Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 21
1.1 .Эндогенные низкомолекулярные биорегуляторы: роль в биосис- 21
темах
1.1.1. Малые неионные лиганды 21
Оксид азота 21
Оксид углерода 30
1.1.2. Низкомолекулярные серосодержащие тиолы 33
В остановленный глутатион З 3
Нитрозоглутатион 42
1.2. Структура, физико-химические и функциональные свойства раз- 46
личных лигандных форм гемоглобина
Оксигемоглобин 46
Нитрозогемоглобин 58
Карбоксигемоглобин 62
Метгемоглобин 64
1.3. Влияние УФ-излучения на структуру и функциональные харак- 72
теристики сложных белков
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 86
Получение растворов оксигемоглобина человека 86
Получение растворов карбоксигемоглобина человека 86
Получение растворов метгемоглобина человека 87
Получение растворов нитрозогемоглобина человека 87
Модификация оксигемоглобина человека различными низкомо- 88 лекулярными биорегуляторами
2.5.1. Модифицирование оксигемоглобина человека растворами вое- 88
становленного глутатиона
Получение S-нитрозоглутатиона и его инкубация с оксигемог- 88 лобином
Модификация оксигемоглобина нитроглицерином и 89 МОНОЧИНКВЕ
2.6. Модификация оксигемоглобина человека препаратом природно- 89
го полисахарида - реополиглюкином
2.7. Химическая модификация оксигемоглобина диальдегиддекстра- 89
ном
Получение диальдегиддекстрана из реополиглюкина, очистка и 90 определение степени его окисления
Синтез конъюгатов гемоглобин-диальдегиддекстран 91
Определение содержания полисахарида в конъюгатах гемогло- 91 бин-диальдегиддекстран
Определение природы ионогенных групп, участвующих в об- 92 разование комплекса гемоглобин-диальдегиддекстран, методом протеолитического титрования
Облучение растворов гемоглобина 93
Термостатирование исследуемых растворов гемоглобина 94
2.10. Регистрация электронных спектров поглощения растворов на- 94
тивного и модифицированного гемоглобина
2.11. Гель-хроматография нативных и модифицированных растворов 94
гемоглобина
2.12. Диск-электрофорез различных лигандных форм гемоглобина в 95
полиакриламидном геле
Регистрация кривых диссоциации оксигемоглобина и его сме- 97 сей с различным содержанием нитрозо- и карбоксигемоглобина
Спектрофотометрическое определение количества SH-групп в 98 различных лигандных формах нативного и модифицированного гемоглобина
2.15. Определение соотношения основных лигандных форм в на- 98
тивных и модифицированных образцах гемоглобина
Определение интенсивности светорассеяния растворов гемо- 99 глобина
Расчет некоторых кинетико-термодинамических характеристик 99 нативных и УФ-облученных молекул гемоглобина
2.18. Создание компьютерных моделей гема, гемоглобина человека, 101
декстрана, диальдегиддекстрана, комплексов гемоглобин-
диальдегиддекстран I и II типов
2.19. Статистическая обработка экспериментальных данных 102
ГЛАВА 3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И 103
УФ-ОБЛУЧЕННОГО ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА
Хроматографические и спектральные характеристики нативного 103 и УФ-облученного оксигемоглобина человека
Электрофоретические характеристики нативного и УФ- 108 облученного оксигемоглобина человека
ГЛАВА 4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И 117 УФ-ОБЛУЧЕННОГО МЕТГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА
4.1. Спектральные и хроматографические характеристики нативного 117
и УФ-облученного метгемоглобина человека
4.2. Электрофоретические характеристики нативного и УФ- облу- 122
ченного метгемоглобина человека
ГЛАВА 5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И 128 УФ-ОБЛУЧЕННОГО КАРБОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ
5.1. Спектральные характеристики растворов нативного и УФ- 128
облученного карбоксигемоглобина человека
5.2. Хроматографические характеристики нативного и УФ- облучен- 135
ного карбоксигемоглобина человека
5.3. Электрофоретические характеристики нативного и УФ-об- 137
