Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 6
1.1 Двухкомпонентные системы 6
Организм и стресс 6
Открытие двухкампонентных систем 7
Строение двухкомпонентной системы. Механизм передачи сигнала 8
Разнообразие доменов Hik и Rre 12
Каким образом Hik и Rre удается специфически езаимодейстеоеат. 12
1.2 Участие двухкомпонентных систем в регуляции ответов на стрессы 14
Несколько сенсоров могут активировать один и тот оке сигнальный путь 14
Взаимодействие между разными двухкомпонентными системами 16
Участие фосфатаз в передаче сигнала 17
Транскрипционные и пост-транскрипционные механизмы регуляции... 17
1.3 Регуляция ответа на некоторые абиотические стрессы 19
Осмотический стресс 19
Солевой стресс 22
1.4 Восприятие абиотических стрессов у synechocystis sp. рсс 6803 24
Изученные двухкомпонентные системы 24
Регуляция ответа на солевой и гиперосмотический стрессы 28
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 34
2.1 Штаммы цианобактерий 34
2.2 Конструирование рекомбинантных штаммов 34
2.3 Трансформация клеток цианобактерий 37
2.4 Условия культивирования 37
2.5 Экспериментальные условия 38
2.6 Выделение рнк 38
2.7 Слот-блот гибридизация 39
2.8 Нозерн-блот гибридизация 40
2.9 Анализ экспрессии генов с помощью днк-микрочипов (dna microarray) 40
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение. 42
3.1 Конструирование библиотеки мутантов, дефектных по генам регуляторов ответа 42
3.2 Анализ экспрессии генов мутантов по rre при солевом стрессе с помощью слот-блот и нозерн-блот гибридизации 50
Слот-блот анализ. 50
Поиск гистидин-киназы - партнера для Rre3 52
Нозерн-блот анализ... 53
3.3 Анализ экспрессии генов мутантов по rre при солевом стрессе с помощью ДНК-микрочипов 55
3.4. Анализ экспрессии генов мутантов по rre при гиперосмотическом стрессе с помощью слот-блот и нозерн-гибридизации 61
Слот-блот анализ 61
Нозерн-блот анализ 63
3.5 Анализ экспрессии генов мутантов по rre при гиперосмотическом стрессе с помощью днк-микрочипов 65
3.6 Взаимодействие регуляторных систем, контролирующих экспрессию генов при солевом и гиперосмотическом стрессах 70
Заключение 73
Выводы 75
Литература 76
- Несколько сенсоров могут активировать один и тот оке сигнальный путь
- Регуляция ответа на солевой и гиперосмотический стрессы
- Анализ экспрессии генов с помощью днк-микрочипов (dna microarray)
- Анализ экспрессии генов мутантов по rre при солевом стрессе с помощью ДНК-микрочипов
Введение к работе
В ответ на стрессовые воздействия организмы регулируют экспрессию множества генов, что позволяет им; адаптироваться к меняющимся условиям среды. Гены, экспрессия которых изменяется под воздействием стрессовых факторов, в основном хорошо известны,, однако механизмы восприятия и передачи стрессового сигнала до сих пор мало изучены.
Известно, что у гетеротрофных бактерий большую роль в восприятии и передаче стрессовых сигналов играют двухкомпонентные системы, состоящие из гистидин-киназ и регуляторов ответа (Egger et al., 1997; Wood, 1999).
Участие двухкомпонентных систем s у фотоавтотрофных цианобактерий в регуляции ответа на абиотические стрессы до сих пор остается малоизученным. У Synechocystis sp. РСС 6803 исследованы три двухкомпонентных системы - система PhoR-PhoB (она же SphS-SphR), отвечающая за индукцию щелочной фосфатазы в результате фосфатного голодания (Hirani et al., 2001, Suzuki et al., 2004), система ManS-ManR, регулирующая систему поглощения марганца (Yamaguchi et al., 2002; Ogawa et al., 2002), и система NrsS—NrsR регулирующая систему детоксикации никеля (Lopez-Машу et al., 2002). Показано, что гистидин-киназа 33 (НікЗЗ) является сенсором холодового (Suzuki et al., 2000), гиперосмотического (Mikami et al., 2002) и солевого (Marin et al., 2003) < стрессов. Кроме того, обнаружены еще три гистидин-киназы (НІк34, Нікіб и Нік41), отвечающие за восприятие сигнала солевого стресса (Marin et al., 2003).
