Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1. Полиамины. Химические свойства, структура, локализация, транспорт 9
2. Метаболизм полиаминов 12
2.1 Ферменты синтеза и их локализация 12
2.2 Гены биосинтеза 15
2.3 Ферменты катаболизма и их локализация 16
2.4 Регуляция метаболизма полиаминов в процессах роста и развития 17
3. Защитная и сигнальная роль полиаминов, связь с фитогормонами 21
4. Полиамины и регуляция их метаболизма при засолении 24
5. Полиамины и регуляция их метаболизма при действии УФ-В 28
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования 35
1. Объекты исследования 35
2. Условия выращивания в водной культуре 38
3. Условия проведения опытов 40
4. Определение содержания свободных полиаминов 40
5. Определение количества перекиси водорода 43
6. Определение активности каталазы 44
7. Определение активности супероксиддисмутазы 45
8. Выделение РНК и проведение обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции 46
9. Конструирование праймеров для проведения ПЦР генов биосинтеза и деградации полиаминов 46
10. Определение содержания белка в ферментных препаратах 48
11. Математическая обработка данных 49
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 51
1. Воздействие NaCl 51
1.1 Действие NaCl на растения Thellungiella halophila 51
1.1.1 Изменение активностей антиоксидантных ферментов в растениях Thellungiella halophila при действии NaCl 52
1.1.2 Изменение уровней свободных полиаминов в растениях Thellungiella halophila при действии NaCl 56
1.2 Действие NaCl на растения Plantago major 60
1.2.1 Изменение активностей антиоксидантных систем в растениях Plantago major при действии NaCl 60
1.2.2 Изменение уровней свободных полиаминов в растениях Plantago major при действии NaCl 63
1.3 Действие NaCl на растения Geumurbanum 67
1.3.1 Изменение активностей антиоксидантных систем в растениях Geum urbanum при действии NaCl 67
1.3.2 Изменение уровней свободных полиаминов в растениях Geum urbanum при действии NaCl 70
2. Воздействие УФ-В 73
2.1 Действие УФ-В на растения Thellungiella halophila 73
2.1.1 Изменение активностей антиоксидантных систем в растениях Thellungiella halophila при действии УФ-В 73
2.1.2 Изменение уровней свободных полиаминов в растениях Thellungiella halophila при действии УФ-В 77
2.2 Действие УФ-В на растения Plantago major 82
2.2.1 Изменение активностей антиоксидантных систем Plantago major при действии УФ-В 82
2.2.2 Изменение уровней свободных полиаминов в растениях Plantago major при действии УФ-В 85
2.3 Действие УФ-В на растения Geum urbanum 89
2.3.1 Изменение активностей антиоксидантных систем растений Geum urbanum при действии УФ-В 89
2.3.2 Изменение уровней свободных полиаминов в растениях Geum urbanum при действии УФ-В 92
Заключение 95
Выводы 98
Список цитируемой литературы 99
- Ферменты синтеза и их локализация
- Определение содержания свободных полиаминов
- Изменение активностей антиоксидантных ферментов в растениях Thellungiella halophila при действии NaCl
- Изменение активностей антиоксидантных систем растений Geum urbanum при действии УФ-В
Введение к работе
Абиотические факторы имеют доминирующее значение среди постоянно действующих на растения факторов окружающей среды. На протяжении всего цикла развития растения подвергаются действию высоких и низких температур, нарушениям водного режима, ультрафиолетовой радиации солнца. Интенсивная хозяйственная деятельность человека за прошедшие века, привела к многократному усилению действия существовавших негативных факторов среды и появлению новых: тяжёлые металлы, проникающая радиация, химические загрязнители. Таким образом, за сравнительно короткий промежуток времени произошло увеличение количества стрессоров и их мощности. Это неизбежно привело к обострению экологической обстановки, деградации сельскохозяйственных и пастбищных угодий. Все земли пригодные для сельского хозяйства к настоящему времени освоены. На 20% этих площадей вследствие нарушения агротехники выращивания сельскохозяйственных культур развилось вторичное засоление. Около одной трети орошаемых земель во всём мире, стали непригодными в связи с повышением их солёности (Owens, 2001; Munnd 2005).
