Введение к работе
На сегодняшний день одной из основных проблем орошаемых земель является засоление [Базаров, 2006]. Соль, попадая в растительные клетки, вызывает в них нарушение тонких биохимических механизмов, определяющих качественное и количественное своеобразие метаболических функций, ход процессов газообмена, гомеостаз и использование доступных источников энергии [Ермаков, 2005]. В ответ на действие стрессора в растительном организме происходят значительные изменения, направленные на нейтрализацию осмотических и токсических эффектов. Сюда относятся: изменение ионной проницаемости мембран, синтез осмолитов и осмопротекторов [Балнокин, 1993; Титов и др., 2003], интенсификация энергетического обмена [Семихатова, 1990; Головко, 1999], интеграция углеродного и азотного метаболизма [Кафи и др., 2003]. В такой ситуации наибольший адаптационный потенциал имеют растения, относящиеся к Сд-типу (кукуруза, сорго, амарант и др.), для которых характерна более сложная морфофизиологическая структура и лучшая приспособленность к условиям современной окружающей среды по сравнению с Сз-растениями [Воронин и др., 1995].
Одним из главных метаболитов, координирующих слаженную работу обеих тканей, является малат [Эдварде, Уокер, 1986]. В утилизации указанного интермедиата принимает участие широкий спектр ферментов, что позволяет ему играть существенную роль в поддержании внутренних физиологических условий клеток при стрессовом воздействии [Епринцев и др., 1999]. Двойной путь утилизации малата с помощью малатдегирогеназ (МДГ) и малик-энзимов (МЭ) дает возможность организму уменьшить зависимость от гликолиза при образовании энергии и синтезе углеродных скелетов [Пинейру и др., 1991]. Растительная МДГ-система представляет собой динамическое равновесие белков, способное четко реагировать на физиологическое состояние и потребности организма, а также на изменение окружающей среды. Малатдегидрогеназная ферментная система представлена четырьмя дегидрогеназами, две из которых обладают оксидоредуктазной активностью, а две другие - декарбоксилирующей [Иванищев, Курганов, 1992]. Считается, что индуцированные солью изменения в работе этих ферментов вносит существенный вклад в формирование адаптивной реакции клетки к действию стрессора [Косулина и
др., 1993; Епринцев и др., 1999]. В настоящее время активно обсуждается вопрос о формировании адаптивных реакций растений с разным типом метаболизма. Но, несмотря на большое количество работ, посвященных биохимическим механизмам адаптации растений разных экологических групп, наблюдается дефицит исследований, направленных непосредственно на изучение ответной реакции дифференцированных тканей Сд-растений на действие стрессовых факторов. Особый интерес представляют метаболические пути, с помощью которых осуществляется интеграция работы мезофилла и обкладки.
В свете этого, проблема распределения стрессовой нагрузки в морфофизиологической системе тканей Сд-растений и вопрос о том, к каким изменениям в функционировании МДГ системы мезофилла и обкладки приводит повышенное содержание соли во внешней среде, имеют большое значение.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение физиолого-биохимических аспектов адаптивной реакции малатдегидрогеназной системы мезофилла и обкладки Сд-растений к условиям солевого стресса.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
С помощью модифицированного метода разделения мезофилла и обкладки получить дифференцированные ткани из листьев изучаемых растений.
Используя универсальные маркеры солевого стресса (накопление пролина и аланина, увеличение общего уровня свободных аминокислот, активация пероксидазы и ферментов ЦТК), оценить степень стрессового воздействия хлорида натрия на мезофилл и обкладку кукурузы в условиях кратковременного засоления.
Исследовать динамику активности ферментов МДГ-системы в мезофилле и обкладке Сд-растений малатного типа в норме и под влиянием стрессора.
Провести анализ изоферментного состава НАД-МДГ из мезофилла и обкладки листьев Сд-растений, относящихся к разным биохимическим группам, и сравнить его с изозимным спектром данного фермента у Сз-растений.