Вместе с тем, регуляторы ответа, принимающие сигнал от этих гистидин-киназ, все еще остаются неизвестными. Поэтому задача идентификации регуляторов ответа и целых систем восприятия и передачи сигналов представляется очень актуальной.
В настоящей работе мы изучали роль двухкомпонентных систем регуляции в восприятии и передаче сигналов солевого и гиперосмотического стрессов и идентифицировали пять двухкомпонентных систем, воспринимающих и передающих сигналы этих двух стрессов. Для решения данной проблемы были сформулированы следующие цель и задачи исследования:
Несколько сенсоров могут активировать один и тот оке сигнальный путь
Двухкомпонентные системы идеально подходят для принятия и передачи большого количества сигналов, потому что мембранное расположение большинства сенсорных киназ позволяет воспринимать внешние раздражители, а специфическое взаимодействие между собой пар «гистидин-киназа/регулятор ответа» способно обеспечить адекватный физиологический ответ (Bijlsma and Groisman, 2003). Кроме того, показано, что различные двухкомпонентные системы могут воспринимать разные сигналы, взаимодействуя друг с другом и/или фосфорилируясь с помощью низкомолекулярных доноров фосфатной группы, например, ацетил-фосфата или карбамоил-фосфата (McCleary and Stock, 1994).
Несколько сенсоров могут активировать один и тот же сигнальный путь Разные сигналы могут активировать один и тот же сигнальный путь, если несколько сенсоров, воспринимающих разные сигналы, способны фосфорилировать один регулятор ответа. Подобное взаимодействие участников, сигнальной цепи изучено на примере бактериального хемотаксиса.
Движение E.coli зависит от изменений концентрации различных внеклеточных субстратов. Эти изменения воспринимаются несколькими хеморецепторами, которые, через связывание с вспомогательным белком CheW, ведут к фосфорилированию гистидин-киназы CheA, которая, в свою очередь, фосфорилирует регуляторы ответа CheY и CheB (Bourret and Stock, 2002). Фосфорилирование CheY вызывает конформационные изменения белка, в результате чего он приобретает способность взаимодействовать с флагеллярным мотором и влиять на вращение жгутика. Аспартил-фосфатаза CheZ дефосфорилирует фосфо-CheY.
Фосфорилирование CheB стимулирует метилтрансферазную активность белка по отношению к хеморецепторам, что ведет к блокированию автокиназной активности CheA. Таким: образом осуществляется негативная обратная связь (negative feedback) (Bourret and Stock, 2002). У E.coH имеется пять хеморецепторов, каждый из которых реагирует со своим специфическим лигандом. Хеморецепторы расположены в. мембране бактерии кластерами; которые способны образовывать комплексы с CheA и CheW (Shimizu et al., 2000; Levit, et: al, 2002). Таким образом, связывание одного хеморецептора с лигандом влияет на окружающие хеморецепторы, что ведет к усилению стимуляции киназнои активности CheA (Shimizu et al., 2000; Falke et al., 2001; Kim et al., 2002). Похожая конвергенция сенсорных белков регулирует образование спор у В. subtilis. Пять родственных гистидин-киназ — KinA, KinB, KinC, KinD и KinE фосфорилируют один регулятор ответа — SpoOF. Далее, взаимодействуя с SpoOB, он передает сигнал на транскрипционный фактор SpoOA, который активирует гены,, необходимые для образования спор и репрессирует гены, отвечающие за развитие клетки. Аминокислотные остатки, окружающие фосфорилируемый His киназ группы Kin, очень похожи; однако воспринимающие сигнал домены киназ различны, что говорит об их способности воспринимать различные стимулы (Le Deaux et al., 1995; Jiang et al., 