Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1. КЛАССИФИКАЦИЯ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ 15
Неинфекционные болезни растений 16
Инфекционные болезни растений 29
1.2. ВОЗБУДИТЕЛИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ..30
Грибные возбудители болезней 30
Вирусы и вироиды 31
Бактериальные возбудители болезней 33
1.2.3.1. Кольцевая гниль картофеля 36
ИЗМЕНЕНИЯ, ПРОИСХОДЯЩИЕ В РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКЕ ПРИ ПАТОГЕНЕЗЕ 39
МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ 41
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РАСТЕНИЙ И ПАТОГЕНА 42
СПЕЦИФИЧЕСКОЕ РАСПОЗНОВАНИЕ 49
ЗАПУСК КАСКАДА СИГНАЛОВ 50
ГЕНЫ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ 53
ПРОИСХОЖДЕНИЕ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ 54
1.10. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ РАСТЕНИЯ В ОТВЕТ НА
ВНЕДРЕНИЕ ПАТОГЕНА 56
Окислительный взрыв 56
Апоптоз 59
Изменение проницаемости мембран 61
Синтез фитоалексинов 63
Изменение активности ферментов 64
Синтез PR-белков 65
Синтез ингибиторов протеиназ 68
1.11. СИГНАЛЬНЫЕ МОЛЕКУЛЫ 70
Элиситоры 71
Салициловая кислота 72
Оксид азота 72
Липоксигеназы 73
Жасмоновая кислота и ее производные 74
Этилен 74
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ В РАЗВИТИИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ 76
СИГНАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ 78
Аденилатциклазная сигнальная система 81
МАР-киназная сигнальная система 81
Кальциевая сигнальная система 81
Липоксигеназная сигнальная система 82
NO-синтазная сигнальная система 82
Фосфатидатная сигнальная система 83
Протонная сигнальная система 83
НАДФН-оксидазная сигнальная система 84
1.14. ФЕРМЕНТ ПЕРОКСИДАЗА РАСТЕНИЙ 87
Исторические факты о пероксидазе 87
Классификация пероксидаз 88
Строение пероксидаз 90
Механизмы расщепления перекиси водорода с участием пероксидазы растений 94
Субстратная специфичность пероксидаз 96
Множественность молекулярных форм пероксидазы 103
Физиологические функции пероксидазы 108
Генетический контроль синтеза пероксидаз 108
Локализация пероксидаз в растительной клетке 110
Термостабильность пероксидаз 112
Антипатогенное действие пероксидаз 113
Участие пероксидаз в лигнификации и суберинизации клеточной стенки растения 115
Участие пероксидазы в дыхании растений 119
1.14.14. Участие пероксидазы и фитогормоное в стрессовых
воздействиях на растение 120
УЧАСТИЕ ПЕРОКСИДАЗ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАСТЕНИЯ В РЕАКЦИИ НА ПАТОГЕНЕЗ 122
ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 130
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 134
Растительный материал 134
Суспензионные культуры тканей картофеля 136
Бактериальные культуры 138
Культивирование растений in vitro с бактериями 141
Культивирование суспензионных культур картофеля с бактериальным патогеном 141
Выделение и очистка экзополисахаридов из бактериальной культуры 142
Культивирование суспензионных культур картофеля с экзополисахаридами 142
Выделение слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз картофеля 143
Определение пероксидазной активности 144
Кинетика пероксидазной реакции в суспензионных клетках картофеля при заражении патогеном 144
Определение оптимума рН пероксидазной активности 145
Сокультивироеание суспензионных тканей клеток картофеля с ингибиторами белкового синтеза 145
2.13. Электрофоретические методы 146
2.13.1. Электрофорез в ПААГ нативного белка 146
Электрофорез в ПААГсДЦС- Na 147
Окраска и обесцвечивание гелей 148
Окраска геля на пероксидазную активность 148
Иммунизация кроликов и получение антисывороток на пероксидазу хрена 149
Двойная иммунодиффузия в геле 150
Подбор концентраций антител 150
Сокулыпивирование суспензионных тканей клеток картофеля с бактериальным патогеном и антителами 151
Вестерн-блоттинг 152
Выращивание яровой пшеницы на загрязненных почвах 152
Выращивание картофеля с использованием регуляторов роста, выделенных из хвойных экстрактов 153
2.21. Статистическая обработка результатов 154
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 158
Определение степени устойчивости 10 сортов картофеля к кольцевой гнили при их искусственном заражении вирулентным штаммом 5369 кольцевой гнили 1 158
Распространение бактерий по тканям растений картофеля in vitro при заражении вирулентным штаммом 5369 С. michiganensis subsp. sepedonicus 167
Влияние различных по вирулентности и мукоидности штаммов Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus на активность растворимой (общей) пероксидазы в тканях растений картофеля (корень, лист, стебель) 170
Исследование активности растворимой (общей) и слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в тканях растений картофеля in vitro 180