В результате усиления выбросов в атмосферу фреонов и других загрязнителей происходит истощение озонового слоя стратосферы. Следствием этого явилось увеличение мощности ультрафиолетовой радиации, достигающей земной поверхности (Andrady et. al., 2006; Rowland, 2006). Действие повышенных доз ультрафиолетовой радиации приводит к уменьшению биомассы, количества зрелой пыльцы и снижению способности культурных растений к конкурентной борьбе с сорняками. Действие засоления, ультрафиолетовой радиации и совместное действие этих факторов приводит к значительному снижению выхода сельскохозяйственной продукции и большим экономическим потерям. В связи с этим исследование механизмов адаптации растений к повреждающему действию абиотических факторов занимает ключе-
вое положение в современной науке.
За последние десятилетия накоплен значительный фактический материал о многообразии ответных реакций растений на действие стрессоров различной природы. Установлено, что общим характерным признаком действия стрессоров, является усиление генерации активных форм кислорода (АФК). В первую очередь это связано с нарушением структуры и функций мембран некоторых органелл клетки (хлоропласты, митохондрии, пероксисомы). Основные АФК (супероксид анион, гидроксил анион, перекись водорода) обладают высокой реакционной способностью, реагируют с белками, липидами мембран, нуклеиновыми кислотами, изменяя их структуру и нарушая их функции (Пескин, 1997; Cheeseman, 2007). Именно по этой причине способность растений контролировать уровень АФК, может в значительной степени коррелировать с их устойчивостью к различным повреждающим воздействие-ям. Наиболее известными антиоксидантными ферментами являются суперок-сиддисмутаза (СОД), различные пероксидазы (ПО), каталаза, аскорбатперок-сидаза и другие ферменты Halliwell-Asada цикла. В условиях окислительного стресса ферменты могут быстро инактивироваться активным кислородом, и для индукции их синтеза de novo требуется определённое время. Возможно, по этой причине в антиоксидантной системе защиты принимают участие и низкомолекулярные антиоксиданты, к которым относят и полиамины (На et al., 1998).
Полиамины обнаружены практически у всех живых организмов. Они являются низкомолекулярными органическими поликатионами, характеризующимися высокой биологической активностью. Благодаря химическим свойствам и присутствию во всех компартментах и органеллах растительной клетки, полиамины являются мультифункциональными регуляторами физиологических процессов. Несмотря на большое число работ, роль полиаминов в растениях при действии различных видов стресса, до сих пор остаётся неясной. В связи с этим представляется важным изучение защитной роли поли-
аминов у растений различных экологических групп при действии стрессор-ных факторов различной природы. Такие исследования позволяют расширить понимание механизмов кросс-адаптации, что открывает большие перспективы для сельского хозяйства и сохранения бйоразнообразия.
При изучении адаптационных свойств растений используются разные методологические подходы: сравнение видов с различной устойчивостью к стрессам (в частности при засолении: галофитов и гликофитов), исследование модельных растений {Arabidopsis thaliana L., Mesembryanthemum crystal-linum L.) и трансгенных растений. К модельным объектам предъявляется ряд специфических требований. Он должен обладать коротким жизненным циклом, способностью к самоопылению, большим количеством семян и малым размером генома. С недавних пор в исследованиях стал применяться новый модельный объект, ближайший родственник Arabidopsis thaliana — галофит Thellangiella halophila Меу. Сходство геномов этих растений превышает 95%. Тем не менее, подавляющее большинство представителей растительного мира (около 98%) относится к гликофитам, демонстрирующим различную степень повреждения при невысокой концентрации солей в почве и почвенном растворе. Среди гликофитов в последнее время интенсивно исследуются адаптационные свойства рода Plantago, представители которого широко распространённы в природных экосистемах. Особое внимание уделяется адаптационным свойствам гликофита Plantago major L. при действии различных видов абиотического стресса (Mudrik et al., 2003; Vicente et al., 2004).
Перспективным направлением исследований является поиск новых объектов, преимущественно среди представителей дикорастущей флоры. Такие растения, например Geum urbanum L., могут обладать широким адаптационным потенциалом к неблагоприятным факторам среды (Радюкина, Иванов и др., 2007а).
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось сравнительное исследование дифференциальной экспрессии генов ферментов биосинтеза полиаминов на фоне изменения их эндогенного уровня у галофитов и гликофитов при действии засоления и облучении ультрафиолетом В.
Задачи исследования:
1. Сравнить потенциал устойчивости исследуемых растений {Thel
lungiella halophila Mey., Plantago major L., Geum urbanum L.) к действию
хлорида натрия и ультрафиолета В.
