Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Общая характеристика работы 6
1.1. Актуальность проблемы 6
1.2. Задачи исследования 8
1.3. Научная новизна проведенных исследований 9
1.4. Практическая ценность 10
1.5. Апробация работы 10
Глава 2 11
2.1. Супероксиддисмутаза как один из ключевых компонентов системы защиты клеток и тканей от окислительного стресса 11
2.2. Регуляция активности СОД на различных уровнях организации 14
2.3. РНК-интерференция и косупрессия 16
2.4. Малые РНК растений 18
2.5. siPHK растений 21
2.5.1. Механизм продукции и функции siPHK 21
2.5.2. Биологическая роль siPHK 23
2.6. МиРНК растений 23
2.7. Процессинг миРНК растений 27
2.8. Эволюция растительных МИР генов 32
2.9. Применение РНК-интерференции 38
Глава 3. Материалы и методы 41
3.1. Объекты исследований 41
3.2. Проведение молекулярных анализов 45
3.2.1. Выделение тотальной РНК из растительного материала фенол-хлороформным методом для определения уровня экспрессии микроРНК 45
3.2.2. Нозерн-блот анализ для детекции коротких РНК с ДНК-олигонуклеотидом 46
3.2.3. Очистка тотальной РНК от примесей ДНК для проведения ОТ-ПЦР 49
3.2.4. Обратная транскрипция 49
3.2.5. Подбор праймеров для проведения обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и зондов для Нозерн-блот гибридизации 50
3.2.6. Условия проведения ПЦР-анализа 50
3.2.7. Подготовка проб для секвенирования нуклеотидных последовательностей генов 54
3.3. Проведение вестерн-блот анализа 54
3.3.1. Экстракция белков из тканей растения 54
3.3.2. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле 56
3.4. Математическая обработка данных 58
Глава 4. Результаты и обсуждение 59
4.1. Разработка методических подходов для исследования экспрессии miR398 59
4.2. Анализ уровня экспрессии семейства miR398 у 77г. salsuginea при действии NaCl, света высокой интенсивности и UV-B облучения 63
4.2.1. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии NaCl 63
4.2.2. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии света высокой интенсивности 66
4.2.3. Экспрессия miR398 и гена CSD1 при действии UV-B облучения. 68
4.3. Исследование экспрессии miR398 в каллусной культуре 71
77г. salsuginea 71
4.4. Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea на экспрессию генов МИР 398, CSD1 и CCS1 73
4.5. Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений 77г. salsuginea на содержание белков CSD1 и CCS1 79
4.6. Исследование экспрессии генов Argonaute, DCL1, DDR1, SPL7, связанных с процессингом miR398 в растении 77г. salsuginea. 81
4.7. Обсуждение 85
Заключение: 91
Выводы 95
Список литературы
- Научная новизна проведенных исследований
- Механизм продукции и функции siPHK
- Подбор праймеров для проведения обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и зондов для Нозерн-блот гибридизации
- Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea на экспрессию генов МИР 398, CSD1 и CCS1
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение устойчивости растений к действию неблагоприятных факторов внешней среды остается одним из центральных направлений физиологии растений. На сегодняшний день, очевидно, что существует сеть метаболических реакций, формирующих способность растений адаптироваться к изменяющимся условиям. Однако наименее изученным аспектом в проблеме устойчивости остается вопрос о регуляторных механизмах, позволяющих координировать функционирование всего комплекса реакций защитного ответа. Регуляция стрессорного ответа может осуществляться на генном, транскрипционном, посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях организации. Одним из важных элементов посттранскрипционной регуляции активности генов является механизм умолкания генов, обусловленный РНК-интерференцией (РНКи). Обнаружение феномена РНКи в опытах на нематоде в 1998 году позволило выявить новый пласт регуляторных процессов, которые вовлечены в регуляцию экспрессии генов у большинства эукариот. В настоящее время механизм РНКи стал важным инструментом функциональной гено-мики, позволяющий специфически регулировать активность генов. В последнее время стало ясным, что в основе механизмов РНКи лежат процессы умолкания генов, который обусловлен экспрессией малых РНК.
