Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов регуляции фотосинтеза является одной из актуальных проблем современной физиологии растений (Курсанов 1972, 1976; Мокроносов 1982; Семененко 1982, 1988). Это обусловлено тем, что многие внешние и внутренние факторы и соответствующие регуляторные системы в растении стимулируют или, напротив, ограничивают фотосинтетическуга продуктивность, действуя с самых начальных этапов экспрессии генов, кодирующих белки фотосинтетического аппарата (Семененко 1988; Gruissem and Tonkyn 1993).
Изучение фотосинтеза проводится с активным использованием цианобактерий - микроорганизмов, имеющих оксигенный фотосинтез по типу эукариотических фотосинтетиков и являющихся эволюционными предшественниками пластид. Благодаря небольшому размеру клеток и генома, существованию у ряда видов естественной компетентности и процесса гомологичной рекомбинации, цианобактерий стали удобными объектами как для биофизических, так и для молекулярно-генетических исследований фотосинтеза (Bryant 1994; Shestakov and Reaston 1987). Именно у цианобактерий впервые были открыты многие гены, кодирующие белки фотосинтетичееккх центров, а также определены их функции (Williams 1988; Brayanetal. 1994).
На экспрессию генов, кодирующих белки фотосистем I и II, и сборку реакционных центров оказывают влияние самые разнообразные факторы (свет, температура, метаболиты, ионы, гормоны). В связи с тем, что в большинстве случаев фотосистема II (ФСП), которая отвечает за жизненно-важную реакцию образования кислорода, реагирует на внешние и внутриклеточные изменения бысгрее и более выражение, чем фотосистема I (ФС1), она чрезвычайно интенсивно исследуется (Климов 1973; Семененко и др. 1992; Barry et al. 1994; Schneegurt et al. 1994).
Для активации экспресси генов, кодирующих белки ФСП, и сборки реакционного центра (РЦП) решающее значение имеет световая регуляция. Однако известно, что на функционирование ФСН оказывает влияние глюкоза, накапливающаяся в процессе фотосинтеза (Зверева 1980; Зверева и др. 1980; Семененко и др. 1979; Чемерис и др. 1996), и этот тип метаболитной регуляции представляет собой механизм, с помощью которого клетка настраивается на изменения внутренних условий (синтез Сахаров в процессе фотосинтеза), и с помощью которого происходит адаптация клеточного метаболизма к ряду внешних факторов (свет; температура и пр.) (Семененко 1975; 1982). Кроме того, реакции, проводимые ФСП, могут находиться под контролем глобального типа регуляции - биологических часов клетки (Sweeney 1987). Нами было выдвинуто предположение, что в целях экономичности внутриклеточных процессов такие типы регуляции, как глюкозный и циркадный, должны влиять непосредственно на экспрессию
генов, кодирующих белки фотосистемы II, действуя уже на самом начальном этапе - транскрипции.
Косвенным подтверждением такой гипотезы служат эксперименты, показавшие, что глюкоза вызывает специфическое подавление транскрипции генов, кодирующих ферменты, участвующие в фотосинтетических процессах (Sheen 1990, 1994), и что экспрессия некоторых 'фотосинтетических' (кодирующих ферменты фотосинтеза и структурные белки фотосинтетического аппарата) генов регулируется циркадным ритмом (Anderson and Kay 1995; Kondo 1993). Вместе с тем целенаправленного изучения метаболитной и циркадной регуляции транскрипции генов, кодирующих белки ФСП, проведено не было.
В данной работе представлены результаты исследования того, как у цианобактерий глюкоза и циркадные ритмы влияют на экспрессию генов, кодирующих белки реакционного центра фотосистемы II (РЦИ).
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение регуляции экспрессии генов, кодирующих белки реакционного центра фотосистемы II, а именно: метаболитной feedback регуляции продуктами фотосинтетического восстановления углерода (глюкоза) и циркадной регуляции.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
-
Изучить действие стереохимического аналога глюкозы - 2-дезокси-Д-глюкозы (2дДг), - на рост и фотосинтетическое выделение кислорода у цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803.