3.5. Определение оптимума рН активности слабосвязанной с
клеточной стенкой пероксидазы в тканях корней, листьев и
стеблей исследуемых сортов картофеля 182
Межтканевой полиморфизм изопероксидаз картофеля 187
Межсортовой полиморфизм слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз в тканях корней, листьев, стеблей исследуемых сортов картофеля 193
3.8. Определение оптимума рН активности слабосвязанной с
клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из тканей корней,
стеблей и листьев исследуемых сортов картофеля при заражении
кольцевой гнилью 198
Влияние заражения кольцевой гнилью на изоферментный состав слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы картофеля в тканях листьев, стеблей и корней 202
Определение степени устойчивости различных диких и гибридных линий картофеля к вирулентному штамму 5369 кольцевой
гнили 215
3.11. Определение оптимума рН слабосвязанных с клеточной стенкой
пероксидаз в тканях диких и гибридных линий картофеля 221
3.12. Исследование изофермеитного состава слабосвязанных с
клеточной стенкой пероксидаз в тканях диких и гибридных линий
картофеля 221
3.13. Определение оптимума рН активности слабосвязанных с
клеточной стенкой пероксидаз в тканях диких и гибридных линий
картофеля при заражении кольцевой гнилью 225
Исследование изменения изофермеитного состава слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз в тканях диких и гибридных линий картофеля при заражении кольцевой гнилью 227
Активность слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы суспензионных культур тканей картофеля 231
Определение изменения оптимума рН активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в суспензии клеток контрастных по устойчивости сортов картофеля при заражении бактериальным патогеном 232
Активность пероксидаз, выделенных из вирулентного штамма 5369 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus 233
Влияние ЭПС штамма 5369 на активность пероксидазы и фенилаланин-аммиак-лиазы 237
Влияние ЭПС на активность пероксидаз, выделенных из суспензионных культур клеток картофеля 242
Зависимость повышения активности пероксидазы при бактериальном патогенезе от синтеза фермента de novo 247
Динамика активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток картофеля сортов Луговской и Лукьяновский при заражении бактериальным патогеном 1 251
Измерение кинетических параметров активации слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток картофеля в ответ на бактериальное заражение 256
Изучение изоферментных спектров пероксидазы, выделенной из суспензионных клеток картофеля 264
Определение оптимума рН активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в суспензионных тканях сортов Луговской и Лукьяновский при гипо и гипертермии 270
Культивирование бактериального патогена при различных температурах 275
Динамика активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в суспензионных тканях сортов Луговской и Лукьяновский при гипотермии и патогенезе 278
Динамика активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в суспензионных тканях сортов Луговской и Лукьяновский при гипертермии и патогенезе 281
Зависимость повышения активности слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы при бактериальном заражении от синтеза фермента de novo при гипертермии 283
3.15.14. Влияние антител к пероксидазе хрена на активность
слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в суспензионных
клетках картофеля при заражении кольцевой
гнилью 285
Изоформы слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы картофеля в присутствии антител на пероксидазу хрена 290
Выживаемость суспензионных клеток картофеля при заражении кольцевой гнилью. Влияние добавления антител к пероксидазе хрена на выживаемость суспензионных клеток картофеля при заражении 293
Пероксидаза - как маркер стрессовых состояний у растений. Практическое применение 299
Детекция влияния обработки аналогами препарата «Силк» растений картофеля в полевых условиях 301
3.15.19. Влияние высоких доз фторидов на метаболизм яровой пшеницы
в модельном опыте 2004-2005 г 311
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 323
ВЫВОДЫ 335
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 338
Введение к работе
Растения живут в постоянно изменяющихся условиях внешней среды, подвергаются действию различных факторов абиотической и биотической природы. Им приходится адаптироваться к этим факторам и формировать механизмы противодействия их негативному влиянию. Одной из центральных проблем современной биологии растений является исследование генетически контролируемых механизмов устойчивости растений к различным стрессам, среди которых особая роль отводится биотическим стрессам, например патогенезу, и изучению механизмов фитоиммунитета.
