Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 10
1.1.Нитратредуктаза, ее структура и функции 10
1.2. Регуляция экспрессии генов нитратредуктазы в растениях 12
1.2.1. Регуляция нитратредуктазы нитратом 14
1.2.2. Регуляция цитокинином 23
1.2.3. Регуляция HP светом 29
1.2.3.1. Участие фитохрома в регуляции HP 30
1.2.3.2. Влияние фотоассимилятов на активность HP 32
1.2.3.3. Регуляция HP на посттрансляционном уровне 33
1.2.4. Регуляция HP продуктами ассимиляции нитрата 37
1.3. Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам среды 42
1.3.1. Действие избыточного засоления на процесс восстановления нитрата 45
1.3.2. Действие Cd на процесс восстановления нитрата 49
1.3.3 Действие теплового шока на активность HP 51
Глава 2. Объект и методы исследования 53
2.1 Объект исследования 53
2.2. Методика постановки экспериментов 54
2.3. Определение активности HP в зародышах куколя 55
2.4. Выделение тотальной РНК 56
2.5. Оценка относительного уровня мРНК HP методом Нозерн-гибридизации 59
2.5.1. Денатурация РНК 59
2.5.2. Электрофорез денатурированной тотальной РНК 60
2.5.3. Перенос РНК с агарозного геля на мембрану 60
2.5.4. Получение Э2Р-меченого ДНК-зонда 61
2.5.5. Подготовка нейлоновой мембраны с РНК 62
2.6. Оценка относительного уровня мРНК HP методом обратной транскрипций-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) 63
2.6.1 Очистка тотальной РНК от примесей ДНК 63
2.6.2. Получение кДНК 65
2.6.3. Проведение полимеразной цепной реакции 65
2.6.4. Оценка результатов ПЦР 67
2.7. Создание конструкции для оверэкспрессии фрагмента гена HP в E.coli и очистка этого белка 68
2.7.1. Выделение тотальной ДНК из зародышей куколя 68
2.7.2. Получение фрагмента гена Agnr2 69
2.7.3. Получение плазмиды pQE30 71
со встроенным в нее фрагментом гена Agnr2 71
2.7.4. Лигирование плазмиды pQE30 с фрагментом гена Agnr2 72
2.7.5. Приготовление компетентных клеток штамма E.coli М15 72
2.7.6. Трансформация бактерий E.coli плазмидой pQE30 с фрагментом гена HP куколя 74
2.7.7. Проверка экспрессии фрагмента гена Agnr2 куколя и синтеза кодируемого им белка в E.coli 75
2.7.8. Очистка рекомбинантного белка HP от других белков E.coli 76
2.7.9. Перенос белка из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану 79
Глава 3. Результаты и их обсуждение 80
3,1. Индукция активности HP нитратом и цитокинином 82
3.2 Влияние цитокинина и нитрата на уровень мРНК HP 84
3.3. Экспрессия индивидуальных генов HP зародышей куколя в ответ на
действие нитрата и цитокинина 87
3.3.1. Основы метода ОТ-ПЦР, используемого для оценки транскриптов индивидуальных генов 87
3.3.2 Подбор праймеров для ОТ-ПЦР 89
3.3.2.1 Подбор праймеров для индивидуальных генов HP 89
3.3.2.2. Подбор праймеров для контрольного гена 94
3.3.3. Экспрессия индивидуальных генов HP 97
3.4. Влияние NaCl на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов 102
3.5. Влияние С(ЗС1г на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов 105
3.6. Влияние теплового шока на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов 107
3.7 Создание конструкции для синтеза фрагмента белка HP куколя в E.coli и очистка этого белка 110
Выводы 121
Слисок используемой литературы 123
Приложения 140
- Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам среды
- Перенос белка из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану
- Основы метода ОТ-ПЦР, используемого для оценки транскриптов индивидуальных генов
- Влияние теплового шока на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов
Введение к работе
Азот - один из важнейших химических элементов, входящих в состав растительного организма. Несимбиотические растения получают азот из почвы, главным образом в виде его неорганических форм. При этом основной формой неорганического азота в большинстве почв и, следовательно, основным источником азота для растений является нитрат. Нитратредуктаза (HP) - ключевой фермент процесса восстановления нитрата. Ее активность определяет скорость ассимиляции растением неорганического азота и оказывает значительное влияние на весь азотный метаболизм.