-
Получить мутанты Synechocystis sp.PCC 6803 с нарушенной системой feedback регуляции фотосинтеза глюкозой (2^rResCRS, Шитова 1994).
-
Осуществить сравнительное изучение действия 2дДг на аккумуляцию мРНК генов, кодирующих DI и DII белки РЦІІ (psbA и psbD соответственно) у дикого штамма и регуляторных мутантов Synechocystis.
-
Провести сравнительное изучение действия 2дДг на экспрессию (на уровне накопления мРНК) 'фотосинтстических' psbA и psbD генов и 'нефотосинтетического' desA гена (кодирует десатуразу жирных кислот, катализирующую образование двойной связи в положении Д12) у дикого штамма и регуляторных мутантов Synechocystis.
5. Используя штаммы одноклеточных цианобактерий, выяснить,
подвержена ли экспрессия генов, кодирующих белки РЦН, циркадной
регуляции на этапе накопления специфических мРНК.
6. Сконструировать нлазмиды, предназначенные для изучения глюкозной и
циркадной регуляции промоторной активности генов в клетках
цианобактерий.
7. Клонировать в созданных плазмидах промоторы генов, кодирующих
белки РЦП, и генов, не связанных с фотосинтезом. Выяснить подвержена ли
активность работы данных промоторов циркадной регуляции.
Научная новизна. На примере Synechocystis sp. РСС 6803 впервые показано существование механизма глюкозной feedback регуляции фотосинтеза у
цианобактерий, сходного с таковым у высших растений и эукариотических водорослей.
Получены мутанты Synechocystis sp.PCC 6803, с нарушенной системой негативной регуляции фотосинтеза конечным продуктом фотосинтетического восстановления углерода - глюкозой. В результате сравнительного изучения экспрессии генов, кодирующих белки РЦІІ (psbA, psbD), и 'нефотосинтетического' гена (desA), у дикого типа и регуляторного 2z^rRc,CRS(4) мутанта Synechocystis впервые выявлено специфическое регуляторное действие глюкозы на транскрипцию генов фотосистемы II, но не на транскрипцию desA гена.
На фотоавтотрофной цианобактерий Synechococcus sp. РСС 7942 проведены опыты, обнаружившие, что накопление мРНК psbAI, psbAII, psbAIII генов, кодирующих различные формы DI белка РЦП (Kulkarni and Golden 1994), происходит с циркадной периодичностью (24-часовым ритмом). Анализ количественных изменений мРНК psbAs генов при различных условиях культивирования Synechococcus впервые показал, что биологические часы способны функционировать в клетке даже когда частота деления цианобактерий составляет всего лишь 5-6 часов (4-5 делений в сутки).
Для более детального изучения механизмов метаболитной и циркадной
регуляции экспрессии генов цианобактерий на уровне транскрипции созданы
плазмиды для клонирования промоторов перед маркерными генами
(кодируют неомицинфосфотрансферазу; люциферазу морских
биолюминесцентных бактерий), лишенными собственного промотора. В одном из созданных векторов перед маркерными /мхЛ2?-генами проклонированы промоторные области psbAI, psbAIII, glnA (кодирует глютамин-синтетазу), rrnA (оперон, кодирующий субъединицы рибосомы) генов Synechococcus и обнаружена циркадная периодичность работы данных промоторов.
Практическая значимость. Представленные результаты могут быть использованы для развития исследований в области молекулярных механизмов эндогенной регуляции экспрессии генов фотосинтеза. Созданные плазмиды могут применяться для изучения регуляции экспрессии генов на уровне активности промоторов и создания новых векторов.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на 3 Конференции по физиологии растительной клетки (Россия, Москва 1988), 5 Международном симпозиуме молодых ученых (Болгария, Варна 1990), на русско-американском семинаре по проблемам фотосинтеза (Россия, Пущино 1992), на IX Международном конгрессе по фотосинтезу (Япония, Нагойя 1992), на конференции техасского отделения американского общества микробиологов (США, Колледж Стейшн 1994), на 4 конференции Международного общества по изучению биологических ритмов (США, Джэксонвиль 1994), на конференции по проблемам молекулярной биологии
(США, Смифиль 1994), на 1 Европейском фикологическом конгрессе (Германия, Кельн 1996).