2000). У морской; бактерии Vibrio harveyi регуляция биолюминисценции осуществляется с помощью нескольких сенсорных киназ. Они активируются при взаимодействии с двумя различными автоиндукторами — AI-1, который выделяется самим V. harveyi, и AI-2, продуктом метаболизма многих микроорганизмов. (Bassler, 2002). AI-1 передает сигнал на гибридную гистидин-киназу LuxN, а сигнал от AI-2 с помощью периплазматического белка-посредника LuxP воспринимает гибридная гистидин-киназа LuxQ. Эти сенсоры взаимодействуют с гистидин-содержащим белком LuxU, который затем передает фосфатную группу на регулятор ответа LuxO. Фосфорилированный LuxO активирует репрессор, который выключает транскрипцию генов биолюминисценции. Способность AI-1 и AI-2 независимо контролировать фосфорилирование LuxO позволяет V. harveyi регулировать биолюминисцию в ответ на увеличение количества клеток не только своего вида, но и других микробов (Мок et al., 2003). Взаимодействие между разными двухкомпонентными системами Несмотря на высокую специфичность друг к другу белков, двухкомпонентной системы, некоторые гистидин-киназы способны взаимодействовать с «чужими» регуляторами ответа (Wanner, 1992). Например, система PhoB/PhoR у Е,соїі регулирует ответ клетки на фосфатное голодание. Однако, у мутантов по сенсору PhoR транскрипция генов, активируемых обычно с помощью PhoB, может быть индуцирована с помощью неспецифического для этого пути сенсора СгеС, а также с помощью ацетил-фосфата,, выступающего в качестве донора- фосфатной группы (Wanner, 1993). Другим; примером не специфической активации может служить фосфорилирование регулятора ответа OmpR (который в норме отвечает на осмотический стресс, воспринимаемый сенсором EnvZ) с помощью сенсора АгсВ, активируемого при анаэробных условиях (Matsubara etal., 2000).
Предположительно, подобное неспецифическое взаимодействие участников двухкомпонентных систем необходимо для интеграции большого количества сигналов, которые в экспериментальных условиях активируют отдельные двухкомпонентные системы (Wanner, 1992). Физиологическая; роль этого явления не ясна до сих пор, так как неспецифические взаимодействия наблюдались только в условиях in vitro.
Регуляция ответа на солевой и гиперосмотический стрессы
Двухкомпонентная система NrsS-NrsR. регулирует систему детоксикации никеля (Lopez-Maury et al., 2002). В геноме Synechocystis белки, необходимые для развития устойчивости к ионам никеля, закодированы в опероне nrsBA CD. Оперон состоит из четырех генов, и его экспрессия индуцируется ионами Ni2+. Рядом с опероном в. обратной ориентации находятся гены $110789 и sll0797y кодирующие, соответственно, сенсорную гистидин-киназу НікЗО (NrsS) и регулятор ответа Rre33 (NrsR). В мутантах, дефектных по этим генам, экспрессия оперона не индуцировалась ионами никеля, кроме того, показано, что транскрипция генов nrsRS индуцируется Ni , а ДНК-связывающий домен регулятора ответа способен специфически взаимодействовать с межгенным районом nrsBACD - nrsRS. Данные исследований указывают на то, что регуляция экспрессии nrsBACD, кодирующего гены устойчивости к ионам никеля, происходит с помощью двухкомпонентной системы NrsS—NrsR (Lopez-Машу et al., 2002). Регуляция ответа на солевой и гиперосмотический стрессы
Ответ на солевой и гиперосмотический стрессы Synechocystis — цианобактерия, живущая в пресной воде. В естественной среде обитания она может подвергаться как солевому, так и гиперосмотическому стрессам. Для; успешной адаптации к подобным условиям ей необходимы механизмы восприятия и передачи сигналов этих стрессов.