В настоящее время в значительной степени остается открытым вопрос о механизмах регуляции экспрессии генов HP у растений. Как известно, нитрат является не только субстратом, но и сигнальной молекулой, регулирующей экспрессию генов HP (Crawford 1995). На добавление нитрата растения, испытывающие недостаток азота, отвечают индукцией активности HP. В отсутствие нитрата активность данного фермента, как правило, поддерживается на крайне низком (стационарном) уровне. Помимо нитрата экспрессия генов HP регулируется еще и сигналами гормональной природы, прежде всего цитокининами, которые синтезируются главным образом в корнях растений.
Регуляция активности HP нитратом и цитокининами позволяет говорить о функционировании в растениях субстратной и гормональной регуляции экспрессии генов нитратредуктазы (Campbell 1999). Характер взаимодействия цитокинина и нитрата в системе индукции HP является аддитивным (Кузнецов В.В. и др., 19796). Исходя из этого, можно сделать предположение, что гормон и субстрат независимо регулируют работу одних и тех же или различных генов, кодирующих HP. В ряде растений обнаружено два и даже три гена, кодирующие апобелок HP (Caboche et al., 1992; Sueyoshi etal., 1995; Yuetal., 1998).
Условия обитания растений существенно влияют на процесс усвоения азота. Во многом это определяется чрезвычайной лабильностью HP. Особенно сильно активность HP подавляется в условиях экстремальных температур, жесткого водного дефицита, засоления и ряда факторов антропогенного происхождения. Предполагается, что падение активности HP в ответ на то или иное повреждающее действие является адаптивной реакцией растений, направленной на экономию энергетических и структурных ресурсов, а также на предотвращение возможного "аммиачного отравления". Механизмы "отключения" процесса ассимиляции неорганического азота при стрессе в настоящее время изучены недостаточно. Еще меньше исследованы механизмы регуляции экспрессии генов HP в стрессорных условиях (Кузнецов и др. 19916).
Изучение субстратной и гормональной регуляции экспрессии генов HP в нормальных условиях и при стрессе позволит не только понять механизмы ассимиляции нитратного азота у растений, но и выяснить взаимодействие различных систем регуляции клеточного метаболизма, что имеет важное общебиологическое значение.
Цели и задачи исследования. Целью нашей работы являлось изучение субстратной, гормональной и стрессорной регуляции экспрессии генов HP.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Изучить индукцию активности HP в зародышах куколя в оптимальных условиях и на фоне действия различных стрессорных факторов.
Исследовать гормональную и субстратную регуляцию экспрессии различных генов HP на уровне мРНК в норме и при стрессе.
Создать генно-инженерную конструкцию для бактериального синтеза фрагмента белка HP куколя.
Научная новизна. Впервые разработан методический подход для изучения экспрессии индивидуальных генов HP зародышей куколя с помощью подбора системы праймеров и последующего использования метода обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) на
7 данном объекте, а также на других растительных системах для решения смежных научных проблем.
Впервые изучена регуляция экспрессии индивидуальных генов HP куколя на уровне мРНК. Продемонстрирована дифференциальная экспрессия трех различных генов HP под действием индукторов гормональной и субстратной природы, а также стрессорных факторов. Показано, что экспрессия гена Agnrl находится под онтогенетическим, гормональным и, в меньшей степени, под субстратным контролем. Экспрессия гена Agnr2 индуцируется нитратом, но не цитокинином. Ген Agnr3 регулируется онтогенетически, хотя находится и под ослабленным субстратным и гормональным контролем.
Получено экспериментальное подтверждение высказанной гипотезы, согласно которой в основе аддитивного эффекта совместного действия субстрата и гормона при индукции HP, а также способности одного индуктора вызывать увеличение активности фермента даже в период «затухания» активности HP, индуцированной другим индуктором, лежит способность нитрата и цитокинина независимо друг от друга активировать экспрессию различных генов, кодирующих HP.
Показано дифференциальное действие стрессорных факторов на экспрессию различных генов HP. Обнаружено, что экспрессия гена Agnrl значительно в большей степени подавляется высокими концентрациями NaCl и СсіСІ2, а также тепловым шоком, чем экспрессия гена Agnr3.