лученного карбоксигемоглобина человека
5.4. Исследование природы электрофоретических фракций нативного 142
и фотомодифицированного карбоксигемоглобина человека 5.4.1. Спектральные характеристики электрофоретических фракций 142
нативного и УФ-облученного карбоксигемоглобина человека 5.4.2.Хроматографические характеристики электрофоретических 152
фракций нативного и УФ-облученного карбоксигемоглобина
человека ГЛАВА 6. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА 158 РАСТВОРОВ ГЕМОГЛОБИНА С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ОКСИ- И КАРБОКСИФОРМ
6.1. Спектральные характеристики растворов гемоглобина с различ- 159
ным содержанием окси- и карбоксиформ
6.2. Хроматографические свойства растворов гемоглобина с различ- 161
ным содержанием окси- и карбоксиформ
6.3. Электрофоретические свойства растворов гемоглобина с раз- 162
личным содержанием окси- и карбоксиформ
6.3.1. Хроматографические характеристики электрофоретических 170
фракций растворов гемоглобина с различным содержанием окси- и карбоксиформ
6.4. Функциональные характеристики нативных и УФ-облученных 172
смесей окси- и карбоксигемоглобина человека ГЛАВА 7. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И 186 УФ-ОБЛУЧЕННОГО НИТРОЗОГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ
Спектральные свойства нативных и УФ-облученных растворов 186 нитрозогемоглобина человека
Хроматографические характеристики нативного и УФ- 192
облученного нитрозогемоглобина человека
7.3. Электрофоретические свойства нативного и УФ-облученного 194
нитрозогемоглобина человека
7.4. Исследование природы электрофоретических фракций нативного 198
и фотомодифицированного нитрозогемоглобина человека
Спектральные характеристики электрофоретических фракций 199 нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека
Хроматографические свойства электрофоретических фракций 209 нативного и УФ-облученного. нитрозогемоглобина человека
7.5. Функциональные характеристики нативных и УФ-облученных 212
смесей окси- и нитрозогемоглобина человека ГЛАВА 8. НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 223 ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В ПРИСУТСТВИИ ИСТОЧНИКОВ ОКСИДА АЗОТА - НИТРОГЛИЦЕРИНА, МОНОЧИНКВЕи S-НИТРОЗОГЛУТАТИОНА
8.1. Некоторые физико-химические свойства оксигемоглобина чело- 226
века в присутствии различных концентраций нитроглицерина
Спектральные характеристики растворов нативного и модифи- 226 цированного нитроглицерином оксигемоглобина человека
Электрофоретические свойства оксигемоглобина человека, мо- 228 дифицированного нитроглицерином в различных концентрациях
8.2. Спектральные характеристики растворов оксигемоглобина в 231
присутствии лекарственного препарата МОНОЧИНКВЕ
8.3. Физико-химические свойства оксигемоглобина человека, моди- 233
фицированного воздействием S-нитрозоглутатиона и УФ-излучения 8.3.1 .Спектральные характеристики оксигемоглобина человека, мо- 233 дифицированного различными концентрациями S-нитрозоглутатиона
8.3.2. Спектральные свойства оксигемоглобина человека, модифици- 236
рованного сочетанным действием S-нитрозоглутатиона и УФ-излучения
Хроматографические характеристики оксигемоглобина чело- 240 века в присутствии S-нитрозоглутатиона различных концентраций
Хроматографические свойства оксигемоглобина человека, мо- 242 дифицированного совместным воздействием S-нитрозоглутатиона и УФ-излучения
Электрофоретические характеристики оксигемоглобина чело- 245 века в присутствии S-нитрозоглутатиона различных концентраций
ГЛАВА 9. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И 254 УФ-ОБЛУЧЕННОГО ОКСИГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА В ПРИСУТСТВИИ ВОССТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА
Гель-хроматографические свойства оксигемоглобина человека в 254 присутствии глутатиона в условиях различного микроокружения