Изучить особенности изменений в содержании и спектре свободных полиаминов семейства путресцина при действии на растения NaCl.
Провести анализ профиля экспрессии генов биосинтеза полиаминов при действии NaCl у растений Thellungiella halophila Mey. и Plantago major L.
Изучить особенности изменений в содержании и спектре свободных полиаминов семейства путресцина при действии на растения ультрафиолета.
Провести анализ профиля экспрессии генов биосинтеза полиаминов при действии ультрафиолета у растений Thellungiella halophila Mey. и Plantago major L.
Исследовать содержание кадаверина и экспрессию гена лизиндекар-боксилазы при действии NaCl и УФ-В у Thellungiella halophila и Plantago major.
Научная новизна. Впервые изучена динамика стресс-зависимой экспрессии генов ферментов биосинтеза полиаминов у контрастных по устойчивости к ультрафиолету и засолению дикорастущих видов растений. Выявлены существенные различия в изменении содержания полиаминов и экспрессии генов ферментов их биосинтеза у одного и того же вида растения при действии различных стрессовых факторов. Впервые показано, что в отличие от засоления действие УФ-В облучение индуцирует органоспецифичный синтез кадаверина у Thellungiella halophila Mey. в листьях и Plantago major
L. в корнях.
Практическая значимость. Полученные данные об изменении содержания и спектра полиаминов при действии засоления и УФ-В, а также изменение экспрессии генов их биосинтеза под действием этих факторов имеют большое значение для понимания формирования адаптивных процессов у га-лофитов и гликофитов. Полученные данные могут быть использованы в практике растениеводства, а теоретические обобщения - для разработки курсов лекций для студентов биологических специальностей.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на 10-й Пу-щинской школе-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2006); I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006); VI Международной конференции молодых учёных Леса Евразии - Венгерский лес (Венгрия, Шопрон); V международной школе-семинаре по экологии (Пущино, 2006); VII Международной конференции молодых учёных Леса Евразии - Русский север (Петрозаводск, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 18 печатных работ, из которых 3 - статьи в основном журнале по специальности «Физиология и биохимия растений» - «Физиология растений».
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и содержат 3 таблицы, 14 формул и 53 рисунка. Список цитируемой литературы включает 230 наименований, в т.ч. 215 иностранных.
Ферменты синтеза и их локализация
Содержание ПА в организме подвержено жёсткой регуляции и изменяется в довольно узких пределах. Пути биосинтеза в растениях были тщательно изучены и разобраны в деталях (Evans and Mamberg, 1989; Tiburcio et al., 1990; Slocum, 1991a; Martinanguy, 2001).
Синтез путресцина у животных и грибов происходит лишь по одному возможному пути - с помощью орнитиндекарбоксилазы (ОДК) из L-орнитина. В отличие от них, у растений Пут, как правило, синтезируется двумя альтернативными путями: с помощью ОДК, также как у животных, или из аргинина с помощью аргининдекарбоксилазы (АДК) (рис. 2), через промежуточный агматин и N-карбамоилпутресцин (Martinanguy, 2001; Kusano et al., 2007). Два пути биосинтеза пространственно разобщены, тканеспецифичны и находятся под онтогенетическим контролем (Кузнецов и др., 2006).
С помощью иммуноферментной техники обнаружено, что белок АДК находится в двух различных клеточных компартментах: в тилакоидных мембранах хлоропластов листьев и ядрах клеток корня. Это может быть связано с особыми функциями АДК в различных типах клеток (Кузнецов и др., 2006). Накопление Пут и увеличение активности АДК наблюдается, как правило, при неблагоприятных условиях, таких как засоление, засуха, гипертермия, дефицит калия, серы и др. В связи с тем, что АДК локализована в хлоропластах, её активность и уровень Пут выше на свету, чем в темноте (Borrell et al., 1996; Bouchereau et al., 1999). У растений шпината АДК в норме ассоциирована со светособирающим комплексом фотосистемы П. Очевидно, синтезированные в хлоропластах ПА, необходимы для стабилизации фотосинтетических комплексов тилакоидных мембран при стрессе (Legoska, Zaichert, 1999).