На примере теплового шока продемонстрировано, что падение активности HP в первые часы действия стрессора обусловлено преимущественно инактивацией существующего фермента, тогда как при более длительном воздействии инактивация фермента сопровождается подавлением экспрессии генов HP на уровне мРНК.
Создана генно-инженерная конструкция для бактериального синтеза фрагмента белка HP куколя. Наработан необходимый объем данного фрагмента и осуществлена его очистка методом аффинной хроматографии с целью использования его для выработки специфических антител, необходимых в последствии для изучения экспрессии генов HP на уровне белка.
Практическая значимость. Полученные в работе данные о регуляции экспрессии генов HP в нормальных и стрессорных условиях имеют большое значение для изучения механизмов ассимиляции растениями нитрата и могут служить основой для создания трансгенных растений, обладающих способностью к более эффективному использованию почвенного азота. Полученные экспериментальные данные и сделанные на их основе теоретические обобщения могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических вузов.
Апробация работы. Результаты исследований представлялись на семинарах Лаборатории физиологических и молекулярных механизмов адаптации Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (2001, 2003, 2004), на семинаре Института биохимии растений (Галле, Германия, 2002), на международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на межлабораторном семинаре Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (2004).
Основные публикации: VI.V. Kuznetsov, A.G. Kruglova, O.I. Molodyuk, V.V. Karyagin, A.B. Mesheryakov, V.V. Ragulin, V.Yu. Rakitin, V.P. Kholodova. (2002) Phytohormones in Plant Biotechnology and Agriculture. Edited by I.Machackova and G.A.Romanov. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, Boston, London. P .195-203.
Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Дифференциальная регуляция экспрессии генов нитратредуктазы нитратом и цитокинином. Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.326.
Соболева А.Е., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Аккумуляция мРНК пирролин-5-карбоксилат-синтетазы в процессе онтогенетического и стрессиндуцируемого накопления пролина в растениях. Международная
9 конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.336.
Соболева А.Е., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Активизируется ли ген фосфоенол-пируват-карбоксилазы на ранних стадиях онтогенеза растений хрустальной травки при засолении? Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.337.
Холодова В.П., Грачева С.Н., Моркина Ю.С., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2003) Сохраняется ли стресс-индуцированный САМ у растений хрустальной травки после прекращения экстремального воздействия? Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии». Пенза. С.350.
Холодова В.П., Грачева С.Н., Моркина Ю.С., Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В. (2004) Обратимость стресс-индуцированного формирования САМ-типа фотосинтеза у растений. Доклады академии наук. Т.395, №3, С.133-135.
Шорина М.ВМ Рагулин В.В., Кузнецов Вл.В., Шевякова Н.И. (2005) Вовлекаются ли кадаверин и этилен в индукцию САМ-типа фотосинтеза у растений хрустальной травки? Доклады академии наук. Т.400. Ш.СЛ39-141.
Рагулин В.В., Кузнецов В.В., Кузнецов Вл.В. (2005) Дифференциальная регуляция цитокинином и нитратом экспрессии генов нитратредуктазы куколя. Доклады академии наук. Т.402. (в печати)
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и приложений. Работа изложена на 146 страницах машинного текста, включает 12 таблиц, 14 рисунков; библиография содержит 166 названия, в т.ч. 151 на иностранных языках.
Общие представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам среды
Активность HP ингибируется продуктами ассимиляции нитрата, в первую очередь свободными глутамином и глутаматом (Campbell, 1999; Stitt et al, 2002), а также цистеином и аспарагином. В большинстве случаев при увеличении скорости ассимиляции нитрата уровень свободных аминокислот увеличивается. Высокий уровень свободных аминокислот, в свою очередь, подавляет ассимиляцию нитрата.
Глутамин образуется из глутамата и аммония. Данную реакцию катализирует фермент глутаминсинтетаза (GS). Затем глутаматсинтаза (GOGAT) катализирует перенос аминогруппы с глутамина на 2-оксоглутарат с образованием двух молекул глутамата, одна из которых идет на образование глутамина, образуя GS-GOGAT-цикл, а другая транспортируется или используется в дальнейших реакциях трансаминирования.