Электронные спектры поглощения растворов нативного и УФ- 256 облученного оксигемоглобина человека в присутствии глутатиона
Электрофоретические характеристики нативного и УФ- облу- 264 ченного оксигемоглобина человека, модифицированного восстановленным глутатионом
ГЛАВА 10. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ 273
ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ХРАНЕНИИ КОНСЕРВИРОВАННОЙ КРОВИ ДОНОРОВ ПРИ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ 10.1. Хроматографические свойства гемоглобина, выделенного из 273 крови доноров с различными сроками хранения
10.2. Электрофоретические характеристики гемоглобина, выделен- 275
ного из крови доноров с различными сроками её хранения
10.3, Функциональные свойства гемоглобина, выделенного из крови 280
доноров с различными сроками её хранения
ГЛАВА 11, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И 284
ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТЬ МОЛЕКУЛ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАННОГО РЕОПОЛИГЛЮКИНОМ И ДИАЛЬДЕГИДЦЕКСТРАНОМ
11.1. Физико-химические свойства и термостабильность гемоглобина 285
человека в присутствии реополиглюкина
Спектральные характеристики молекул гемоглобина челове- 285 ка в присутствии реополиглюкина
Хроматографические свойства гемоглобина человека в при- 287 сутствии реополиглюкина
Электрофоретические характеристики гемоглобина человека 288 в присутствии реополиглюкина
Определение природы ионогенных групп молекул гемогло- 291 бина человека в присутствии реополиглюкина методом про-теолитического титрования
Термостабильность молекул гемоглобина человека в присут- 293 ствии реополиглюкина
11.2. Физико-химические свойства и термостабильность молекул ге- 295
моглобина человека в комплексах с диальдегиддекстраном
11.2.1. Исследование процессов образования комплексов гемогло- 295
бин-диальдегидцекстран с помощью метода гель-фильтрации
на сефадексах
Спектральные характеристики комплексов гемоглобин- 300 диал ьдегиддекстран
Электрофоретические характеристики комплексов гемогло- 303 бин-диальдегидцекстран
11.2.4. Определение природы ионогенных групп, участвующих в об- 305
разовании комплекса гемоглобин-диальдегиддекстран, с помощью метода протеолитического титрования
Термостабильность комплексов гемоглобин- 3 09 диальдегиддекстран
Создание и анализ компьютерных моделей комплексов гемо- 314 глобин- диальдегиддекстран
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 324
ВЫВОДЫ 331
СПИСОК ЦИТИРУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ 334
ПРИЛОЖЕНИЕ 373
Введение к работе
Актуальность темы. УФ-свет и температура - два важнейших экологических фактора, под воздействием которых возникала жизнь на Земле Понять сложные механизмы резистентности и адаптации живых систем по отношению к УФ-излучению и температурного фактора можно, только изучив их влияние на клеточно-молекулярном уровне отдельных индивидуумов. В качестве модельных объектов для изучения фото- и термостабильности белков очень удобно использовать компоненты крови, и в частности, гемоглобин эритроцитов. Последний относится к гетерогенным белкам (Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко, 1978). В организме человека и животных он существует в комплексе с целым рядом малых лигандов (02, СО, N0, НгО и др.) в виде молекул окси-, карбокси-, нитрозо-, метгемоглобина и др., физико-химические свойства и функциональная активность которых резко отличаются в зависимости от формы их существования: тетрамерной, димерной или мономерной (Л.И. Иржак, 1975; Г.А. Вашанов, 2004). Исследований, посвященных изучению вклада отдельных компонентов гембелков в процессы фотоповреждения различных структурных форм гемоглобина в условиях различного микроокружения (В.Г. Артюхов и др., 1997), крайне недостаточно. Основные фотохимические исследования гемопротеидов проведены в основном без учета их структурной неоднородности и лигандного состава.