Фермент ОДК у растений локализован в цитоплазме и, по некоторым, данным, в ядре (Slocum, 1991b). По сравнению с животными, ОДК растений обладает большей стабильностью (Michael et al., 1996). Однако, у некоторых видов растений, в т.ч. у Arabidopsis thaliana L., путь синтеза путресцина посредством ОДК, отсутствует (Hanfrey et al., 2001). У других, например, у винограда он не играет значимой роли в накоплении ПА (Bauza et al., 2007).
Основная роль в регуляции синтеза ПА у животных, грибов и, по-видимому, растений отводится активности двух ферментов: ОДК и S-аденозилметиониндекарбоксилазе (8АМДК). ОДК отщепляет от L-орнитина карбоксильную группу, в результате получается путресцин. БАМДК отщепляет от S-аденозилметионина (SAM) аминопропиловую группу, необходимую при синтезе Спд и Спм (Martinanguy, 2001). SAM синтезируется последовательной трансформацией L-метионина метионинаденозилтрансферазой. Это соединение является предшественником для двух полиаминов (спермидина и спермина) и этилена (рис. 3). S-аденозилметиониндекарбоксилаза, регулируя два биосинтетических пути, является, по-видимому, скорость-лимитирующим фактором в синтезе ПА. Кроме этого его содержание в живых организмах очень мало и он имеет короткое время полужизни (около 1-2 ч). Активность SAAfflK обнаружена только в цитоплазме (Tabor and Tabor, 1984; Borrell et al., 1996; Tiburcio et al., 1997; Janneetal., 2004).
Фермент СПДС локализован в цитоплазме (Tiburcio et al., 1997). Уровень Спд и Спм тесно связан с содержанием их непосредственных предшественников: для Спд - Пут, для Спм - Спд.
Неожиданные данные получены Janne с сотрудниками (Janne et al., 2004; Kusano et al., 2007). Показана возможность обратного перехода: Спм в Спд, а Спд в Пут. Эти реакции осуществляются следующим образом: в аце-тилировании спермина и спермидина участвуют спермидин- или спермин-Nl-ацетилтрансферазы, а затем сперминоксидаза или ацетилполиаминокси-даза окисляют ацетилированные ПА. Такие обратные превращения ПА могут быть чрезвычайно важны при регуляции их уровня в неблагоприятных условиях. Таким образом, присутствие в растениях многоступенчатого биосинтеза ПА указывает с одной стороны, на сложную систему регуляции их синтеза, с другой, возможно, на необходимость поддержания этого синтеза в любых, даже неблагоприятных условиях.
Гены, кодирующие ферменты биосинтеза ПА, идентифицированы для многих растений, особенно полно, для Arabidopsis thaliana. В этом растении были идентифицированы два различных гена, кодирующих АДК (ЕС 4.1.1.19) {АДК1 и АДК2) (Watson and Malmberg, 1996; Watson et al., 1997), но многие попытки клонировать ген ОДК потерпели неудачу, на основании этого было сделано предположение, что ОДК путь в этом растении отсутствует (Hanfrey et al., 2001). Однако позже в тилакоидных мембранах была выявлена предполагаемая (мнимая) ОДК, активность которой ингибировалась дифлюороме-тилорнитином. На основании этого было высказано предположение о существовании фермента, выполняющего функции ОДК. Однако ген, кодирующий этот белок, имеет последовательность нуклеотидов, значительно отли чающуюся от известных ОДК кодирующих генов (Tassoni et al., 2003).
Из A. thaliana выделено четыре гена, кодирующих S-аденозилметиониндекарбоксилазу {БАМДК, ЕС 4.1.1.50) (Franceschetti et al., 2001). Среди семейства генов, только БАМДКІ и SAAfflK2, кодируют функциональный фермент, в то время как остальные два гена могут не экспресси-роваться (Bagni et al., 2006). В зависимости от вида растений фермент SAM кодируется семейством из трёх-четырёх генов (Espartero et al. 1994).
Геном A. thaliana содержит два гена, кодирующих спермидинсинтазу (СПДС, ЕС 2.5.1.16). Экспрессия обоих генов СПДС1 и СПДС2 влияет на активность фермента СПДС (Hanzawa et al., 2002). Выделено два гена, кодирующих сперминсинтазу {СПМС, ЕС. 2.5.1.22): ACAULIS5 (ACL5) и СПМС (ранее известный как СПДСЗ) (Hanzawa et al., 2000).
Определение содержания свободных полиаминов
Свободные полиамины в растительной ткани определяли в виде их бензоильных производных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Flores and Galston, 1982).