У микроорганизмов скорость ассимиляции аммония регулируется на уровне глутаминсинтетазы. Однако, в растениях, значительное ингибирование активности глутаминсинтетазы приводило бы к накоплению токсичного аммония, который разобщает транспорт электронов на тилакоидах. Кроме того, увеличение концентрации аммония в тканях растения приводит к потере азота в виде аммиака через устьица. Вероятно, чтобы пердотвратить токсичное действие высоких концентраций аммиака и потерю азота, растения эффективно регулируют скорость ассимиляции аммония не на уровне глутаминсинтетазы (GS), а на уровне глутаматсинтазы (GOGAT). Ингибирование активности GOGAT приводит к накоплению глутамина. При таком варианте регуляции уровень аммония увеличивается не столь значительно, как наблюдалось бы в случае ингибирования глутаминсинтетазы (Stitt et al., 2002).
Таким образом, в условиях, когда растительный организм вынужден подавлять ассимиляцию аммония, уровень глутамина резко увеличивается. В связи с этим существует интересная гипотеза, согласно которой повышение уровня глутамина сигнализирует о низкой скорости синтеза аминокислот в клетке и о необходимости понижения скорости ассимиляции нитрата. В связи с этим становится понятно, почему глутамин ингибирует экспрессию генов HP у растений (Stitt et al., 2002).
Скорость прохождения азота через GS-GOGAT-цикл зависит от следующих факторов: 1) уровня аммония (который в свою очередь определяется скоростью протекания таких процессов как восстановление нитрата, поглощение аммония, фотодыхания); 2) содержания 2-оксоглутарата (переключением метаболизма углерода от преимущественного синтеза крахмала к синтезу органических кислот (Scheibleetal., 1997)); 3) содержания глутамина (который тем ниже, чем выше потребности растения в азоте); 4) уровня АТФ и восстановительных эквивалентов. Предполагается, что сложная структура GS-GOGAT-цикла способствует более тонкому регулированию ассимиляции аммония в зависимости от комплекса изменяющихся внешних и внутренних факторов (Stitt et al., 2002)
Обратно-пропорциональная зависимость между содержанием глутамина и уровнем экспрессии генов HP наблюдается лишь тогда, когда растения произрастают в обычных для данной среды обитания условиях. Резкое воздействие различных факторов нарушает эту зависимость. Так, в условии повышеного содержания С02 в воздухе уровень мРНК HP при включении света снижался в той же степени, что и при обычном содержании углекислоты, хотя уровень глутамина в этом случае возрастал значительно медленней (Scheible et al., 1997).
Однако ряд экспериментальных данных свидетельствует против предположения, что глутамин регулирует активность экспрессии генов HP. В качестве примера можно указать на опыт, в котором листья табака срезали в самом начале светового периода, после чего через черешок в них подавали различные метаболиты и наблюдали за интенсивностью экспрессии гена HP. Было показано, что аммоний и глутамин практически не оказывали эффекта на уровень транскриптов HP и не приводили к уменьшению активности HP, даже в случае их высокого внутриклеточного содержания (Stitt et al., 2002).
В некоторых случаях, глутамин уменьшал активность HP, действуя на посттрансляционном уровне. Так, во второй части светового периода мутанты с редуцированным числом функциональных генов HP аккумулировали меньше глутамина по сравнению с диким типом, вследствие чего уровень белка HP и ее активность у мутантных форм снижались в этот период значительно медленнее, чем у "нормальных" растений (Scheible et al., 1997).
Другой пример: при выращивании растений дикого типа на нитрате аммония, уровень мРНК HP был сопоставим с уровнем транскриптов HP у растений, выращенных на нитрате в отсутствии иона аммония. При этом присутствие в питательной среде иона аммония значительно увеличивает уровень глутамина, что, в свою очередь, уменьшает активность HP (Scheibleetal., 1997).
Сильное негативное влияние на уровень экспрессии генов HP и на активность этого фермента оказывает глутамат. При подаче различных метаболитов в лист через черешок, глутамат наиболее значительно снижал активность HP. При этом падение активности HP происходило за счет уменьшения количества функционального фермента, а не за счет уменьшения состояния его активирования. Поступление глутамата через черешок в данном эксперименте не приводило к значительному увеличению его эндогенного уровня. Этот факт свидетельствует о функционировании в растениях эффективной системы поддержания определенной внутриклеточной концентрации глутамата и о высокой чувствительности активности HP к небольшим его колебаниям.