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, из 3 глав экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на /Л/ страницах машинописного текста и содержит ^ / рисунок и 3 таблиц.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили одноклеточные цианобактерии -фотогетеротрофный штамм Synechocystis sp.PCC 6803 (штамм получен от чл.-корр. Шестакова СВ., каф. генетики, Биофак, МГУ) и фотоавтотрофный штамм Synechococcus sp.PCC 7942 (проф. Сыозан Голден, Биофак, Техасский А@М Университет, США).
Данные штаммы являются пресноводными цианобактериями. Они хорошо изучены на молекулярно-генетическом уровне, легко трансформируемы и широко используются в физиологических и молекулярно-генетических исследованиях (Shestakov and Reaston 1987; Williams 1988; Лось 1996).
Выращивание цианобактерии проводили в стерильных условиях на среде BG-11 (Бибикова 1987) при температуре 28С и интенсивности света 100 цЕм-2с ' для Synechocystis, и 30С и 120 цЕм-2с-' для Synechococcus. Специальные условия отмечены в тексте.
2дДг-резистентные мутанты Synechocystis выращивали на агаризованной среде BG-11 с 3 мМ 2-дезокси-Д-глюкозы (раствор 2дДг стерилизовали фильтрованием через бактериальные фильтры Синпор 2 (Чехословакия)).
Фотосинтетическое выделение кислорода суспензией интактных клеток цианобактерии измеряли электродом Кларка при 30С. Предварительно клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в свежей среде BG-11 в концентрации OD730=0.2.
Поглощение глюкозы и 2-дезокси-Д-глюкозы изучали с использованием С|4-меченых соединений (С14-глюкоза - удельная активность 250 Кюри/ммоль, Чехословакия; 2-дезокси-Д-(1-С|4)глюкоза - удельная активность 50-60 мКюри/ммоль, Amersham, Англия) по методу Beauclerk/Smith (Beauclerk, Smith 1978).
РНК выделяли из 100 мл цианобактериальной культуры (при плотности клеток OD73o=0.3-0.7) фенольным методом (Synechocystis 6803 - Mohammed and Jansson 1989; Synechococcus 7942 - Kulkarni and Golden 1994). Выделенную РНК разделяли на горизонтальном формальдегид-содержащем геле (трис-боратный буфер), переносили на мембрану GeneScreen Plus, фиксировали на мембране 2-часовой инкубацией при 80С и затем проводили анализ мРНК методом нозерн-гибридизации с использованием специфических ДНК и РНК зондов (Маниатис и др. 1984).
Операции по созданию новых плазмнл и клонированию проводили с применением стандартных методик, описанных в книге Маниатиса "Молекулярное клонирование" (1984). Для субклонирования использовали штаммы E.coli НВ 101 и DH 1. Для операций но клонированию использовали ферменты фирм: НПО 'Вектор', Amersham, Biolab, Boehringer, Promega.
Измерение люминесценции трансформантов Svnechococcus sp. РСС 7942, содержащих маркерный ген лтопиферазы проводили двумя методами:
-
метод с использованием компьютеризированной фоточувствительной камеры (Kondo, Ishiura 1994);
-
метод с использованием сцинтилляционного счетчика (Н.В.Лебедева и проф.С.Голден) для измерения свечения жидких культур штаммов Synechococcus со слабой биолюминесценцией, недетектируемой фоточувствительной камерой.
10 мл жидкой культуры осаждали центрифугированием и ресуспендировали в свежей среде BG-11 до OD73o=0.5-0.6. Полученную суспензию (0.5 мл) помещали в сцинтилляционный флакон, содержащий 0.3 мл раствора п-деканала (3% деканал в растительном масле). Закрытый флакон выдерживали 30 минут в полной темноте для полного насыщения клеток цианобактерий парами альдегида и снижения флюоресценции хлорофилла. Затем на сцинцилляционном счетчике Beckmann LS 3801 производили измерение свечения с использованием диагностической программы 'РМТ singles test'.