Внимание исследователей к этой проблеме объясняется тем, что наличие или отсутствие фитоиммунитета во многом определяет рост, развитие и продуктивность растений. Особенно это важно для сельскохозяйственных растений, продуктивность которых во многом определяется их способностью противостоять действию патогена. Именно это обстоятельство обуславливает актуальность исследований, направленных на познание механизмов, которые определяют устойчивость растений к действию патогенов.
Значимость защиты растений возрастает в условиях концентрации и специализации сельского хозяйства. Мировые потери урожая картофеля от болезней составляют 11.6% валового сбора. Так, бактериозы картофеля -черная ножка и кольцевая гниль (рис.1) - могут уничтожить 40-50% урожая (Васильева, 2001).
В настоящее время постоянно разрабатываются и совершенствуются меры по борьбе с болезнями картофеля на основе детального изучения биологии патогенов, взаимодействия патогенов и растения-хозяина. Особое значение имеют работы по изучению молекулярного механизма защиты растений от патогена (Ладыженская, Проценко, 2002).
Рис. 1. Карта распространения кольцевой гнили картофеля, вызываемой Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Красным выделены области сильного распространения заболевания (Brtish Potato Councl 2004, ).
К физиологическим реакциям растений на инфицирование патогеном относятся образование некротических зон в точке контакта с возбудителем, быстрый окислительный взрыв, при котором происходит перекисное окисление липидов (Аверьянов, 1994). Этот взрыв инициируется свободными радикалами кислорода, возникающими в период образования перекисей жирных кислот. Выработка свободных радикалов происходит через несколько минут после взаимодействия патогена и растения и запускает реакцию сверхчувствительности, которая индуцирует экспрессию защитных генов (Ванюшин, 2001).
Формирование защитного ответа связано с продуцированием сигнальных молекул в инфицированных тканях и их передачей к неинфицированным клеткам растения, где они индуцируют защитные реакции. К сигнальным молекулам относят перекись водорода, салициловую кислоту, жасмоновую кислоту и метиловый эфир жасмоновой кислоты, этилен, олигосахарины и системин (Дмитриев, 2003).
Сигнальные молекулы запускают работу сигнальных систем растения (Тарчевский, 2002).
Активация НАДФН-оксидазы запускает работу супероксидсинтазной сигнальной системы. Окисление НАДФЫ молекулярным кислородом приводит к образованию супероксид-анионов, которые, в результате реакции, катализируемой супероксиддисмутазой, превращаются в перекись водорода. Сильное повышение содержания активных форм кислорода 02" и перекиси водорода (так называемый окислительный взрыв) оказывают подавляющее действие на развитие патогенных микроорганизмов. В то же время активные формы кислорода и перекись водорода (непосредственно или опосредованно) вызывают активацию факторов регуляции транскрипции и, в результате, экспрессию защитных генов (Тарчевский, 2000). В образование активных форм кислорода, кроме НАДФН-оксидазы, могут вносить вклад и другие ферменты, например локализованная в клеточной стенке пероксидаза, активирующаяся при действии патогенов (Wojtaszek, 1997).
Изменение активности пероксидазы происходит при влиянии различных инфекций, таких как бактериальная, грибная, вирусная и т.д.
Считается, что активация пероксидазы в тканях х растений, инфицированных патогеном, может происходить, во-первых, за счет пероксидазы, синтезируемой самим патогеном, во-вторых, за счет активации уже имеющихся в клетке изопероксидаз и, в третьих, за счет синтеза пероксидаз de novo.