Обработка растений глутаматом приводила к увеличению внутриклеточных уровней аммония и глутамина. Это свидетельствует об участии глутамата в регуляции процесса ассимиляции аммония по типу обратной связи, а значит и в регуляции скорости ассимиляции нитрата. Такой вывод подтверждается наблюдениями за суточными изменениями содержания указанных метаболитов, в соответствии с которыми уровень глутамата необычно постоянен в течение всего суточного цикла и в различных условиях произрастания, тогда как колебания уровней аммония и глутамина были достаточно высоки и составляли около 15-20 % общего восстановленного за сутки азота. (Stitt et al., 2002).
Перенос белка из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану
Методика постановки экспериментов несколько различалась в зависимости от того, изучалась временная индукция экспрессии генов HP под действием индукторов, или же исследовалось действие стрессорных факторов после предварительной гормональной индукции HP.
Семена куколя помещали в чашки Петри, содержавшие дистиллированную воду, и инкубировали их 12 часов при 30С в темноте. Затем из семян изолировали зародыши. Для замедления протекания биохимических и физиологических процессов, во время изоляции зародыши сохраняли при температуре +4С. После извлечения зародыши раскладывали в чашки Петри, содержавшие дистиллированную воду или раствор одного из индукторов (10 М раствор БАП или 10 мМ раствор KN03). В качестве цитокинина использовали синтетический аналог природного цитокинина — 6-бензиламинопурин (БАП), который по своей физиологической активности в ряде биотестов не уступал зеатину (Кулаева О.Н. и др., 1973). Количество зародышей в чашке Петри и объем раствора зависели от цели эксперимента. В случае определения активности HP в чашки помещали по 7 зародышей и в каждую из них добавляли по 3 мл того или иного раствора; в случае определения относительного уровня мРНК HP помещали по 30 зародышей в одну чашку Петри и добавляли по 9 мл раствора. Концентрации нитрата и цитокинина, используемые в данной работе (10 мМ и Ш5 М, соответственно), являются, как было показано ранее (Кулаева О.Н., и др. 1976) оптимальными для индукции активности HP. Зародыши инкубировали различные периоды времени при 30С в темноте. Продолжительность инкубации зависела от варианта эксперимента. В этот период гормон и субстрат индуцировали экспрессию генов HP. По окончании инкубации зародыши либо сразу фиксировали замораживанием в жидком азоте и сохраняли при -70С, либо они подвергались действию стрессорных факторов. В случае изучения действия стрессорных факторов зародыши после выделения из семян инкубировали на растворе БАП в течение 12 часов (в отсутствие стрессорных факторов). Далее, в случае изучения действия высоких концентраций хлористого натрия и хлористого кадмия, зародыши помещали на растворы, содержавшие кроме БАП указанные соли в различных концентрациях. В случае изучения влияния теплового шока, чашки Петри с зародышами опытных вариантов помещали в термостат с температурой 44С. Продолжительность действия стрессорных факторов зависела от варианта эксперимента. При определении активности HP эксперименты ставили с тремя биологическими и тремя аналитическими повторностями для каждой из них. Полученные результаты обрабатывали статистически.
Активность HP определяли по методике Ивенсона и Нейсона в модификации Пейве Я.В. и др. (1968). Зародыши растирали в 2 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5) при 4С. Гомогенизат центрифугировали на центрифуге К-24 при 15 тыс. об/мин в течение 30 минут при 4С. По 100 мкл супернатанта (используемого в качестве грубого препарата фермента) добавляли в пробирки, содержавшие реакционную среду следующего состава: 0,6 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5); 0,2 мл 0,1М раствор KNO3; 0,1 мл раствора НАДН (для приготовления данного раствора 1 мг НАДН растворяли в 1 мл фосфатного буфера). Реакция протекала при температуре 27С в течение 20 минут. Количество нитрита, образовавшегося в процессе данной реакции, зависело от активности HP. Реакцию останавливали кипячением на водяной бане в течение 10-15 минут. В пробирки добавляли по 0,5 мл раствора сульфаниловой кислоты (для приготовления данного раствора 3 г сульфаниловой кислоты (СбШСгШгХЗОзН)) растворяли в 350 мл горячей дистиллированной воды, добавляли 100 мл концентрированной НС1 и доводили объем раствора до 500 мл дистиллированной водой). Затем в пробирки добавляли по 0,5 мл раствора нафтилэтилендиаминдихлорида (для приготовления данного раствора растворили 40 мг НЕД в 100 мл Н20) и оставляли на 30 минут для развития окраски. Раствор окрашивался в розовый цвет. Объем раствора доводили дистиллированной водой до 3 мл и центрифугировали на К-23 при 4 тыс. об/мин в течение 10 мин. Плотность поглощения измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм. По плотности поглощения, используя соответствующую формулу для пересчета, судили об активности фермента HP в исходной пробе. Активность фермента выражали в нмоль NO2", образовавшегося в течение одной минуты в расчете на 1 зародыш.