В растениях Arabidopsis thaliana L. было обнаружено два основных класса малых РНК размером 21-23 нк., участвующих в подавлении экспрессии генов: siPHK (small interfering РНК) (Baulcombe, 1999) и миРНК (micro РНК) (Barrel, 2001). Роль siPHK заключается в защите клетки от вызванной РНК-вирусами инфекции, в то время как миРНК закодированы в геноме многоклеточных организмов в виде шпилечного предшественника (пре-миРНК) и регулируют активность генов в цитоплазме и ядре (Barrel, 2004).
Недавние исследования показали, что миРНК способны регулировать комплекс биологических процессов в растениях такие как гормональный контроль, иммунный ответ, полярный рост и адаптация к неблагоприятным условиям (Voinnet, 2009). Все больше появляется данных о том, что в условиях стресса изменяется как экспрессия миРНК, так и экспрессия мРНК - генов мишеней, а также активность миРНК-белковых комплексов (Leung et al., 2010).
После проведения биоинформационного анализа было выдвинуто
предположение о возможной посттранскрипционной регуляции генов Cu/Zn-СОД с помощью miR398 (Bonnet, 2004; Sunkar, 2004). Изменение уровня экспрессии miR398 было отмечено у A. thaliana под действием абиотических стресс-факторов и при бактериальном поражении растений (Sunkar, 2006).
В работах Yamasaki (2007) сообщалось, что изменение содержания меди в питательной среде растений влияет на экспрессию, как минимум, двух из трех МИР генов, кодирующих miR398 (miR398 b, с), при этом также изменялся уровень мРНК генов CSD. Несмотря на это, точный молекулярный механизм данного процесса остается пока слабо изученным. К тому же остается неизвестным факт наличия miR398 опосредованной регуляции генов CSD у более устойчивых к действию абиотических стрессов растений-галофитов.
Из всего вышесказанного становится очевидным, что изучение явления РНКи открывает большие перспективы для понимания механизмов миРНК-опосредованной регуляции экспрессии генов в растениях, а также позволяет создавать трансгенные растения нового поколения, реализующие свой адаптивный потенциал для сохранения продуктивности в условиях стресса.
Цель диссертационной работы заключалась в исследовании роли микроРНК в посттранскрипционной регуляции генов Cu/Zn-СОД и гена CCS в растении Thel-lungiella salsuginea (Pallas) (Th. salsuginea) при действии стрессоров различной физической природы.
Задачи исследования:
1. Исследовать экспрессию семейства генов miR398 и изучить изменение
уровня экспрессии miR398 при действии различных видов абиотических стрессоров
(засоление, UV-B, свет высокой интенсивности, различные концентрации меди в
питательной среде растений).
Исследовать органоспецифичность экспрессии miR398 при стрессе.
Сравнить закономерности процессинга miR398 с экспрессией генов Cu/Zn-СОД.
Исследовать экспрессию генов Cu/Zn-СОД к гена CCSу растений Th. salsuginea при различном содержании меди в питательной среде в связи с изменением уровня экспрессии miR398.
Исследовать уровень экспрессии генов Argonaute (Ago), экзонуклеазы Dicer-
likel (DCL1), транскрипционного фактора Squamosa promoter binding protein-like 7 (SPL7), РНК-зависимой РНК-полимеразы 1 (RdRPl), вовлеченных в процесс образования и функционирования miR398 в условиях стресса.
Научная новизна проведенных исследований. Впервые показано, что экспрессия miR398 наблюдается у растений-галофитов. Установлено, что у растений 77г. salsuginea мишенью консервативной miR398 могут выступать мРНК цитозольной Cu/Zn-СОД (CSD1). Другой из возможных мишеней miR398 может быть мРНК шапе-рона меди CCS1, доставляющего ионы меди к апобелкам Cu/Zn-СОД в различные компартменты клетки.
Впервые показано, что экспрессия miR398 осуществляется не только в надземной части растений, но и в корнях взрослых растений 77г. salsuginea, что свидетельствует об отсутствии органоспецифичности. Показано, что у растений 77г. salsuginea экспрессия miR398 зависит от концентрации меди в питательной среде, и в условиях её отсутствия значительно увеличивается, вызывая умолкание гена CSD1, sl также гена CCS1. Это подтверждает важную биологическую роль miR398 опосредованной регуляции экспрессии генов при стрессе у растений 77г. salsuginea, sl также указывает на возможность существования в растительных клетках множества мишеней для уже открытых в настоящее время микроРНК.
