Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы
Глава 1.1. Стресс, стрессоры и индукторы
1.1.1. Определение стресса и предистория 21
1.1.2. Стресс и растения 22
1.1.3. Индукторы защитных механизмов 25
1.1.4. Окислительный стресс. Оксиданты и антиоксиданты 27
Глава 1.2. Влияние окислительного стресса на фотосинтетический аппарат 30
1.2.1. Мишени окислительного стресса 30
1.2.2. Механизмы защиты фотосинтетического аппарата от окислительного стресса 33
1.2.3. Роль баланса оксидантов и антиоксидантов в стресс-защитной системе 41
1.2.4. Стресс-защитные соединения и их возможная роль 52
1.2.4.1. Холинсодержащие ретарданты 53
1.2.4.2. Осмопротекторы 57
1.2.4.3. Фитогормоны и соединения с гормональной активностью 59
Глава 1.3. Влияние УФ радиации на фотосинтетический аппарат. Защитное действие оранжево-красного света 65
1.3.1. Действие ультрафиолетовой радиации на фотосинтетический аппарат 65
1.3.2. Защитное действие красного света в животных и растительных организмах. Участие фоторецепторов 69
1.3.3. Обсуждение механизмов защитного действия красного света 78
Глава 1.4. Механизмы теплоустойчивости и фотоингибирования
1.4.1. Тепловой стресс 83
1.4.2. Фотоингибирование 87
1.4.3. Тепловой стресс и фотоингибирование 87
1.4.4. Перекрестная теплоустойчивость 89
1.4.5. Особенности фотоингибирования в цианобактериях. Роль катал азы-пероксид азы 91
Заключение 94
Часть II. Материалы и методы исследований
Глава 2.1. Объекты, условия выращивания и обработки 98
2.1.1. Выращивание высших растений и схема обработок 98
2.1.2. Методика выращивания клеточных культур 104
2.1.3. Приготовление препаратов тилакоидных мембран 107
Глава 2.2. Измерительные методы 109
2.2.1. Ростовые измерения, анализ активности ферментов, содержания пигментов и уровня гормонов 109
2.2.2. Оценка фотосинтеза и фотосинтетической активности 113
2.2.2.1. Аппаратура и методы измерения СОг газообмена 113
2.22.2. Определение скорости электронного транспорта, содержания Н2Ог и фотосинтетического выделения кислорода 114
2.2.2.3. Флуоресцентный анализ 115
2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных 118
Часть III. Результаты и обсуждение
Глава 3.1. Хлорхолинхлорид и холинхлорид повышают устойчивость фотосинтетического аппарата растений к УФ радиации и тепловому стрессу 119
3.1.1. Влияние ХСС на рост, активность ФА и пигментный состав в клетках микроводорослей и в листьях фасоли и пшеницы 121
3.1.2. Влияние холинсодержащих соединений на устойчивость ФА к высоким температурам и УФ радиации 133
3.1.3. Действие холинсодержащих соединений на ПОЛ, активность антиоксидантных ферментов и содержание низкомолекулярных антиоксидантов в листьях 138
3.1.4. Действие холинсодержащих соединений на содержание фитогормонов 146
3.1.5. Обсуждение механизмов защитного действия холин содержащих соединений на фотосинтетический аппарат 150
3.1.6. Заключение 159
Глава 3.2. Предоблучение узкополосным красным светом с Д — 625 и 660 нм повышает устойчивость фотосинтетического аппарата к УФ радиации .163
3.2.1. Влияние красного и дальнего красного света на рост растений салата, облученных УФ-В и УФ-С. Модифицирующее действие гиббереллинов 165
3.2.2. Облучение красным светом с Дг=660 нм усиливает выделение этилена в хлорелле и накопление цитокининов в листьях пшеницы. Роль фитохромной системы 167
3.2.3. Влияние предоблучения красным и дальним красным светом на содержание в листьях фотосинтетических пигментов 170
3.2.4. Предоблучение листьев красным светом повышает устойчивость фотосинтетического аппарата к УФ-диацииации 177
3.2.5. Влияние красного света и УФ на пероксидазную активность 192
3.2.6. Обсуждение механизмов защитного действия красного света на фотосинтетический аппарат растений. Фоторецепторы в животных и растительных клетках 196
3.2.7. Заключение 218
Глава 3.3. Тепловая предобработка повышает устойчивость фотосинтетического аппарата к повторному тепловому стрессу и свету высокой интенсивности. Факторы, регулирующие устойчивость 224
3.3.1. Характерные фазы изменений фотосинтетических параметров при тепловом стрессе 225
3.3.2. Роль оксидантов и антиоксидантов 230
3.3.3. Кросс-устойчивость, индуцированная тепловым стрессом 241
3.3.4. Обсуждение механизмов формирования повышенной стресс устойчивости фотосинтетического аппарата растений, подвергнутых кратковременному нагреванию 246
3.3.5. Заключение 250
Глава 3.4. Фотоингибирование в цианобактерии Synechocystis sp РСС 6803. Роль каталазы-пероксидазы 254
3.4.1. Мутант katG 255
3.4.2. Мутант Prq20 265
3.4.3. Обсуждение механизмов стресс-устойчивости мутантов 268
3.4.4. Заключение 270
Общее заключение 271
Общие выводы 277
Благодарности 278
Приложение к главе 2.2 279
Приложение к главе 3.2 281
Список литературы 285
- Механизмы защиты фотосинтетического аппарата от окислительного стресса
- Выращивание высших растений и схема обработок
- Влияние предоблучения красным и дальним красным светом на содержание в листьях фотосинтетических пигментов
- Кросс-устойчивость, индуцированная тепловым стрессом
Механизмы защиты фотосинтетического аппарата от окислительного стресса
Клетки аэробных организмов выработали несколько механизмов защиты ФА от ОС и приспособления к нему. Прежде всего, механизмы защиты делятся на быстрые и медленные. Быстрые механизмы защиты - это тепловая диссипация световой энергии, и ее перераспределение между фотосистемами, изменение мембранного потенциала и т. д. Медленный механизм включает синтез стрессовых белков (белков теплового шока), антиоксидантов, мембранных липидов, низкомолекулярных защитных соединений (Yordanov, 1993; Heckathom et al., 1998; Креславский и др., 2007а).