Основы метода ОТ-ПЦР, используемого для оценки транскриптов индивидуальных генов
Так как праймеры Agl и Aglrev комплементарны фрагментам к ДНК двух генов HP - Agnrl и AgnrS, то продукт, получаемый в результате ПЦР, в данном случае представляет собой смесь двух продуктов ПЦР, один из которых комплементарен гену Agnrl, а другой - гену Agnr3. Для определения количества каждого из этих продуктов мы проводили их рестрикцию рестриктазои Kpnl, которая имеет один сайт рестрикции в центре продукта ПЦР, комплементарного гену Agnr3 и не имеет сайтов рестрикции в продукте ПЦР, комплементарного гену Agnrl. В результате, мы получали смесь, состоящую из трех фрагментов: фрагменты длиной 180 и 210 пар нуклеотидов, образуемые в результате рестрикции продукта ПЦР, комплементарного гену Agnr3 (после электрофореза в агарозном геле эти два фрагмента видны в виде одного пятна) и фрагмент 390 пар нуклеотидов, представляющий собой нерестриктированный фрагмент, комплементарный гену Agnrl.
Для проведения рестрикции необходимо было осадить продукты ПЦР и растворить их в буфере для рестриктазы Kpnl, так как компоненты, входящие в состав буфера для Taq-DNA-полимеразы, могли помешать процессу рестрикции. Поэтому после проведения ПЦР из микропробирок отбирали по 45 мкл реакционной смеси, и переносили этот раствор в отдельные пробирки, в которые добавляли по 3 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 6,0). Полученный раствор тщательно перемешивали и добавляли к нему по 112,5 мкл 96% С2Н5ОН для осаждения ДНК. Осаждение проходило в течение 30 мин при температуре -70СС. Содержимое пробирок центрифугировали в течение 15 минут при 12500 об/мин, после чего надосадочную жидкость удаляли. Для более полного удаления остатков ацетата натрия осадок промывали 75% этиловым спиртом 2 раза и высушивали. Высушенный осадок представлял собой ДНК - продукт ПЦР. Осадок растворяли в 15,3 мкл дистиллированной воды, добавляли по 2 мкл буфера для рестриктазы Kpnl и по 0,7 мкл (7 единиц активности) рестриктазы Kpnl. Рестрикцию проводили при 37С в течение одного часа. В результате данного процесса рестриктаза расщепляла все фрагменты ДНК, исходно амплифицированные на кДНК гена Agnr3, по соответствующему сайту рестрикции.
После окончания реакции рестрикционную смесь наносили в лунки 1,3%-ного агарозного геля, и проводили электрофорез при напряжении электрического тока 80 - 100 V. По степени свечения ДНК в УФ судили об уровне мРНК HP в исходных пробах.
В случае оценки относительного уровня мРНК других генов (ген Agnr2 и ген актина), праймеры взаимодействовали лишь с кДНК одного гена, поэтому рестрикцию продукта ПЦР не проводили.
Для получения фрагмента белка HP куколя нами была создана генноинженерная конструкция, которая позволяла проводить бактериальный синтез данного полипептида в клетках кишечной палочки. Созданная конструкция представляет собой плазмиду pQE30 (Stuber D., et al 1990) со встроенным в нее фрагментом гена Agnr2, нуклеотидная последовательность которого определяет аминокислотную последовательность HP полипептида. Указанный фрагмент гена HP получили с помощью ПЦР с использованием специально подобранных праймеров и геномной ДНК, выделенной из зародышей куколя.