Практическая ценность. Полученные в результате проведенных исследований данные расширяют представления о регуляторных механизмах функционирования защитного ответа растений на повреждающие воздействия стрессоров. Исследованное в ходе работы явление миРНК опосредованной регуляции генов антиоксидантных ферментов, указывает на наличие посттранскрипционных превращений мРНК на пути созревания соответствующих белков у растений 77г. salsuginea. Возможно также, что этот механизм принимает участие в сигнальном каскаде в растениях, находящихся в условиях стресса, или при изменении концентрации эссенциальных элементов в питательной среде. Полученные данные могут быть использованы для разработки стратегии создания трансгенных растений, реализующих свой потенциал для сохранения высокой продуктивности в условиях стресса. Все полученные материалы могут быть включены в курс лекций для студентов биологических ВУЗов. Апробация результатов работы. Данные, представленные в работе, докладывались на конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (г. Пущино, Россия,
2009, 2010, 2011), XVII Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (г. Валенсия, Испания, 2010), а также на Годичном собрании ОФР (г. Апатиты, Мурманская область, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 4 в журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы, 2 схемы и 28 рисунков. Список цитируемой литературы составляет 153 наименования, из которых 142 на иностранном языке.
Научная новизна проведенных исследований
За последние десятилетия накоплен значительный, материал о многообразии ответных реакций растений надействие стрессоров различной; природы. Установлено, что общим характерным признаком действия стрессоров, является усиление генерации активных форм кислорода (АФК) и; возникновение окислительного стресса (OG). ОС возникает и развивается в результате нарушения баланса между образованием АФК и функционированием системы антиоксидантной защиты растения.
К АФК относятся высокореакционные соединения, образующиеся в результате неполного восстановления кислорода. Взаимодействие активных радикалов с белками, липидами, нуклеиновыми кислотами приводит к нарушению структуры и функции мембран, ферментов и, в; итоге, к остановке клеточного цикла и смерти (Bieza et al., 2001). Растение обладает целой системой метаболических реакций, позволяющих нейтрализовать повреждающее действие АФК. В эту защитную систему включены как антиоксидантные ферменты, так и низкомолекулярные антиоксиданты. Активация или стимулирование антиоксидантных ферментов и усиление синтеза низкомолекулярных соединений в настоящее время считается общим механизмом устойчивости, обуславливающим формирование адаптационного ответа растения к действию любого стресс-фактора. В ответ . на усиление генерации АФК, как правило, наблюдается увеличение активности ключевых антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД), различных пероксидаз (ПО), каталазы и ферментов аскорбат-глутатионового цикла (Kliebenstein et al., 1998). Среди низкомолекулярных соединений наиболее распространенными антиоксидантами являются пролин, полиамины, токоферол, аскорбат и др.
Антиоксидантные ферменты являются обязательными компонентами и защитного ответа растения. Однако при действии стрессоров (например, засоления, или засухи) очень часто наблюдается не активация; а ингибирование активности; антиоксидантных ферментов; Существует много различных гипотез; объясняющих это явление: Одним из: них является-образование агрегатовбелковш условиях; изменения-осмотическогобаланса;В клетке; (Rudenko et all, 2006);; восстановление же их,активности или индукции синтеза de: novo требует определённого? времени. В ряде случаев вопрос: о механизмах регуляции; биосинтеза; например» СОД- остается еще; наименее объяснимым; Известно; ЧТО; регуляция- активности белков; СОД; может происходить на различных этапах процессинга этого фермента; втомчисле и на посттранскрипционном/уровне с участием? миРНК (Sunkar et al?, 2006.; Carthew et al., 2009).
СОД. представлена семейством металлоферментов; катализирующих реакцию дисмутации супероксидных радикалов в различных компартментах клетки: хлоропластах, митохондриях, пероксисомах, цитозоле и. апопласте (Бараненко, 2006) с образованием перекиси водорода:
Физиологическую функцию СОД связывают с защитою клеток от свободно радикального повреждения. В; обычных условиях это семейство ферментов5 поддерживает концентрацию супероксидных, радикалов на определенном уровне, защищая тем самым клеточные; структуры от повреждающего? действия как самих супероксидных; радикалов; так и от появления других активных форм кислорода. (JitheshietaK, 2006; BlokHina et al!, 2003; MittovaetaH, 2003);
Механизм реакции дисмутации заключается в последовательном; восстановлении супероксидными радикалами металла- активного центра фермента СОД: Реакция может протекать спонтанно,, но в присутствии фермента скорость, повышается в 10000 раз (Blbkhina О: et al;, 2003; Бараненко В;В, 2006).