Полиамины экстрагировали из замороженных в жидком азоте образцов. От 0,1 до 0,3 г растительного материала гомогенизировали в фарфоро вой ступке с 5 мл охлаждённой 5%-ной хлорной кислоты при помощи пестика. В качестве внутреннего стандарта в гомогенизированный образец в зависимости от навески добавляли 20-50 мкл 1 мМ раствора диаминогексана (Sigma). Экстракцию проводили в течение 1 ч при 0С. После инкубации, проводили очистку экстракта фильтрованием под вакуумом на колбе Бюнзе-на через стеклянный фильтр GF/C фирмы WHATMAN. В профильтрованный экстракт добавляли 5 мл 2N NaOH для создания щелочной среды, в которой образуются бензоилпроизводные. Смесь интенсивно перемешивали на шей-кере в течение 20 с, затем добавляли 30 мкл бензоилхлорида (Sigma) и вновь активно перемешивали в течение 60 с. Полученную смесь инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре для образования бензоилпроиз-водных. Реакцию прекращали добавлением 2 мл насыщенного раствора NaCl. Образовавшиеся бензоильные производные полиаминов экстрагировали из смеси 3 мл диэтилового эфира. После расслоения жидкостей, отделившийся слой эфира аккуратно переносили в чистую стеклянную пробирку и промывали дистиллированной водой. После расслоения жидкостей слой эфира переносили в полипропиленовую микроцентрифужную пробирку типа Ерреп-dorf. Эфир выпаривали под тёплой струёй воздуха на приборе Silli Therm. Heating Module (фирма Piers) при температуре +37С. После полного испарения эфира, полипропиленовые пробирки с сухими экстрактами бензоильных производных полиаминов хранили при -20С.
Количественное определение бензоильных производных свободных полиаминов проводили на жидкостном хроматографе HP 1090 (фирмы Hewlett-Packard, США). Для анализа использовали колонку Hipersil ODS 5мкм (размер колонки: длина - 100 мм; внутренний диаметр - 2,1 мм). Разделение производных полиаминов проводили в режиме градиентного элюирования смесью метанола в воде от 10% до 100% метанола со скоростью потока элю-ента 0,4 мл/мин. Режим градиентного элюирования приведен в таблице 2. Время полного анализа: 15 мин. Детектирование разделенных производных полиаминов осуществляли при длине волны 254 нм и чувствительности 0,200Е.
Пробу производных полиаминов, приготовленную вышеописанным способом, растворяли в 100 мкл метанола и при помощи микрошприца Hamilton вводили в хроматограф 30 мкл. Количество свободных полиаминов рассчитывали по следующей формуле: Р= L, xIs (1), LIS хМхКР где: Р — количество данного полиамина (нмоль/г сырой массы); LP — высота пика данного полиамина (см); Is — количество внутреннего стандарта, добавленного к пробе растительного материала (нмоль); Lis - высота пика внутреннего стандарта (см); Кр - соотношение высот пиков эквимолярных количеств внутреннего стандарта и данного полиамина (Кр = LIS_CT ILP_CT), (высоту L/s-ст и Ьр.ст определяли по хроматограмме стандартов полиаминов (Fluka, Швейцария). М— масса пробы, г. Определение содержания полиаминов проводили в 3 биологических повторностях.
Определение количества перекиси водорода проводилось колориметрическим методом, основанном на образовании окрашенного комплексного соединения — пероксида титана (Brennan, Frenkel, 1977). Замороженные образцы массой 0,1 - 0,2 г гомогенизировали в жидком азоте, переносили в полипропиленовые микроцентрифужные пробирки Eppendorf и заливали 0,5 мл ледяного ацетона. Экстракты центрифугировали при 10000 g и 4 С в течение 15 мин. К супернатанту добавляли 15% Ti(S04)2 до достижения конечной концентрации реактива 4 % и тщательно перемешивали. Для осаждения комплекса пероксида титана в реакционную смесь добавляли 0,1 мл ЮМ раствора NH4OH. После центрифугирования в течение 10 мин при +4С, при 10000 g (Biofuge fresco by Heraeus, Германия) осадок промывали 3-5 раз в ацетоне. Промытый осадок растворяли в 2 мл 1М H2SO4. Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре при 415 нм, против контроля, содержащего чистый ацетон вместо экстракта из образца (Genesys 10 uv, Thermoelectron corporation, США).