В норме соотношение отдельных лигандных форм гемоглобина поддерживается на определенном уровне. Однако оно может значительно изменяться за счет поступления оксидов азота и углерода извне. Во многом этому способствует обострение экологической обстановки вследствие техногенного воздействия на окружающую среду (В.П. Подольский и др., 1999; М.Х.-Г. Ибрагимов, 2005; С.А. Куролап и др., 2006). Нередкими являются и бытовые случаи отравления оксидом углерода, летальные исходы которых составляют 17.5 % всех смертельных отравлений (Е.А. Лужников, Л.Г. Костомарова, 1989). Сродство NO и СО к дезоксигемоглобину намного выше, чем кисло-
рода. Присоединив эти лиганды, гемоглобин теряет способность транспортировать кислород к тканям и органам, что приводит к острым и хроническим отравлениям, способствуют развитию заболеваний дыхательной, сердечнососудистой, нервной и др. систем, особенно у лиц, постоянно подвергающихся воздействию указанных веществ (водители автотранспорта, работники автостоянок, инспектора ГИБДД). Возникновение патологических эффектов может сопровождаться заметным увеличение содержания карбокси- (НЬСО) или нитрозогемоглобина (HbNO) в крови. В связи с этим всё большую актуальность приобретают исследования, посвященные изучению физико-химических и функциональных свойств препаратов гемоглобина с различным соотношением окси- и карбоксиформ, окси- и нитрозоформ.
Процессы с участием оксидов азота и углерода в биосистемах, подвергнутых воздействию физических факторов внешней среды, в том числе УФ-света от естественных и искусственных источников, остаются практически неизученными; недостаточно полно определены пути превращения комплексов белок-лиганд при этих воздействиях. Принимая во внимание усиливающуюся роль коротко- и средневолнового УФ-излучения в формировании антропогенной нагрузки на окружающую среду, а также широкое использование в клинической практике метода аутотрансфузии УФ-облученной крови (АУФОК) и других видов фототерапии, становится понятной необходимость проведения подобного рода исследований.
Особый интерес представляет изучение структурного статуса молекул оксигемоглобина в присутствии различных концентраций лекарственных средств - источников N0.
Функционирование молекул оксида азота в клетках организма человека тесно связано с низкомолекулярными серосодержащими пептидами, и в частности, с восстановленным глутатионом (GSH), молекулы которого входят в состав антиоксидантной системы, контролирующей разрушающее действие активных форм кислорода (АФК) при пероксидном стрессе. Соединяясь с оксидом азота, GSH образует S-нитрозоглутатион (GSNO), который за-
12 щищает N0 от различных воздействий при внутри- и межклеточном переносе. Важная роль глутатиона и его производных в нормальном функционировании клеток, тканей и организма человека и животных, а также недостаточная изученность влияния этих молекул на эритроцитарные белки крови стимулировали нас к проведению исследований третичной и четвертичной структуры нативного и УФ-облученного оксигемоглобина человека в присутствии восстановленного глутатиона и S-нитрозоглутатиона.
Весьма перспективным является разработка кислородпереносящих кровезаменителей на основе гемоглобина (Т.-Н. Jessen, R. Hilgenfeld, 1992; М.А. Ажигирова, Е.А. Селиванов, 1999), химически модифицированного некоторыми органическими молекулами, защищающими его от разного рода внешних воздействий. В связи с вышеизложенным нами было постулировано использование в качестве стабилизирующего агента гемоглобина окисленного производного клинического декстрана (реополиглюкина) - диальдегид-декстрана (ДАД), разработаны методы получения конъюгатов оксигемоглобина человека с данным полисахаридом, выяснены условия их образования, исследованы физико-химические характеристики и стабильность полученных комплексов.
Изучению действия температуры на белковые молекулы посвящено значительное количество работ (М. Жоли, 1968; В.Я. Александров, 1975, 1985; П. Хочачка, Дж. Сомеро, 1988; Е.Г. Франк и др., 1994). Вместе с тем мало внимания уделено исследованию природы конформационных превращений сложных (олигомерных) белков, приводящих к их термоинактивации. Недостаточно изучены вопросы, касающиеся выявления физико-химических основ тепловой денатурации этих биополимеров. Всё это убеждало нас в необходимости проведения подобного рода исследований. В качестве объектов исследования в данной серии экспериментов выступили оксигемоглобин человека в растворе, в присутствии реополиглюкина, в комплексах с диаль-дегиддекстраном и в составе эритроцитов, что позволило провести сравнительный анализ термоустойчивости оксиформы гемопротеида в зависи-
13 мости от условий микроокружения и исходной конформации белка.