СОД в клетке присутствует в виде нескольких изоформ. йзоформы СОД различаются? между собой по типу металла, встроенного в активный центр фермента (Cu/Zn-ЄОД, Fe-СОД, Мп-СОД), по молекулярной массе,
локализации в клетке, чувствительностью к ингибиторам (Jithesh MiN;. et air,
2006), Си/2п-С0Д( обнаружена; в клетках, как прокариотических,; так .из эукариотических: организмов и; является? наиболее распространенной; в? клетках;растений: онаюбнаруженаво всех внутриклеточных компартментах,. ai также; в апопласте; Цитозольная Cu/Zh-ЄОДІ растительного; и животного происхождения является гомодимером, состоящим издвух равного размера і субъединиц связанных нековалентно (массаі изоформы колеблется; в? пределах 32r34i кДа), хлоропластная изоформаї растений является гомотетрамером Марганец содержащая изоформа обнаружена как у эукариот, так и? у прокариот. У эукариот эта изоформа локализована в матриксе митохондрий и пероксисомах, но в печени человека; и павиана, фермент: присутствует в; значительном количествешвцитозоле (Rio etaL, 2003). Молекулярная масса фермента1; 46 или 92кДаш состоит соответственно; из 2 или; 4 субъединиц; одинакового размера (Blokhina et al., 2003; Бараненко, 2006; Jitheshetal., 2006).
Железосодержащая: изоформа не обнаружена! в: клетках животных, у растений локализована в хлоропластах - как; в строме, так, и на мембранах тилакоидов: Кроме хлоропластов фермент обнаружен- в нефотосинтезирующих органеллах и тканях: в пероксисомах листьев-Lycopersicom esculentum;пероксисомах лепестков гвоздики,, а» также в= цитозоле клубеньков некоторых бобовых - клевера, сои, фасоли: Однакове у всех бобовых обнаружен фермент в цитозоле клубеньков: у люцерны и гороха от локализован исключительно в хлоропластах. Молекула Ее-ЄОД. работает в форме гомодимера, имеет молекулярную массу 36-46 кДа; в хлоропластах и 54 кДа - в цитозоле клубеньков бобовых (Бараненко, 2006; Jithesh et аії, 2006
Изоформы СОДотличаютсяразной чувствительностью к, ингибиторам CN- и H202. Так, Cu/Zn-СОД ингибируется CN- и Н202, Fe-СОД только Н202, а Мп - СОД не подвержена ингибированию указанными веществами (Blokhina et al., 2003; Бараненко, 2006).
Характерной особенностью клеток растений, отличающих их от клеток других организмов, является наличие всех трех изоформ № множественность изозимов: форм СОД- Количество- изозимов? колеблется от одного вида растений к другому (Бараненко В.В., 2006). В A. thaliana обнаружено три Cu/Zn- СОД одна Fe-СОД и три Mn-СОД (Jithesh et al, 2006). Так в клетках листьев кукурузы обнаружено 9 изозимов.
Механизм продукции и функции siPHK
Объектами исследований являлись взрослые 6 недельные растениям Thellungiella salsuginea (Pallas) О.Е. Schulz. Семена растений Th. salsuginea были предоставлены; профессором Антман (Англия). В исследованиях, для сравнительной оценки изучаемых параметров был использован контрастный по устойчивости вид - Arabidopsis thaliana L. экотип Dijon.
МЪрфо-физиологичесие особенности растения Thellungiella salsuginea P. Теллунгиэлла солонцовая - Thellungiella salsuginea (Pallas) О.Е. Schulz, семейство Крестоцветные (Brassicaceae). Одно- или двулетние растения, обычно с одиночным стеблем 10-30 см высотой. Прикорневые листья во время цветения опадающие, черешковые, сидячие, продолговатые и тупые, верхние ланцетные и заостренные, при основании глубоко сердцевидные, 4 -20 мм длиной, 1.5 - 4.5 мм шириной. Цветки мелкие, на тонких цветоножках 2-8 мм длиной, в кистях. Лепестки белые, обратнояйцевидные, при основании суженные в ноготок, наполовину короче пластинки, с которым 2.25 - 3 мм длиной и 1 - 1.25 мм- шириной: Стручки 1 - 2 см длиной, линейные, тупо-4- гранные, немного сжатые. Створки с 1 жилкой. Семена 0.5 -0.6 мм длиной, красновато-бурые, точечно-ямчатые, пылевидные. Число хромосом: 2п=14. (Малышева и др., 1994.).