Пероксидаза относится к ферментам, для которых доказано присутствие множественности молекулярных форм, что позволяет растению приспосабливаться к непрерывно изменяющимся условиям среды. Индивидуальные изопероксидазы различаются по своей способности катализировать реакции окисления различных субстратов.
Изучение изоферментного состава пероксидазы дает возможность обнаружить генотипы по присутствию характерных для них изоэнзимов в генетически неоднородном материале. Также по набору изоэнзимов и по активности можно оценивать влияние биотических и абиотических стрессовых ситуаций на растение. Используя изоэнзимы пероксидазы можно
11 более полно характеризовать защитные механизмы растений и найти подходы для диагностики устойчивости к патогенам у разных сортов сельскохозяйственных культур.
Клеточная стенка является ключевой структурой растительного организма, которая выполняет многообразные функции. Она состоит из множества компонентов, которые детерминированы по строению и локализации. Клеточная стенка, помимо общепринятой механической роли, участвует в определении направления и скорости растяжения клетки, а также во взаимодействии и распозновании патогенных организмов.
В настоящее время установлено, что в растениях некоторые пероксидазы локализованы в апопластном пространстве клеток, где они связаны ионными и ковалентными связями с полимерами клеточной стенки. Раньше считалось, что пероксидазы клеточной стенки участвуют только в биосинтезе лигнина и в образовании поперечных сшивок в клеточных стенках. Однако С. Бествиком с соавторами была показана секреция пероксидазы в клеточных стенках листьев табака при грибном инфицировании (Bestwick et al., 1997). В 1998 г цитохимическими методами ими была показана локализация пероксидазной активности в клеточных стенках в неинокулированных тканях листьев салата и в тканях, зараженных бактериальным патогеном (Bestwick et al., 1998). В 1999 г Ж. Болвилл с соавторами показали, что пероксидазы клеточных стенок ответственны за продукцию перекиси в ходе окислительного взрыва в ответ на действие элиситора из патогенного гриба в клетках фасоли (Bolwell et al., 1999).
В самые последние годы появились данные о том, что на клеточной поверхности растительных клеток присутствуют слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы, способные легко отделяться от клеточной стенки и циркулировать по апопласту целого растения, инициируя в месте контакта с патогеном «иммунный ответ». Вероятно, именно эти пероксидазы первыми сталкиваются с «атакой» патогена, вступают в борьбу с ним, «посылают» сигнал о появлении патогена в геном растительной клетки, инициируют тем
самым ее защитную реакцию. Однако все эти вопросы, несмотря на свою важность, остаются изученными крайне слабо. Поэтому изучение вопросов формирования с участием слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз иммунного ответа растения в самые первые моменты патогенеза представляется актуальным.
Основные положения, выносимые на защиту:
1.Среди генотипов картофеля существует полиморфизм по ряду признаков: по устойчивости к такому биотическому стрессу как инфицирование кольцевой гнилью, по активности слабосвязанных с клеточной стенкой пероксидаз, по множеству ее молекулярных форм.
Действие патогена кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus (Cms) активирует слабосвязанную с клеточной стенкой пероксидазу и по этому признаку контрастные по устойчивости генотипы картофеля различаются.
Механизмы участия слабосвязанной с клеточной стенкой пероксидазы в формировании реакции клетки на инфицирование патогеном различны у контрастных по устойчивости генотипов картофеля: быстрое повышение активности фермента происходит за счет изменения кинетических параметров у устойчивого сорта и медленное повышение активности фермента у восприимчивого сорта происходит за счет синтеза новых молекул.
4. Слабосвязанные с клеточной стенкой пероксидазы участвуют в
механизмах, определяющих устойчивость растений картофеля к патогену:
ингибирование фермента приводит к резкому снижению жизнеспособности
клеток картофеля при действии патогена.
5. Пероксидазу можно использовать для детекции активации защитных
механизмов растений при действии биологически активных веществ или для
определения абиотического стресса, который испытывают растения в
агроэкосистемах при их загрязнении промышленными выбросами.