Таким образом, исследование фото- и термоиндуцированных структурных превращений гемоглобина человека и его производных, изучение функциональной активности оксигемоглобина в меняющихся условиях окружающей среды имеет важное теоретическое и практическое значение. Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось определение степени УФ-чувствительности и термостабильности ряда структурных (лигандных) форм гемоглобина человека в условиях различного микроокружения. Задачи работы предусматривали:
Оценку физико-химических характеристик гемоглобина человека с различными аксиальными лигандами (О2, СО, N0, Н20) в координационной сфере атома железа порфиринового кольца.
Изучение влияния различных диапазонов и доз УФ-света на спек: тральные, хроматографические и электрофоретические характеристики различных лигандных форм (окси-, карбокси-, нитрозо- и метформы) гемоглобина человека.
Выявление влияния сочетанного воздействия «терапевтических» доз УФ-света и различных концентраций НЬСО и HbNO на функциональные свойства оксигемоглобина человека.
Сравнительный анализ фоточувствительности различных лигандных форм гемоглобина человека (НЬОг, НЬСО, HbNO, MtHb).
Изучение структурного состояния молекул оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием восстановленного глутатиона (10" +10" моль/л) и УФ-излучения в дозах 151+4530 Дж/м .
Исследование изменений физико-химических свойств оксигемоглобина человека, индуцированных S-нитрозоглутатионом в концентрациях 10" +10"3 моль/л, а также сочетанным воздействием этого модификатора и УФ-света (240-390 нм) в дозе 151 Дж/м2.
Изучение влияния длительного хранения крови доноров при понижен-
14 ной температуре на структурно-функциональные характеристики гемоглобина эритроцитов. Определение оптимальных сроков использования донорской крови для её трансфузии.
Подбор оптимальных условий химического синтеза комплексов окси-гемоглобин человека-диальдегиддекстран и определение некоторых физико-химических характеристик их молекул.
Изучение термостабильности молекул оксигемоглобина человека в растворе, в присутствии реополиглюкина и в комплексах с ДАД.
Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу влияния эндогенных низкомолекулярных биорегуляторов - малых неионных лигандов (оксидов азота и углерода) и тиолсодержа-щих соединений (восстановленного глутатиона и S-нитрозоглутатиона), лекарственных препаратов - источников оксида азота (нитроглицерина, МО-НОЧИНКВЕ), высокомолекулярных полианионов на основе декстрана (реополиглюкина и диальдегиддекстрана), УФ-излучения и температурного фактора на структурно-функциональное состояние молекул гемоглобина человека. Выявлено, что от природы аксиального лиганда (Ог, СО, N0) в координационной сфере атома железа молекулы гемоглобина, прочности связи гем-проксимальный гистидин и конформации ближайшего белкового окружения гема зависят состояние высших типов пространственной организации молекул гемоглобина, его физико-химические свойства и фоточувствительность.
Получены доказательства, что одним из основных механизмов ответной реакции лигандных форм тетрамерной молекулы гемоглобина на воздействие различных диапазонов и доз УФ-света является ослабление и разрыв междимерных и межсубъединичных контактов и, как следствие, накопление минорных димерных и мономерных форм гембелка. Кроме того, фотомодификации гемопротеидов могут приводить к декомпактизации их частично спирализованных молекул и ассоциации гембелков вплоть до размеров окта-меров.
15 Впервые исследовано влияние HbNO в диапазоне концентраций 0,1-
10% на функциональные свойства нативного и УФ-облученного в дозах 151 и 453 Дж/м2 оксигемоглобина человека. Изучение динамики связывания кислорода гемопротеидом показало, что присутствие HbNO интенсифицирует начальные этапы процесса оксигенации и ослабляет кооперативные взаимодействия в тетрамерах, вследствие чего сродство гемоглобина к кислороду в области физиологически важных парциальных давлений (40-100 мм рт. ст.) снижается.
Показано, что направленность УФ-индуцированных изменений функциональных свойств (снижение или возрастание величин Р5о и константы Хилла) оксигемоглобина и его смесей с НЬСО и HbNO определяется соотношением вкладов фотохимических превращений отдельных лигандных форм гембелка и процессами образования минорных компонентов системы гемоглобина. Выявлены предельные концентрации НЬСО (менее 10 %), при которых возможна корректировка и восстановление исходных характеристик кислородсвязывающей способности гемопротеида УФ-светом. На основе метода кусочно линейной аппроксимации созданы математические модели процессов оксигенации гемоглобина человека, модифицированного воздействием некоторых агентов физической и химической природы.