Местообитание: На солонцах, солончаках, солонцеватых- лугах, по берегам засоленных озер. Тюменская, Омская, Новосибирская, Кемеровская, Иркутская области. Алтайский край, Красноярский край, Хакасия, Тува, Якутия. Южный,Урал, Средняя Азия, Монголия, Сев. Китай.
Посев семян: Семена Th. salsuginea и A. thaliana высевали на поверхность влажного перлита в кюветы, сверху закрывали стеклом и подвергали влажной стратификации-при 4С в течение недели. Проростки пересаживали в кюветы с новым перлитом и выращивали в,течение двух недель при подкормке 1/10- нормы питательной среды Джонсона, модифицированной по Винтер (Winter, 1973).
Пересадка проростков в условия водной культуры. При формировании 3-й пары листьев (в возрасте 3-4 недели) растения 77г. salsuginea и A. thaliana переносили на водную культуру, на полную питательную среду Джонсона, рН=6.6 (Winter, 1973). Для выращивания растений1 использовали пластиковые кюветы объёмом 4л. Растения выращивали в камере фитотрона при 12 часовом световом периоде, под люминесцентными лампами суммарной поглощаемой мощностью 360Вт, при температуре 23 ± 1С днем и 16 ± 1С ночью, при влажности воздуха 55/70% соответственно. Питательный раствор меняли каждые трое суток.
Через 5-7 дней устанавливали систему аэрации с непрерывной подачей воздуха с помощью аквариумного компрессора АСО-5504 (Корея), мощностью 5 Вт (пропускная способность 4.5 литра в минуту). Перед подачей в питательный раствор воздух очищали, пропуская его через сосуд с хлопковым фильтром. Таблица 1. Состав питательной среды для выращивания растений.
При достижении растениями возраста 6 недель (стадия розетки, рис. 6 ) их подвергали обработке хлоридом натрия, сульфатом меди, облучению UV-B или светом высокой интенсивности.
Первую группу растений подвергали обработке хлоридом натрия путем внесения соли в питательный раствор до ее конечной концентрации 100 мМ или 300 мМ. Пробы корней и листьев отбирали через 6, 12, 24 ч от начала засоления.
Вторую группу растений подвергали UV-B облучению, для этого их переносили в камеру с УФ лампами ("Philips" 280 - 315 нм, Нидерланды) и облучали в течение 10 или 20 минут; доза облучения составляла 12.3 или 24.6 кДж/м соответственно. После облучения растения переносили в камеру фитотрона с контрольными условиями произрастания. Образцы листьев и корней отбирали через 0,5; 1; 6; 12 и 24 ч.
Третью группу растений подвергали обработке светом высокой интенсивности в течение 20 или 30 минут, используя4 для этого натриевую лампу ДНАТ (ФАР 54.1 Вт/м2 "Reflux 250", 650-750 нм., Россия). В процессе облучения растений поверхность листьев. охлаждали вентиляторами TITAN TFD-8025L12S 2000rpm (Тайвань), суммарной мощностью 5 Вт. Затем растения переносили в исходные условия и отбирали для анализа образцы листьев и корней через 1,6, 12 и 24 ч.
Четвертую группу растений подвергали обработке различных концентраций CuSC 4 путем её" внесения в свежий питательный раствор до конечной концентрации 1 мкМ или 100 мкМ Питательный раствор, не содержащий ионов меди, готовили в кюветах, обработанных ЮОмМ ЭДТА с применением деионизированной воды. Корни растений перед перенесением на среду без меди промывались 10 мМ ЭДТА. Свежий питательный-раствор готовили с использованием деионизированной воды. Пробы листьев и корней отбирали сразу после начала эксперимента и через 24 ч, полученные образцы хранили при -70С. Эксперименты проводили в трех биологических и трех аналитических повторностях.
В исследованиях для сравнительной оценки изучаемых параметров был использован контрастный по устойчивости вид - A. thaliana L. экотип Dijon.