Изменение активностей антиоксидантных ферментов в растениях Thellungiella halophila при действии NaCl
Таким образом, листья растений 7. halophila, в отличие от корней, отвечали на действие NaCl повышением активностей исследованных антиокси-дантных ферментов и усилением экспрессии гена Cu-Zn/СОД, особенно заметным в течение первых суток стрессорного воздействия. При этом корни и листья растений обладали конститутивно высоким уровнем экспрессии генов Cu-Zn/СОД и Мп/СОД, что согласуется с данными, полученными Taji с соавторами (Taji et al., 2004).
В целом функционирование антиоксидантных ферментов - СОД и каталазы в растениях Th. halophila согласуется с галофитной природой данного растения и указывает, что данная концентрация 100 мМ является стрессовой.
Поскольку функционирование ферментов антиоксидантной защиты является только частью общего ответа растения на стресс, важно было изучить степень участия таких многофункциональных низкомолекулярных соединений, как ПА. В проведенных нами экспериментах обнаружено увеличение общего содержания свободных ПА в корнях и листьях Th. halophila, вызванное действием 100 мМ NaCl (рис. 12), за первые сутки. В дальнейшем в обоих органах содержание свободных ПА снижалось, причём наиболее заметно в корнях и через 96 ч становилось сопоставимым с их уровнем в контроле. В отличие от исследованных нами активностей антиоксидантных ферментов, увеличение которых наблюдалось за первые сутки только в листьях, содержание ПА увеличивалось в обеих частях растения. Следует отметить, что конститутивный уровень свободных ПА в обеих частях растения близок. Динамика содержания ПА в условиях засоления также имеет сходный характер и в корнях, и в листьях. В связи с этим мы предположили, что при действии засоления будет меняться соотношение отдельных представителей свободных ПА путресцинового ряда в обоих органах.
В корнях и листьях Th. halophila нами отмечен высокий конститутив ный уровень Спд (рис. 13), изменение содержания которого и определяло общую динамику содержания свободных ПА (рис. 12). Хотя уровень Пут был низким, в течение первых суток воздействия наблюдалось чёткое увеличение его содержания, особенно заметное в листьях (рис. 13). Высокий и стабильный уровень Спд, на фоне низкого содержания Пут, согласуются с галофит-ной природой 77г. halophila.
Исследование экспрессии генов биосинтеза ПА, показало, что увеличение содержания Пут коррелировало с усилением экспрессии гена аргининде-карбоксилазы (особенно в листьях) через 12 ч действия NaCl (рис. 14). Однако уже после первых суток действия NaCl содержание Пут в обоих органах выходило на стационарный уровень, близкий к уровню в контрольных растениях.
Поддержание содержания Пут на стабильном уровне при действии стрессорного фактора возможно необходимо для постоянного синтеза Спд и Спм.
При исследовании дифференциальной экспрессии генов, кодирующих ферменты биосинтеза ПА нами обнаружено, что через 12 ч после начала действия засоления уровень транскрипта гена БАМДК, ключевого фермента биосинтеза ПА, увеличивался. Особенно заметно это увеличение было в листьях растений. Тем не менее, уровень транскрипта данного гена резко снижался до уровня в контрольных растениях уже через сутки действия NaCl (рис. 14). Полученные нами данные согласуются с проведенными ранее исследованиями на различных по устойчивости к засолению сортах риса. В частности было показано, что экспрессия гена БАМДК у устойчивого сорта увеличивалась уже через 1 ч после воздействия, в то время как у неустойчивого значительно запаздывала (Li, Chen, 2000).
Выявленные нами изменения в экспрессии гена БАМДК не коррелировали с экспрессией гена, кодирующего SAMC, также необходимого для синтеза SAM. Экспрессия гена SAMC оставалась стабильно высокой на протяжении всего эксперимента в корнях и листьях. Это свидетельствует о поддержании содержания аминопропиловых групп на необходимом для синтеза Спд и Спм уровне.
Наблюдаемое в течение первых суток действия NaCl в корнях и листьях увеличение содержания эндогенного Спд коррелировало с увеличением экспрессии гена, кодирующего фермент СПДС1 (рис. 14). Однако на фоне сохраняющегося высокого уровня транскрипта данного гена, после 24 ч увеличения содержания Спд не наблюдалось.