Изучить субклеточную локализацию изоформ НАД-МДГ мезофилла и обкладки кукурузы в нормальных и стрессовых условиях.
6. Выявить стресс-индуцированные изменения в составе множественных молекулярных форм других малатдегидрогеназ из дифференцированных тканей листьев кукурузы.
Исследовать влияние засоления на содержание важнейших интермедиатов, в том числе малата, пирувата и некоторых других, в разделенных тканях кукурузы.
Разработать гипотетический механизм адаптивного ответа клеток мезофилла и обкладки Сд-растений (на примере кукурузы) к условиям солевого стресса на уровне малатдегидрогеназной ферментной системы.
Научная новизна. Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о физиолого-биохимических различиях дифференцированных тканей Сд-растений в нормальных и стрессовых условиях. Обнаружено, что в клетках мезофилла опытных растений значения индикаторных показателей развития стрессовой реакции более высокие, по сравнению с обкладкой, т.е. при кратковременном солевом воздействии основные реакции общего адаптационного синдрома локализованы в клетках мезофильной ткани.
Характер изменения активности НАД-зависимых ферментов МДГ-системы указывает на интенсификацию в стрессовых условиях ЦТК и анаплеротических реакций синтеза органических субстратов в обеих исследуемых тканях. Судя по динамике активности НАДФ-МДГ и МЭ в клетках мезофилла изучаемых растений, при засолении происходит значительное ингибирование восстановительной реакции цикла Хетча-Слэйка, однако стрессор практически не влияет на активность ферментов данного пути в клетках обкладки. Установлена более высокая лабильность функционирования НАД-МДГ мезофилла кукурузы, по сравнению с обкладочной формой фермента.
Выявлены различия изоферментного состава НАД-МДГ у Сд-растений, принадлежащих к разным биохимическим группам и отличающихся по солеустойчивости. Показано, что синтез изозимов НАД-МДГ de novo, обеспечивающий трансформацию метаболизма в ответ на изменение внешних факторов, локализован в клетках мезофилла Сд-растений, тогда как в кранц-клетках фотосинтезирующих Сд-растений и у растений Сз-типа индуцибильных форм данной МДГ не было обнаружено. При засолении в обкладке синтезируются новые изоформы НАД-МЭ и НАДФ-МДГ, но
6 их количество не превышает числа изозимов, функционирующих в мезофилле в
нормальных и стрессовых условиях.
Наблюдаемые в стрессовых условиях концентрационные колебания изученных интермедиатов, а также изменения ферментативной активности, указывают на возможную индукцию в тканях кукурузы при засолении дополнительного метаболического пути, связанного с синтезом и транспортировкой аспартата.
Практическая значимость. Практическая значимость настоящей работы, прежде всего, связанна с тем, что засоление является одной из главных проблем пахотных земель Центрального Черноземья в связи с практикуемым режимом полива [Добровольский, 2001]. Знание физиолого-биохимических механизмов адаптации растений к солевому стрессу и исследование отдельных звеньев адаптивного ответа разных тканей Сд-растений, обеспечивающих координацию их метаболизма в целостную систему, позволят в будущем подбирать наиболее устойчивые сорта в данных экологических условиях.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на био лого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по «Физиологии и биохимии растений», в спецкурсах «Фотосинтез», «Дыхание», «Метаболизм органических кислот», а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на 6-ой и 11-ой международных Пущинских конференциях молодых учёных «Биология - наука 21-ого века» (Пущино, 2002, 2007), VI съезде общества физиологов растений России (международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007), V-ой международной научной конференции «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Минск, 2007), межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2001, 2002, 2003, 2005, 2006, 2007), ежегодной научной сессии отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2003, 2007).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены ВІЗ публикациях - 9 статьях и 4 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы (177 источников). Иллюстрационный материал включает 31 рисунок и 14 таблиц.