Каллусные линии клеток, полученных из листьев Th. salsuginea выращивали на питательной среде Мурасиге-Скуга содержащей гормоны БАП и НУК в соотношении 1:4, на свету и в темноте. Каллусные экспланты пассивировали на новую среду каждые 10 дней. Третий пассаж использовали в экспериментах по воздействию метилвиологена (Acros, США) на каллусные клетки Th. salsuginea
Подбор праймеров для проведения обратной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и зондов для Нозерн-блот гибридизации
UV-B облучение, подобно действию других повреждающих абиотических факторов, вызывает ОС, следствием, которого является изменение активности СОД. Как было показано ранее (Радюкина Н.Л. и др., 2007), растения отвечают активацией СОД на действие 10 и 20 минутного UV-B облучения (Zhou et al., 2007), в дальнейшем основываясь на этих данных и результатах предварительных экспериментов мы использовали эти продолжительности стрессорного воздействия для изучения изменения уровня экспрессии miR398 и гена CSD1.
Влияние 10 минутного облучения UV-B на экспрессию генов тіК398(Нозерн-блот) и CSDV(ОТ-ПЦР) в листьях и корнях растений Тк salsuginea в течение 24ч.
Как показывают данные, представленные на рисунке 14, через 30 минут после 10 минутного UV-B облучения экспрессия miR398 в листьях изменялась незначительно. В корнях через 0,5 ч после облучения наблюдалось сильное снижение экспрессии miR398; увеличение уровня её экспрессии происходило через 1 ч, после чего уровень транскриптов падал. Следует отметить, что через 24 ч после облучения экспрессия miR398 снижалась в листьях и увеличивалась в корнях, т.е. как и в условиях засоления и при действии света высокой интенсивности (рис. 12, 13) имела место обратная зависимость между изменениями уровней miR398 в корнях и листьях.
Для изучения влияния изменений экспрессии miR398 на уровень экспрессии ее мишени - мРНК цитоплазматической Cu/Zn-СОД -исследовали экспрессию гена CSD1 методом ОТ-ПЦР. Полученные результаты показали, что через 0,5 ч после 10 минутного UV-B облучения в листьях этого растения наблюдалось значительное повышение уровня мРНК гена CSD1, который достигал максимума через 6 ч, затем постепенно понижался (рис. 14). Корни, подобно листьям, реагировали на облучение быстрым увеличением уровня экспрессии CSD1 с максимумом через 0,5 ч и последующим падением (рис. 14).
При увеличении продолжительности облучения UV-B до 20 мин уровень miPv398 в листьях увеличивался, так же как и при 10 минутном облучении, однако повышение уровня экспрессии miR398 наблюдалось через 1 час и достигало максимума через 24 ч (рис. 15). В корнях уровень экспрессии miR398 плавно снижался, начиная с 30 минут после облучения, но в точке 12 ч наблюдалась значительное увеличение экспрессии. Существенно, что в некоторые временные периоды (от 12 до 24 ч) после окончания UV-B облучения наблюдалась четкая обратная зависимость между изменением количества miR398 в листьях и в корнях (рис.15). 300
Влияние 20 минутного облучения UV-B на экспрессию генов тіІ1398(Нозерн-блот) и GSD/(ОТ-ПЦР) в листьях и корнях растений 77г. salsuginea в течение 24ч.
Через 30 мин после облучения уровень транскриптов гена CSD1 в листьях постепенно снижался, затем через 12ч начиналось его повышение. В корнях экспрессия гена CSD1, снижалась через 30 минут после облучения, затем резко увеличивалась к 12 ч; новое повышение уровня мРНК CSD1 было отмечено через 12 ч. с максимумом через 24 ч (рис. 15).
Сравнение уровней экспрессии гена CSD1 и miR398 (рис. 14, 15, 16) при двух дозах облучения показало четкий дозозависимый характер: более сильное облучение соответствовало более сильному изменению их экспрессии. В условиях облучения UV-B, в целом сохранялась тенденция к обратной зависимости между уровнями мРНК гена CSD1 и miR398, хотя и не была такой же выраженной, как при действии засоления и света высокой интенсивности листья корни
Каллусные культуры, а также культуры клеток, в отличие от целого растения, получают необходимые вещества из питательной среды. При этом каллусные клетки снижают свою ассимиляционную активность и как следствие, в некоторых случаях частично переходят к гетеротрофному питанию. Некоторые изоформы Cu/Zn-СОД (CSD2) имеют хлоропластную локализацию. Также известно, большая часть белков CCS1 также локализуются в хлоропластах (Beauclair et al., 2010). В связи с этим, можно предположить, что в каллусных и клеточных культурах могут инактивироваться некоторые элементы регуляции метаболических процессов важных для целого растения. В результате проведенных на взрослых 6 недельных растениях Th. salsuginea экспериментов было показано, что при действии различных стрессорных факторов и в листьях, и в корнях изменялся уровень экспрессии miR398. При этом наблюдался эффект ее разнонаправленной экспрессии в органах растений, то есть на фоне увеличения экспрессии miR398 в корнях, происходило снижение в листьях и наоборот. В связи с этим, было важным исследовать экспрессию miR398 в каллусной культуре Th. salsuginea.