Антиоксиданты. В соответствии с Halliwell (1994) антиоксидантом является любая молекула, которая ограничивает или замедляет окисление другой молекулы. Молекулы, обладающие антиоксидантной активностью, объединены в слаженно работающую антиоксидантную систему, имеющую много уровней регуляции. Вовлечение антиоксидантной системы, которая нейтрализует негативное действие стресса, превращая АФК и другие высокоокисленные соединения (оксиданты) в нетоксичные продукты, является одним из основных механизмов защиты ФА от окислительного повреждения (Foyer et al., 1994; Foyer et al., 2003; Asada, 1996, 2006; Allen, 1995; Alscher et al., 1997, 2002; Хавинсон и др., 2003). В ответ на повышение уровня АФК возрастает активность как антиокислительных ферментов, так и содержание низкомолекулярных антиоксидантов. В частности, в хлоропластах, которые являются основным местом образования АФК в листьях, работает аскорбат- глутатионовый цикл (Foyer et al., 1997; Asada, 2006), а также функционируют супероксиддисмутазы (СОД), содержащие Fe и Cu-Zn (Alscher et al., 2002). При развитии окислительного стресса усиливается активность этого цикла, а также активность Fe-СОД, Cu-Zn-СОД и других антиокислительных ферментов. Предполагается также, что СОД и каталаза участвуют в защите белков ФС2 от денатурации (Thompson et al., 1989).
Белки теплового шока и низкомолекулярные антиоксиданты. Одно из общих свойств клеток всех типов живых организмов состоит в том, что в ответ на увеличение температуры они включают синтез специфического набора белков, называемых белками теплового шока (БТШ). Эти белки помогают клетке выжить в условиях высокой температуры и вернуться после температурного воздействия к нормальной жизни (Vierling, 1991; Кулаева, 1997; Косаковская, 2008). Низкомолекулярные БТШ у растений обнаруживаются не только в цитоплазматических гранулах теплового шока, но и в других компартментах, в том числе в хлоропластах (Heckathom et al. 1998, 2002) . Причем, почти все из обнаруженных БТШ хлоропластов кодируются в ядре, синтезируются в цитоплазме, и потом транспортируются в хлоропласт, где выполняют защитную функцию во время теплового стресса.
Сравнительное изучение реакции белоксинтезирующей системы на стрессы у различных живых организмов выявило универсальность механизма, связанного с генерацией стрессовых белков. Изменения в функционировании генетической системы очень сходны у различных эукариот, а в некоторых случаях идентифицированы и у прокариот (Косаковская, 2008). Стрессовые белки синтезируются не только в ответ на тепловой стресс, но и при действии засоления, обработке растений солями Cd, а также АБК (Косаковская, 2008).
По-видимому, стрессовые белки играют определенную роль в защите ФА от влияния неблагоприятных факторов среды. Имеются данные, что низкомолекулярные БТШ могут быть связаны с тилакоидами и защищают систему выделения Ог белки КВК ФС2 от теплового стресса (Heckathom et al., 1998, 2002). Роль стрессовых белков в предотвращении отрицательных воздействий на фотосинтез требует дальнейшего анализа, однако, уже сейчас можно утверждать, что одной из функций стрессовых белков является участие в формировании защитных механизмов, обеспечивающих фотосинтетическую активность в стрессовых условиях.
