph, (N+C) +At(C4 Ph). Эффект усиливающегося с ростом дозы УФ-света снижения антителосвязывающей способности С4 в системе из взаимодействующих УФ-облученных компонентов (мембран иммуноцитов и белков системы комплемента) является суммарным и определяется структурно-функциональными фотомодификациями как клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови, при преобладающем вкладе последних. Структурно-функциональные УФ-модификации мембран иммуноцитов проявляются в виде «кэппинг»-эффекта с образованием рецепторных кластеров с лигандированным С4 фактором комплемента. Преобладание распределения флуоресцирующих комплексов на УФ-облученных лимфоцитах (755 и 2265 Дж/м2) и макрофагах (453 Дж/м2) по «кэп %»-тиву приводит к повышению антителосвязывающей способности лигандированного С4, и как следствие, к увеличению адгезивных свойств иммуноцитов. При УФО макрофагов в дозе 755 Дж/м2 наблюдается увеличение процента клеток с амебовидным «кэпом», сопровождающимся, по всей видимости, шеддингом рецепторов с лигандированным С4 и снижением антителосвязывающей способности мем-браносвязанного С4. Изменение числа и локализации рецепторов с литанди-рованньш С4 компонентом комплемента лежит в основе механизма регуляции рецепторних, адгезивных, сорбционных и т. д. свойств иммуноцитов. В сыворотке крови УФ-свет в дозах 75,5 и 755 Дж/мг инициирует фотоактивацию сывороточного С4 с образованием кластеров из прикрепленных к мембране иммуноцитов С4Ъ-субфрагментов, экранирующих мембраносвя-занный С4.
Максимальная доза УФО (2265 Дж/м ) приводит к активации сывороточных ингибиторов, расщепляющих С4 на неактивные для комплементарного каскада субфрагменты. Таким образом, путем изменения доз УФ-облучения компонентов крови можно регулировать процессы взаимодействия мембран иммуноцитов с отдельными факторами системы сывороточного комплемента. Так, воздействие УФ-света в малых дозах на иммуноциты (лимфоциты, макрофаги/моноциты и нейтрофшш) и сыворотку крови может приводить к повышению интенсивности классического пути активации системы комплемента, а также улучшению адгезивных свойств различных компонентов комплемента и фагоцитов, что может лежать в основе формирования терапевтического эффекта метода АУФОК при лечении самого широкого спектра заболеваний, протекающих на фоне иммунодепрессии.
При больших дозах УФО, по всей видимости, включаются механизмы подавления нерегулируемой активации комплемента. Вышеописанные работы основывались на определении УФ-индуцированных функциональных изменений С4 компонента комплемента и затрагивали молекулярные механизмы его функционирования, но не раскрывали в полной мере структурных превращений белковых молекул С4. С целью выявления структурных фотомодификаций С4 фактора системы комплемента, приводящих к изменению его функциональной активности, мы изучили УФ-индуцированные конформационные изменения данного белка, затрагивающие различные типы его пространственной организации. Для оценки изменения соотношения типов вторичной структуры фото-модифицированного в диапазоне доз 75,5+2265 Дж/м" С4 нами были рас-смотрены его дифференциальные спектры в диапазоне 1800-800 см . Дифференциальные ИК-спектры узкого диапазона (1800-800 см"1) на-тивного белка С4 характеризовались следующими полосами поглощения: полоса 1696 см-1 обусловлена поглощением боковых групп в последовательности глицин-аланин, полосы Амид I (1595-1650 см"1), Амид П (1575-1540 см"1) и Амид Ш (1260 см-1) - плоскими колебаниями пептидной группы; полосы 1425 см"1 и 1480-1440 см-1 указывают на цис-конфигурадию всех амид-ных связей (рис. 22). По интенсивностям составляющих компонентов полосы Амид I определяли соотношение типов П структуры нативной и УФ-модифицированной белковой молекулы. Нативная молекула С4 характеризовалась преобладанием неупорядоченной структуры над а- и -структурами. Статистически достоверных изменений в соотношении типов Б структуры белка С4 после его УФ-облучения не выявлено.
При УФ-об лучении С4 в дозе 75,5 Дж/м можно обнаружить тенденцию увеличения содержания а- и р-структур за счет умень шения доли неупорядоченной структуры (табл. 13). По всей видимости, это связано с такого рода информационными изменениями белковой молекулы, при которых идет пространственная реорганизация ее отдельных фрагментов, приводящая к формированию а- и 0-структур. Увеличение дозы УФ-облучения до 755 и 2265 Дж/м2 приводит к возврату его структуры к состоянию, близкому к нативному, что, по-видимому, свидетельствует о неглубоких структурных изменениях белковой молекулы (табл. 13). Таким образом, структурные фотомодификации С4 в данном диапазоне доз УФО существенным образом не затрагивают соотношение типов его И структуры.