Для исследования как конститутивной, так и стресс-зависимой экспрессии miR398 были проведены эксперименты по обработке метилвиологеном (параквата, 5 мкМ) двух каллусных линий Th. salsuginea: первую выращивали в термостате в темноте, вторую выращивали в камерах фитотрона на свету.
На рисунке 17 показаны результаты Нозерн-блот гибридизации 30 мкг тотальной РНК, выделенной из каллусов, выросших в темноте и на свету, после обработки 5 мкМ параквата. В контрольных каллусах, произраставших в нормальных условиях, miR398 конститутивно экспрессируется. Под действием гербицида параквата, на свету, экспрессия miR398 в каллусах увеличивается усиливается и затем, снижается в течение 3 часов. При обработке паракватом каллусной линии, выросшей в темноте, ни конститутивной, ни стресс-индуцируемой экспрессии miR398 не наблюдалось. Таким образом, экспрессия miR398 наблюдалась только в каллусах произрастающих на свету, что может указывать на инактивацию miR398 опосредованной регуляции генов в темноте. Это можно объяснить возможным переходом к гетеротрофному типу питания и деградацией хлоропластов, в каллусах, выросших в темноте. В каллусных линиях Th. salsuginea выросших на свету экспрессия miR398 носила стресс-зависимый характер и инактивировалась в первые часы после обработки паракватом.
В работах Sunkar (2006) и Beauclair (2010) было показано, что увеличение концентрации меди в питательной среде A. thaliana приводило к снижению экспрессии miR398, а снижение концентрации меди активировало экспрессию miR398. В работах Abdel-Ghany (2008) было выдвинуто предположение о. возможной роли miR398 в гомеостазе меди в клетках растений. В работе Beauclair. было показано, что в растениях A. thaliana, в условиях отсутствия меди в питательной, среде, miR398 осуществляла перераспределение ионов меди между другими медьсодержащими белками, вызывая посттранскрипционное умолкание генов CSD и CCS. По всей видимости, медь, которая не расходовалась на образование Cu/Zn-СОД использовалась растениями для сохранения активности пластоцианина, другого важного медьсодержащего белка, необходимого для фотосинтеза. Это позволяет объяснить наблюдение, что конститутивная экспрессия miR398 инактивирована в-каллусах, выросших в темноте.
В связи с вышесказанным, нам необходимо было исследовать, как изменяется экспрессия генов МИР 398, CSD и CCS в растениях 77г. salsuginea при действии различных концентраций меди в питательной среде
Исследование влияния различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea на экспрессию генов МИР 398, CSD1 и CCS1
Согласно литературным данным концентрация 100 мкМ для большинства растений является избыточной и если у растений нет специфических механизмов позволяющих исключить поступление тяжелого метала в клетки или изолировать его в специализированных компартментах, то данная концентрация может привести к гибели (Burkhead et al., 2009). Осуществленные эксперименты показали что растения A. thaliana является менее устойчивыми, чем Th. salsuginea не только к засолению, но и к действию тяжелых металлов, в частности меди. Внесение 100 мкМ C11SO4 в питательный раствор растений, . thaliana приводило к гибели большинства растений и лишь некоторые из них спустя неделю быстро зацветали и завершали свой онтогенез. У выживших растений miR398 экспрессировались в листьях и в цветоносах. В нижнем ярусе корней экспрессия miR398 не наблюдалось, на фоне едва заметной экспрессии в верхнем ярусе корней. Вероятно, медь не значительно накапливалась в надземной части растения, а также, судя по экспрессии miR398 в цветоносах. Возможно, растения в этих условиях прибегали к механизмам изоляции действия меди на генеративные органы, в них наблюдалась увеличение миРНК опосредованной регуляции CSDL
У более устойчивого растения Th. salsuginea 100 мкМ меди не только не вызывали гибели, но даже не вызывали пожелтения листьев. Лишь на 3 сутки эксперимента у этих растений незначительно темнели корни (рис. 27). При переносе растений на питательную среду содержащую, 100 мкМ CuS04, через сутки происходило заметное снижение содержания обоих исследованных беков (CSD1 и CCS1). О М CuS04 100 цМ CuS04