Исследована возможность использования производных декстрана (рео-полиглюкина и диальдегидцекстрана) в качестве стабилизаторов молекул гемоглобина. Впервые подобраны оптимальные условия химического синтеза комплексов гемоглобина с ДАД, позволяющие получать модифицированные образцы гемоглобина с определенными размерами, молекулярными массами и физико-химическими свойствами. Определены а-1, б-Б-глюкопиранозные остатки декстрана, подвергающиеся окислению и участвующие в образовании альдегидных групп при получении ДАД, выявлены участки (аминокислотные остатки) глобина, ответственные за комплексообразование с указанным полисахаридным производным. Созданы компьютерные модели трехмерной пространственной структуры молекул декстрана, ДАД, комплексов
НЬь-ДАД I и II типа с различным соотношением белок: модификатор.
Проанализированы термоиндуцированные изменения молекул гемоглобина человека в растворе (в свободном состоянии), в составе эритроцитов крови, в присутствии реополиглюкина и в комплексах с ДАД. Выявлены оптимальные сроки хранения донорской крови при пониженной температуре, при которых структурные и функциональные характеристики гемоглобина остаются близкими к нативному состоянию. Показано, что термостабильность молекул гемоглобина можно значительно повышать путем присоединения к ним определенного количества молекул окисленного декстрана.
Практическая значимость. Результаты проведенных модельных экс
периментов по исследованию динамики фотоиндуцированных превращений
молекул НЬ02, HbCO, HbNO и MtHb и выяснению структуры стабильных
фотопродуктов, образующихся при воздействии различных диапазонов длин
волн УФ-света на гемопротеиды, можно использовать для подбора оп
тимальных доз УФ-облучения и длительности курса процедур при лечении
заболеваний различной этиологии методом АУФОК. :
Данные, полученные при изучении влияния различных концентраций карбоксигемоглобина (10 - 80%) и нитрозогемоглобина (0,1 - 10 %) на функциональную активность гемоглобина до и после воздействия УФ-света могут быть использованы в клинической практике для диагностики интоксикаций организма СО или N0 и разработки методов регулирования кислородтранс-портной функции гемоглобина.
Разработанные программы для ЭВМ типа IBM «Анализ кривых диссоциации оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием факторов физической и химической природы», «Расчет точки полного насыщения кислородом оксигемоглобина человека, модифицированного воздействием факторов физической и химической природы», «Прогноз функциональной активности нативного и УФ-облученного оксигемоглобина человека в зависимости от концентрации оксида азота и углерода» (Свидетельства об официальной регистрации программ для ЭВМ № 2006614279, № 2006614280
17 и № 2006614281 Федеральной службы по интеллектуальной собственности,
патентам и товарным знакам РФ, зарегистрированные в Реестре программ для ЭВМ 13 дкабря 2006 г.) позволяют быстро и точно, не прибегая к использованию графической модели процесса, рассчитать наиболее важные параметры процессов оксигенации гемоглобина в условиях различного микроокружения.
Результаты исследований, посвященных изучению структурно-функциональных характеристик молекул гемоглобина при длительном хранении консервированной крови доноров, необходимо принимать во внимание при разработке научно-обоснованных рекомендаций по использованию крови доноров в клинической практике.