Используя метод ДНК-микрочипов, для Synechocystis удалось идентифицировать все гены, регуляция которых зависит от солевого или гиперосмотического стресса. Всего более 300- генов в разной степени регулируется солевым стрессом и более 250 - гиперосмотическим (Kanesaki etal.,2002).
Во время солевого стресса активируется работа ионных каналов, например, Na4/ антипортеров (Inaba et al., 2001; Elanskaya et al., 2002). Солевым стрессом индуцируется экспрессия генов белков, принимающих участие в трансляции (грІЗ), а также модификации и деградации других белков (pre и ftsH). По-видимому, солевой стресс дестабилизирует рибосомы и возникает необходимость синтеза рибосомальных белков, например, L3, кодируемого геном грІЗ. По аналогии: с АТФ-зависимой металлотрансферазой FtsH у Arabidopsis ihaliana (Lindahl et al„ 1996; 2000), продукт гена flsH у Synechocystis тоже может принимать участие в деградации белка фотосистемы D1, поврежденного в результате стресса.. Кроме того, солевым стрессом индуцируется большое количество генов, функция продуктов которых неизвестна (Kanesaki et al, 2002).
Известно, что в регуляции небольшого числа генов, индуцируемых солевым стрессом, принимает участие сигма-фактор SigF (Huckauf et al., 2000). Однако, что служит сенсором солевого стресса, до недавнего времени не было известно.
Некоторые гены, гомологичные генам, регулируемым солевым стрессом у Synechocystis, также найдены у высших растений, поэтому возможно, что изучение сигнальных систем ответа на стресс у цианобактерии сможет служить моделью для изучения сигнальных систем растений (Bohnert et al., 2001).
Гиперосмотическим стрессом активируется экспрессия таких генов, как fabG, который кодирует 3-кетоацил-АНП-редуктазу, rlpA и герА, кодирующих липопротеины А, и htpG, кодирующего белок теплового шока 90 (Kanesaki et al., 2002). 3-кетоацил-АНП-редуктаза FabG принимает участие в элонгации углеродных цепей при синтезе жирных кислот., По-видимому, синтез жирных кислот de novo необходим для адаптации к гиперосмотическому стрессу — если под действием стресса цитоплазма сжимается и мембраны становятся упакованными; более плотно, синтез новых жирных кислот может играть большую роль в восстановлении первоначального объема клетки (Kanesaki et al.,. 2002). По аналогии с изученным гомологичным липопротеином A.RlpA в Е. coli (Stocker et al., 1983; Takase et al., 1987), липопротеины RlpA и RepA цианобактерии Synechocystis могут быть задействованы в регуляции синтеза пептидогликанов, расположенных на плазматической мембране и повреждаемых при сжатии цитоплазмы под действием гиперосмотического стресса (Kanesaki et al., 2002).
Большая группа генов регулируется как солевым, так и осмотическим стрессом. Потеря воды клеткой вследствие гиперосмотического стресса приводит к повышению концентрации внутриклеточных солей, в то же время одним из первых действий солевого стресса при высокой концентрации соли является гиперосмотическое действие. Таким образом, в солевом и гиперосмотическом; стрессе есть общая; составляющая,, что объясняет регуляцию сходных групп генов и тем, и другим стрессом (Kanesaki et al., 2002).
Гены, регулируемые обоими стрессами - это гены, кодирующие белки общего стрессового ответа: белки теплового шока (hspA, dnaj htrA, groEL2, clpB), ген супероксиддисмутазы sodB. Эти белки необходимы для защиты транскрипционного и трансляционного аппарата клетки во время действия стресса. Показано, они индуцируются также высокотемпературным стрессом (Lehel et al.» 1992; Lee et al.,. 1998). Как солевым, так и гиперосмотическим стрессом индуцируется ген ggpS, кодирующий гтокозил-глицерин-фосфатсинтазу, фермент, необходимый для синтеза осмопротектора глюкозилглицерина (Engelbrecht et al., 1999; Karandashova et al.» 2002). Synechocystis способен также усваивать глюкозилглицерин из внешней среды (Hagemann et al., 1997).