В проведенных нами исследованиях было показано, что у Th. salsuginea интенсивность экспрессии miR398 изменяется не только при засолении, но и при действии света высокой интенсивности, UV-B облучения и в условиях различных концентраций меди в питательной среде. Это указывает на стресс-зависимость такого механизма регуляции, функционирующего как в устойчивых, так и в чувствительных растениях. Уровень экспрессии miR398 у Th. salsuginea в ответ на действие стрессора носит дозозависимый характер, что особенно четко» проявляется в условиях засоления, а также действия5 различных концентраций меди. При этом наблюдалось отсутствие органоспецифичности. Можно полагать, что в основе этого явления» лежит интенсивность образования АФК, генерация которых возрастает при. усилении повреждающего воздействия стрессора. Нельзя исключать, что1 АФК, индуцирующие синтез антиоксидантных ферментов, одновременно ингибируют экспрессию miR398, что повышает эффективность функционирования клеточной антиоксидантной системы.
Анализ динамики уровней miR398 у растений Th. salsuginea в ответ на UV-B облучение и свет высокой интенсивности свидетельствует о том, что облучение листьев сопровождается чрезвычайно быстрым изменением экспрессии miR398 в корнях, которые непосредственно не подвергались стрессорному воздействию. Эти данные находятся в соответствии с ранее установленным фактом, согласно которому не только листья, но и корни 1 вовлекаются в формирование защитного ответа на действие UV-B облучения. Результаты экспериментов позволяют высказать предположение, согласно которому экспрессия? miR398 находится под контролем сигналов межорганного действия, которые инициируются в листе и передаются В корневую систему. Изучение роли miR398 в регуляции экспрессии CSD1 показало, что у галофита Th. salsuginea существует обратная зависимость между экспрессией генов CSD1 и miR398.
Из экспериментов по влиянию различных концентраций меди в питательной среде растений Th. salsuginea следует, что изменение экспрессии miR398 может зависеть от содержания меди в клетках растений и являться своего рода маркером ее доступности из питательной среды. При внесении 1 мкМ- CuS04 наблюдалось снижение экспрессии miR398. Снижение экспрессии miR398- приводит к ослаблению посттранскрипционной регуляции мРНК, в З -НТО областях которых были обнаружены сайты связывания с miR398. В результате этого наблюдалось увеличение содержания белков CCS1 и CSD1. Галофит Th. salsuginea проявляет значительную устойчивость к действию тяжелых металлов. В условиях отсутствия меди у Th. salsuginea происходило-увеличение уровня-экспрессии двух обнаруженных генов Fe-СОД. Возможно, это было частью компенсаторного механизма при снижении содержания белка Cu/Zn-СОД и его активности. Анализ экспрессии гена шаперона меди CCSl и содержания белка CCST В условиях действия различных, концентраций меди позволил предположить,, что miR398 способна регулировать Cu/Zn-СОД не только прямо, но и косвенно через регуляцию шаперона меди, доставляющего медь к апобелкам СОД.
Результаты данной работы внесли некоторую определенность в miR398 опосредованную регуляцию генов CSD при действии стрессов на взрослых растениях 77г. salsuginea. Суммируя все вышесказанное, можно» сделать вывод о том, чтов-растениях есть, определенная группа ферментов и белков, отвечающих на- стресс или онтогенетическое развитие, мРНК которых подвержены посттранскрипционной трансформации со1 стороны миРНК. Так как миРНК-RISC комплексы связываются с нетранслируемыми областями, они похути позволяют разобщить в пространстве и во времени синтез белка и его регуляцию, позволяя тем самым, более быстро и адекватно реагировать на изменяющиеся условия внешней среды и заблаговременно принимать действия для экономии энергии и мобилизации защитных систем для выживания в новых условиях. Подводя итог проведенным исследованиям, мы предлагаем возможную схему функционирования механизма миРНК опосредованной регуляции в условиях действия на растения стрессоров различной природы, а также при различных концентрациях меди в питательной среде у растений Th. salsuginea (рис. 28).