Экспериментальные данные по исследованию физико-химических свойств препаратов гемоглобина в присутствии реополиглюкина и химически модифицированного гемоглобина (различные комплексы Hb-ДАД) могут быть использованы специалистами, работающими в области создания искусственных кровезаменителей.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуниверситета при чтении курсов "Фотобиология", "Общая биофизика", "Фотофизика, фотохимия и фотоиммунология компонентов крови", при проведении спецпрактикума по фотобиологии, выполнении магистерских и кандидатских диссертационных работ.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции «Кислотно-основной и температурный гомеостаз» (Сыктывкар, 1994, 1997); Международной конференции «Критерии самоорганизации в физических, химических и биологических системах (Суздаль, 1995); I и II Международном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов» (Воронеж, 1995, 1998); Second Int. Conf.on development directions of the radio communication systems and means (Voronezh, 1995); научно-практической конференции «Ак-
18 туальные вопросы скорой медицинской помощи - реальность и перспективы» (Воронеж, 1996); 4-й региональной конференции «Проблемы химии и химической технологии» (Тамбов, 1996); Int. Sci. Conf. "Mathematical models of non-linear excitation, transport, dynamics, control in condensed system and other mediums" (Tver, 1996); 12 Int. Congress on photobiology (Viena, 1996); 2nd Internal Symposium "Molecular order and mobility in polimer systems" (Saints-Petersburg, 1996); I и II Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино, 1996, 1998); совещании-семинаре «Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации» (Воронеж, 1996); Международном симпозиуме «Кислород и свободные радикалы» (Гродно, 1996); V Международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 1997); 2-й Всероссийской научной конференции «Светоизлучательные системы. Эффективность и применение» (Саранск, 1997); 11-й межреспубликанской научно-практической конференции «Актуальные вопросы экологии и охраны природных экосистем южных регионов России и сопредельных территорий» (Краснодар, 1998); 2-й Международной научно-технической конференции «Решение экологических проблем в автотранспортном комплексе» (Москва, 1998); 3-й и 5-й Международных научных конференциях «Математические модели нелинейных возбуждений, динамики, переноса, управления в конденсированных системах и других средах» (Тверь, 1998; Москва, 2000); II и III съезде биофизиков России (Москва, 1999; Воронеж, 2004); II и III Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2000, 2003); 2-й Российской конференции «Физика в биологии и медицине» (Екатеринбург, 2001); IV съезде по радиационным исследованиям (радио-биология, радиоэкология и радиационная безопасность) (Москва, 2001); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (Москва, 2004); 7-й и 8-й Международной конференции по химии и физико-хи-мии олигомеров «Олигомеры-2000, 2002» (Пермь, 2000, Москва-Черноголовка, 2002); III съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); IV съезде по
19 проблемам радиационной биологии (Москва,2001); 3 Int. Symposium on Separation in BioSciencies SBS03 "100 yeares of chromatography" (Moskau, 2003); междисциплинарной конференции с международным участием «НБИТТ-21» (Петрозаводск, 2003); VIII Международной научной экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-графические приборы» (Москва, 2004); Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); «Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2001, 2006); IX Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2006); 6-й и 7-й международной научно-методической конференции «Информатика: проблемы, методология, технология» (Воронеж, 2006, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 48 работ, в том числе коллективная монография, учебное пособие с грифом Министерства образования и науки РФ.
На защиту выносятся следующие положения.
Состояние третичной и четвертичной структуры молекул гемоглобина и его УФ-чувствительность определяются природой аксиального ли-ганда и зависят от ближайшего микроокружения гемовой группы белковой макромолекулы. Фотомодификации различных лигандных форм тетрамерной молекулы гемоглобина (НЬ02, HbCO, HbNO, MtHb) затрагивают области контактов димеров и отдельных субъединиц, что приводит к накоплению минорных димерных и мономерных форм, или к декомпактизации тетрамер-ных молекул и образованию октамерных форм.
Схемы возможных физико-химических процессов, приводящих к УФ-модификации молекул карбокси-, нитрозо- и метгемоглобина человека.
Математические модели процессов оксигенации интактного и модифицированного УФ-излучением гемоглобина человека в присутствии оксидов углерода и азота.
4. Диальдегиддекстран - эффективный стабилизатор и модификатор
структурно-функционального состояния молекул гемоглобина человека.
Компьютерные модели трехмерной пространственной структуры декстрана, диальдегиддекстрана, комплексов гемоглобин-диальдегиддекстг ран I и II типов.
Схема процессов, протекающих в растворах интактных и термостатированных молекул гемоглобина человека в присутствии реополиглюкина и диальдегиддекстрана.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 385 страниц машинописного текста, 80 таблиц, 82 рисунка. Состоит из "Введения", 11 глав, "Заключения", "Выводов", "Приложения". Список цитируемой литературы содержит 362 работы, из них 211 отечественных и 151 зарубежных.