Восприятие и передача сигнала солевого и гиперосмотического стрессов Каким же образом Synechocystis воспринимает и передает сигналы солевого и гиперосмотического стрессов? В недавних исследованиях показано, что большую роль в этом процессе играют гистидин-киназы.
Как можно заключить из предыдущей части главы 1.3, роль гистидин-киназ в передаче стрессовых сигналов у Synechocystis чаще всего изучается с помощью мутантов, дефектных по исследуемым генам. Мутантов подвергают стрессу, анализируют экспрессию генов и сравнивают с экспрессией генов в таких же условиях у дикого типа. Для анализа экспрессии применяют методы нозерн-блот анализа и анализа с помощью ДНК-микрочипов.
Анализ экспрессии генов с помощью днк-микрочипов (dna microarray)
Двухкомпонентная система ManS—ManR регулирует систему поглощения марганца (Yamaguchi et al., 2002; Ogawa et al., 2002).
Марганец (Mn) необходим для формирования каталитического центра фотосистемы II (Zouni et al., 2001), а также является кофактором многих ферментов, например, Мп-супероксиддисмутазы (Borgstahl et al., 2001), Mn-каталазы (Barynin et al., 2001), пируват-карбоксилазы и фосфоенолпируват-карбоксикиназы (Frausto da Silva and Williams, 1991; Larson andiPecoraro, 1992). Регуляция поглощения марганца очень важна для фотосинтезирующих клеток Synechocystis.
Цианобактериальные клетки поглощают ионы марганца Мп из среды с помощью ABC-транспортера. Оперон mntCAB, кодирующий белки транспортера, включает в себя ген mntA, кодирующий АТФ-связывающую субъединицу, mntBy кодирующий гидрофобную субъединицу, и mntCy кодирующий субъединицу связывания Mn (Bartsevich and Prakasi, 1995; 1999). Цианобактерии иногда оказываются в условиях дефицита ионов марганца, например, в морской воде, и тогда индуцируется экспрессия оперона mntCAB (Bartsevich and Prakasi; 1996).
ManS явлется сенсорной гистидин-киназой (Hik27), продуктом гена slr0640, a ManR - регулятором ответа (Rrel6), продуктом гена sir183 7. Они были найдены с помощью скрининга библиотеки мутантов, дефицитных по гистидин-киназам. С помощью анализа эспрессии генов в условиях, дефицита ионов марганца у мутантов по Hik27 и Rrel6 было установлено, что ManS воспринимает сигнал высокой концентрации Мп2+ в среде,, активирует регулятор ответа ManR, который, в свою очередь, репрессирует транскрипцию оперона mntCAB. При низкой концентрации ионов марганца гистидин-киназа не активируется, репрессии оперона не происходит,. и транспортер успешно синтезируется (Yamaguchi et al., 2002).
Двухкомпонентная система NrsS-NrsR. регулирует систему детоксикации никеля (Lopez-Maury et al., 2002). В геноме Synechocystis белки, необходимые для развития устойчивости к ионам никеля, закодированы в опероне nrsBA CD. Оперон состоит из четырех генов, и его экспрессия индуцируется ионами Ni2+. Рядом с опероном в. обратной ориентации находятся гены $110789 и sll0797y кодирующие, соответственно, сенсорную гистидин-киназу НікЗО (NrsS) и регулятор ответа Rre33 (NrsR). В мутантах, дефектных по этим генам, экспрессия оперона не индуцировалась ионами никеля, кроме того, показано, что транскрипция генов nrsRS индуцируется Ni , а ДНК-связывающий домен регулятора ответа способен специфически взаимодействовать с межгенным районом nrsBACD - nrsRS. Данные исследований указывают на то, что регуляция экспрессии nrsBACD, кодирующего гены устойчивости к ионам никеля, происходит с помощью двухкомпонентной системы NrsS—NrsR (Lopez-Машу et al., 2002). Synechocystis — цианобактерия, живущая в пресной воде. В естественной среде обитания она может подвергаться как солевому, так и гиперосмотическому стрессам. Для; успешной адаптации к подобным условиям ей необходимы механизмы восприятия и передачи сигналов этих стрессов.