Изменение активностей антиоксидантных систем растений Geum urbanum при действии УФ-В
Проведенные исследования показали, что при действии двух видов стресса (NaCl и УФ-В) у исследованных видов растений {Thellungiella halo-phila, Plantago major и Geum urbanum) наблюдались разнонаправленные изменения в содержании свободных ПА.
Действие засоления не вызывало значительного стресс-зависимого накопления ПА ни у одного из исследованных растений. Показано, что наиболее критичным периодом для исследованных растений являются первые 24 ч действия засоления. За это время в содержании и спектре ПА отмечаются наиболее существенные изменения, характеризующие устойчивость растения к действию стрессорного фактора. В последующем устойчивость исследуемых растений, вероятно, определяется способностью поддерживать пул ПА на определенном уровне.
При действии УФ-В облучения у 77z. halophila и G. urbanum наблюдалось существенное повышение содержания свободных ПА в листьях, обусловленное накоплением Пут. Подобная динамика Пут может быть связана с необходимостью защиты клеточных мембран, подвергающихся при действии УФ-В более сильному разрушению.
Основным отличием в действии засоления и ультрафиолета был индуцируемый последним органоспецифичный синтез кадаверина в корнях P. major L. и листьях 7. halophila Меу.
Анализ экспрессии ключевых генов биосинтеза ПА у Th. halophila Меу. и P. major L. показал существенные изменения в уровне их транскриптов при обоих видах стресса. При засолении повышение общего содержания ПА было заметно только в первые сутки в корнях и листьях Th. halophila Меу. Одновременно с этим, усиливалась экспрессия ключевых генов биосинтеза ПА - АДК и БАМДК, экспрессия остальных генов этого пути оставалась ста бильно высокой. Для P. major L. на фоне снижения общего содержания ПА увеличивался уровень транскриптов генов МетС, &АМДК и СПМС1 в обеих частях растения, и уровень транскриптов гена СПДС1 в листьях. Таким образом, действие засоления на гликофит P. major вызывало изменения в большем числе генов ферментов биосинтеза ПА, чем у галофита 77г. halophila. Возможно, это связано с эволюционно сформировавшимися механизмами солеустойчивости галофита.
Действие УФ-В облучения на растения Th. halophila вызывало изменение большего числа генов ферментов биосинтеза ПА по сравнению с действием засоления. В частности в листьях усиливалась экспрессия генов АДК, МетС, SAMC, СПДС1, СПМС, ЛДК; в корнях - МетС, SAMC, ЛДК. Увеличения экспрессии ключевого гена — БАМДК не наблюдалось ни в листьях, ни в корнях. В листьях P. major при действии УФ-В облучения отмечалось увеличение экспрессии всех исследованных генов ферментов биосинтеза {МетС, SAMC, ЗАМДК, СПДС1, СПМС1). Параллельно с этим в корнях Р. major отмечено снижение экспрессии этих же генов. Таким образом, действие УФ-В облучения, вызывающего более сильный окислительный стресс, затрагивает экспрессию генов всего пути биосинтеза ПА. Это косвенно может свидетельствовать о важности поддержания пула ПА на определенном уровне при повышенном образовании АФК.
Показано, что оба стресса вызывали изменения в содержании и спектре свободных ПА у всех изученных растений, что свидетельствует об участии этих низкомолекулярных соединений в защитном ответе растения и необходимости поддержания пула ПА на определенном уровне. Кроме того, изменение экспрессии генов при действии двух изученных стрессоров свидетельствует о транскрипционном контроле уровня свободных ПА.
Другим возможным механизмом регуляции уровня свободных ПА является их окислительная деградация полиаминоксидазой и диаминоксидазой, о чём свидетельствовали изменения в содержании ДАП - продукта окисли тельной деградации ПА. Возможно также, что дополнительная регуляция уровня ПА связана с образованием конъюгатов ПА с фенолами или другими соединениями. Таким образом, совокупность данных об изменении пула ПА при действии обоих видов стресса однозначно свидетельствует о физиологической важности данных соединений при формировании защитного ответа.
Исследования активности СОД, ключевого фермента антиоксидантной защиты выявили, зависящие от вида растения, органоспецифичные изменения при действии стрессоров. Функционирование СОД при действии засоления и УФ-В облучения было необходимым, но недостаточным условием, определяющим адаптационный потенциал исследованных растений. По этой причине увеличение пула ПА, как неферментативных антиоксидантов могло обеспечивать адаптацию растений к действию исследованных неблагоприятных факторов.