Выделение ДНК проводили по методике Fulton Т.М. et. al. (1995) с модификациями. Зародыши куколя изолировали из семян после их замачивания в течение 3-х суток. Растительный материал (по 2,5 г) растирали в ступке с жидким азотом. Растертый порошок небольшими порциями переносили в колбу, содержавшую раствор следующего состава; 7,5 мл буфера для выделения ДНК, 7,5 мл буфера для разрушения ядер, 3 мл 5% саркозила, 80 мг бисульфата натрия. Буфер для выделения ДНК включал: 0,35 М сорбитол, ОД М трис-НС1, 5 мМ ЕДТА, рН 7,5, тогда как буфер для разрушения ядер состоял из следующих компонентов: 0,2 М трис, 50 мМ ЕДТА, 2М NaCl, 2% СТАВ (цетилтриметил-аммоний-N бромид).
Колбу с раствором для выделения ДНК и растертым растительным материалом переносили на водяную баню с температурой 6 5 С со встряхивателем и инкубировали в течение часа при постоянном перемешивании. Затем в колбу добавляли 9 мл насыщенного фенола и 9 мл хлороформа, содержимое аккуратно перемешивали и переносили в центрифужную пробирку. Центрифугировали на центрифуге К-23 при 3000 об/мин в течение 15 минут при температуре 5С. Депротеинизацию с фенолом и хлороформом проводили дважды, после чего очистку проводили еще два раза, но уже только хлороформом. Затем водную фазу переносили в пробирку с 18 мл холодного изопропанола. Содержимое пробирки перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 1 час, затем центрифугировали на центрифуге К-23 при 3000 об/мин в течение 15 минут. После этого супернатант удаляли, а осадок промывали от солей 10 мл 70% этиловым спиртом с последующим центрифугированием. В результате получали осадок ДНК, который высушивали, растворяли в 50 мкл Н20 и хранили при температуре -20аС.
Влияние теплового шока на активность HP и на уровень транскриптов кодирующих ее генов
Обратная транскрипция катализируется ферментом обратной транскриптазой. Этот фермент синтезирует цепи ДНК (кДНК), комплементарные последовательностям РНК, которые присутствуют в реакционной смеси, В данной работе мы обрабатывали обратной транскриптазой тотальную РНК, выделенную из зародышей куколя. В результате получали набор кДНК, число и нуклеотидные последовательности которых, точно соответствовали числу и последовательностям молекул мРНК присутствующих в исходной пробе. Для работы данного фермента требуется затравка - небольшой фрагмент ДНК, связывающийся с молекулой РНК по принципу комплементарно сти. В отсутствие затравки синтез к ДНК не происходит. В качестве затравки мы использовали олигонуклеотид 5 ttttffitttttttttttttvn-3 . Данный олигонуклеотид взаимодействует только с поли-А концом молекул мРНК, поэтому все другие типы РНК (не содержащие поли-А концы) не участвуют в синтезе комплементарных цепей ДНК. При этом, чем больше молекул мРНК того или иного гена присутствовало в образце тотальной РНК, тем больше соответствующих молекул кДНК синтезируется в ходе обратной транскрипции (в соотношении один к одному).
Полимеразная цепная реакция (ПНР) катализируется ферментом Taq-ДНК полимеразой. Этот фермент синтезирует цепи ДНК, комплементарные тем нуклеотидным последовательностям ДНК, которые уже имеются в реакционной среде. Для работы данного фермента также требуется затравка. В качестве ее выступают праймеры (олигонуклеотиды длиной 18 — 20 нуклеотидов), специально подобранные для каждой конкретной последовательности кДНК. При правильном подборе праймеров и температуре их взаимодействия с ДНК (температуре отжига), фермент Taq-ДНК полимераза использует в качестве матрицы только ту молекулу ДНК, к которой эти праймеры подобраны. ПЦР - цикличный процесс. Каждый цикл состоит из следующих этапов: 1. денатурация ДНК (94С) 2. отжиг праймеров, или взаимодействие по комплементарному принципу праймеров с молекулой-матрицей (температура отжига определяется нуклеотидным составом праймеров и рассчитывается по формуле AT 2 + GC 4, где AT - сумма адениновых и тиминовых остатков, a GC - сумма гуаниновых и цитозиновых остатков в последовательности праймера) 3. непосредственно полимеразная реакция, при которой происходит синтез комплементарной цепи ДНК (при 72С). За один цикл количество фрагментов ДНК, которые принимают участие в реакции, увеличивается в два раза. Обычно мы использовали 25 циклов. При таком