Используя метод ДНК-микрочипов, для Synechocystis удалось идентифицировать все гены, регуляция которых зависит от солевого или гиперосмотического стресса. Всего более 300- генов в разной степени регулируется солевым стрессом и более 250 - гиперосмотическим (Kanesaki etal.,2002).
Во время солевого стресса активируется работа ионных каналов, например, Na4/ антипортеров (Inaba et al., 2001; Elanskaya et al., 2002). Солевым стрессом индуцируется экспрессия генов белков, принимающих участие в трансляции (грІЗ), а также модификации и деградации других белков (pre и ftsH). По-видимому, солевой стресс дестабилизирует рибосомы и возникает необходимость синтеза рибосомальных белков, например, L3, кодируемого геном грІЗ. По аналогии: с АТФ-зависимой металлотрансферазой FtsH у Arabidopsis ihaliana (Lindahl et al„ 1996; 2000), продукт гена flsH у Synechocystis тоже может принимать участие в деградации белка фотосистемы D1, поврежденного в результате стресса.. Кроме того, солевым стрессом индуцируется большое количество генов, функция продуктов которых неизвестна (Kanesaki et al, 2002).
Известно, что в регуляции небольшого числа генов, индуцируемых солевым стрессом, принимает участие сигма-фактор SigF (Huckauf et al., 2000). Однако, что служит сенсором солевого стресса, до недавнего времени не было известно.
Анализ экспрессии генов мутантов по rre при солевом стрессе с помощью ДНК-микрочипов
В экспериментах использовали по 10 мкг общей клеточной РНК, денатурированной при 65С 10 мин. РНК наносили на нейлоновую мембрану Hybond N (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция) с помощью вакуумного аппарата PR 648 Slot Blot Filtration Manifold (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция), согласно рекомендациям производителя.
Мембрану с нанесенной РНК гибридизовали с несколькими зондами. В качестве зондов использовались ПЦР-продукты генов, индуцируемых исследуемыми стрессами. В случае солевого стресса использовали slr!544 dnaK2 (sll0170), slr0967 и htrA (slrl204), в случае гиперосмотического стресса помимо названных зондов использовали также hspA (sill514) и fabG (sll0330).
Изготовление меченого зонда, гибридизацию и отмывку мембраны проводили с помощью набора AlkPhos Direct Labelling and Detection System with CDP-star (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция) согласно рекомендациям производителя. Детекцию сигнала производили с помощью люминисцентного анализатора LAS-1000 (Fuji Photo Film, Япония). Для проведения гибридизации по методу нозерн-блот 15 мкг общей клеточной РНК денатурировали, а затем разделяли методом электрофореза в денатурирующем 1,2%-агарозном формальдегидном геле. После этого РНК переносили на нейлоновую мембрану Hybond N (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция) полусухим переносом. Изготовление меченого зонда, гибридизацию, отмывку мембраны и детекцию сигнала проводили так же, как и для слот-блот гибридизации. Для того, чтобы удостовериться в равной концентрации образцов РНК, нанесенных на мембрану, мы проводили контрольную гибридизацию с генами I6S рибосомной РНК (16S rRNA) и субъединицы В РНКазы Р (гпрВ). Для реакции обратной транскрипции использовали следующую реакционную смесь: 100 ед. обратной транскриптазы AMV Reverse Transcriptase XL (TaKaRa, Япония), їх реакционный