количестве циклов, число фрагментов ДНК, которые принимают участие в реакции, увеличивается в 224 раз (примерно в 16 миллионов раз). В результате ПЦР образуется огромное число молекул ДНК, нуклеотидные последовательности которых идентичны участку молекулы кДНК, ограниченному данными праймерами. При правильном подборе нуклеотидных последовательностей праймеров и температуре их отжига, в результате электрофореза продуктов ПЦР, в агарозном геле обнаруживается единственное пятно. При этом величина и интенсивность свечения пятна соответствует уровню мРНК изучаемого гена в растениях данного варианта опыта. Сравнивая пятна, полученные с использованием проб разных вариантов опыта, мы можем судить об увеличении или уменьшении экспрессии изучаемого гена. С помощью компьютерной программы Blast, которая предназначена для поиска нуклеотидных последовательностей в базах данных интернета (сайт http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), нами были обнаружены нуклеотидные последовательности трех различных к ДНК HP куколя. Данные последовательности были обозначены как Agnrl, Agnr2 и Agnr3 и имели длину 2046,1502 и 1729 п.н., соответственно. Анализ данных нуклеотидных последовательностей позволил выявить, прежде всего, степени их гомологии. При этом было установлено, что: (1) центральные участки последовательностей кДНК генов Agnrl и AgnrS гомологичны друг другу на 93,9% (1534 из 1634 пар нуклеотидов); (2) центральные участки последовательностей к ДНК генов Agnrl и Agnrl гомологичны друг другу на 82,4% (1205 из 1463 пар нуклеотидов); (3) центральные участки последовательностей к ДНК генов Agnr2 и Agnri гомологичны друг другу на 82,1% (1202 из 1465 пар нуклеотидов). Схематичное изображение указанных молекул к ДНК представлено на рис.3. Для того чтобы определить уровень экспрессии гена Agnrl, было решено подобрать пару праймеров для ПЦР, которая взаимодействовала бы только с молекулой кДНК гена Agnr2 но при тех же условиях отжига не взаимодействовала бы с другими молекулами кДНК HP куколя (Agnrl и Agnr3). Для этого надо было найти на последовательности к ДНК гена Agnrl такие два участка (длиной 18-20 нуклеотидов), которые не только соответствовали бы всем требованиям, предъявляемым к последовательностям, на основе которых синтезируются праймеры, но, и чтобы они значительно отличались по последовательности нуклеотидов от гомологичных участков кДНК двух других генов HP.
С помощью программ Primer2 и DM для кДНК HP гена Agnr2 была подобрана пара праймеров (prAg2: 5 gtcggacgcagttagccac-3 и prAg2rev: 5 -acctgaaccgtctgacgtcg-3 ), которая позволяла получить в результате ПНР фрагмент ДНК длиной 482 п.н. Выбор данной пары праймеров из большого списка потенциальных пар праймеров, подобранных программой Primer2 для последовательности мРНК Agnr2, мотивировался тем, что эти праймеры обладали наименьшей степенью комплементарности с соответствующими участками последовательностей кДНК тепа Agnrl и Agnr3.
Так, анализ гомологичности нуклеотидных последовательностей кДНК гена AgnrJ и праимера prAg2, проведенный с помощью программы Dm, выявил, что только 2 участка последовательности кДНК гена Agnrl гомологичны последовательности праимера prAg2 по 12 из 20 нуклеотидов (табл. 3). Это значит, что последовательность Agnrl не имеет участков, с которыми праймер prAg2 мог бы взаимодействовать - наиболее подходящие для такого взаимодействия участки комплементарны праймеру лишь на 60 % (12 нуклеотидов из 20). При проведении ПНР праймеры, имеющие такое низкое сродство к данной молекуле ДНК, с ней не взаимодействуют.
Анализ гомологичности нуклеотидных последовательностей к ДНК гена Agnrl и праимера prAg2rev, показал, что только один участок молекулы кДНК гена Agnrl гомологичен молекуле prAg2rev по 15 из 20 нуклеотидов, один участок - по 13 из 20 и, еще один, - по 12 из 20 нуклеотидов (табл. 4). Это означает, что последовательность Agnrl не имеет участков, с которыми праймер prAg2rev мог бы взаимодействовать - наиболее подходящий для такого взаимодействия участок комплементарен праймеру лишь на 75 % (15 нуклеотидов из 20). Следовательно, при использовании праймеров prAg2 и prAg2rev и правильно подобранной температуре отжига, амплификация фрагмента гена Agnrl происходить не будет.