буфер, смесь дезоксирибонуклеотидилтрифосфатов с низким содержанием dCTP (2 гпМ dCTP, 5 mM dTTP, 5 тМ dGTP, 5 тМ АТР), 3 тМ СуЗ-dCTP (или Су5-dCTP), (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция), 300 пМ случайного гексамерного праймера, 100 ед. ингибитора РНКаз (RNasinT, TaKaRa Со. Ltd., Киото, Япония), 20 мкг общей РНК. СуЗ и Су5 - флуорофоры с различными спектрами поглощения и эмиссии. РНК, выделенную из контрольного образца, метили; Cy5-dCTP, выделенную из экспериментального образца - СуЗ-dCTP. Реакцию обратной транскрипции проводили при 42СС 2 часа. Не включившиеся в цепь кДНК нуклеотиды удаляли путем гель-фильтрации на колонках Centri-Sep (Princeston Separations, США) (Kanesaki et al., 2002; Yamaguchi et al., 2002), Полученную меченую кДНК освобождали от РНК щелочным гидролизом (200 raM NaOH 40 минут при 65С) с последующей нейтрализацией щелочи З М ацетатом натрия (рН 5,5) и переосаждением этанолом (Heller et al., 1997; Ye et al., 2000). Цианочипы версии 1.4 (CyanoCHIP v. 1.4) были предоставлены компанией TaKaRa. Микрочипы прегибридизовали в буфере, содержащем, 4х SSC, 0,2% SDS, 5х раствор Денхарда, 100 нг мл"1 ДНК спермы лосося, при температуре 65С 1 ч. Гибридизацию проводили при тех же условиях в течение 12 ч. Гибридизованные чипы отмывали в 2х SSC (lx SSC содержит 150 mM NaCl и 15 тМ цитрата натрия) при комнатной температуре, 2х SSC 10 мин при 60С, затем в 0,2xSSC и 0,1% SDS 10 мин при 60С и в 0,2х SSC 2 мин при комнатной температуре. Микрочипы сканировали на сканере GMS418 (Affimetrix, США) с последующим анализом интенсивности сигналов индивидуальных генов при помощи программы AutoGene V. 4.1 software (BioDiscovery, США). Интенсивность сигнала каждого гена нормализовали по сумме интенсивностей сигналов всех генов за исключением генов рРНК. Затем рассчитывали изменения в количестве транскрипта каждого гена по отношению к общему уровню мРНК. Все эксперименты проводили в двух повторностях. Для того, чтобы, идентифицировать регуляторы ответа, принимающие участие в двухкомпонентных системах, контролирующих ответ на солевой и гиперосмотический стрессы, мы создали библиотеку мутантов, дефектных по генам rrel-rre42. Всего геноме Synechocystis было найдено 45 генов регуляторов ответа: 42 гена в хромосоме и 3 — в плазмидах цианобактерии (Рис. 4). Восемнадцать штаммов, дефектных по генам, кодирующим регуляторы ответа, были получены на Кафедре генетики, МГУ, Москва, Россия. Нами было завершено конструирование делеционных мутантов по регуляторам ответа, закодированным в хромосоме. Нарушение работы гена производилось с помощью сайт-специфического мутагенеза. Кассета устойчивости к антибиотику вставлялась в ген таким образом, чтобы нарушить транскрипцию полноразмерного гена регулятора ответа. В некоторых случаях из генов убирался небольшой фрагмент (Табл. 1).
Карты-схемы полученных делеционных мутантов с указанием доменов белков регуляторов ответа представлены на рисунках 5 и 6. Контроль степени сегрегации хромосом проводился с помощью метода ПЦР (Рис. 7). Для проверки мы использовали те же праймеры, что и в случае конструирования мутантов. В диком типе размер амплификата соответствует длине гена тте, а в мутанте он больше на 1400-1600 нуклеотидов, в зависимости от вставленной в него кассеты устойчивости к антибиотику.