Для защиты от окислительного стресса, по-видимому, важны не только БТШ, но и другие соединения, в том числе некоторые аминокислоты, осмотически активные соединения (пролин, бетаин, сахара и т.д.), абсцизовая кислота, каротиноиды и др. (Кузнецов, Рощупкин, 1994; Tanaka et al., 2000; Креславский и др., 2007а). Так, при исследовании роли БТШ и фосфорилирования отдельных полипептидов в культуре солеустойчивых клеток табака Nicotiana sylvestris L. в реакции этих клеток на засоление и высокую температуру не удалось найти корреляцию между синтезом БТШ 70 кДа и повышенной термотолерантностью клеток.
Эффективными «тушителями» АФК и радикалов являются фенольные антиоксиданты. В настоящее время выделено несколько тысяч фенольных соединений, среди которых выраженным антиоксидантным эффектом обладают витамины Е и К, убихиноны, триптофан и фенилаланин, а также большинство растительных пигментов, в частности, каротиноиды, флавоноиды, фенокарбоксильные кислоты. Антиоксидантное действие флавоноидов реализуется через различные механизмы действия. Они могут реагировать, как классические фенольные радикальные ингибиторы, взаимодействуя с липидными радикалами, либо реагируя на активные формы кислорода (Соловченко и Мерзляк, 2008).
Изменение липидного состава мембран. Активность мембран, в частности тилакоидных, в значительной степени определяется жирнокислотным составом липидов. По-видимому, как изменение соотношения ненасыщенных и насыщенных жирных кислот (Lyons, 1973; Климов, 1997; Murata et al., 1998; Grover et al., 2000; Трунова, 2007), так и содержание мембранных фосфолипидов, в частности в тилакоидных мембранах, важны для формирования устойчивости растений к стрессовым факторам.
Следует отметить также стресс-индуцированную стимуляцию синтеза наиболее устойчивых к данному виду стресса изоформ ферментов. Формой защиты может быть и подавление роста растений и фотохимических реакций в хлоропластах (Климов, 1997). На рис. 3 представлена, предложенная на основе ряда публикаций (Климов, 1997; Шакирова, 2001, Grover et al., 2000; Chinnusamy et al., 2005; Demmig-Adams, Adams, 2002), схема возможных путей повышения устойчивости ФА к неблагоприятным условиям окружающей среды путем создания стресс-устойчивых трансгенных растений с помощью генной инженерии. Из рисунка видно, что трансгенные растения должны синтезировать повышенное количество защитных низкомолекулярных соединений, к которым относятся, осмолиты, некоторые гормоны и антиоксиданты и соответствующие факторы транскрипции. К таким низкомолекулярным соединениям относятся, например, аминокислота пролин, глицинбетаин и холин (Кузнецов, Шевякова, 1999; Yang et al., 2005; Allakhverdiev et al., 2008). Холин входит в состав фосфолипидов различных мембран и является предшественником глицинбетаина, который можно рассматривать как защитное соединение, противодействующее развитию окислительного стресса, что было показано для многих факторов, индуцирующих в растении и его ФА окислительный стресс (Alia et al., 1998; Takabe et al., 1998; Allakhverdiev et al., 2008). Один из возможных механизмов — это протекция этих осмотически активных соединений против белковой деградации и агрегации (Ignatova, Gierasch, 2006). Среди антиоксидантных ферментов СОД играет центральную роль на начальных этапах в защите от окислительного стресса (Bowler et al., 1992, Alscher et al., 2002). Для детоксикации H202 решающее значение имеют каталаза и различные пероксидазы (Alcher et al., 2002; Шевякова и др., 2002; Asada, 2006). В частности в хлоропластах многих растений важную роль в защите против окислительного стресса играет аскорбатпероксидаза (Feierabend et al., 1992; Gupta et al., 1993; O Kane et al., 1996), у цианобактерий - СОД и каталаза- пероксидаза (Tichy, Vermaas, 1999).
Согласно имеющимся в литературе данным, созданы мутанты растений с повышенной активностью СОД (Allen, 1995) или аскорбатпероксидазы (Allen et al., 1997), повышенным синтезом глицинбетаина (Yang et al., 2005) и других стресс-защитных соединений, которые обладают повышенной устойчивостью к действию ряда индукторов окислительного стресса. Кроме того, повышенная стресс-устойчивость ФА может быть результатом изменения липидного состава мембран тилакоидов, а также способности к усиленному образованию высокомолекулярных липидов (рис. 3).
Выращивание высших растений и схема обработок
В экспериментах были использованы высшие растения (пшеница, фасоль, шпинат и салат), одноклеточные микроводоросли и цианобактерии. Для оценки стресс-устойчивости применяли несколько стресс-индуцирующих факторов:
1. Кратковременное (обычно 20 мин) воздействие высокой температуры с последующим выдерживанием проростков на свету различной интенсивности.
2. Фотостресс.
3. УФ-облучение.
4. В ряде опытов изучали NaCl-индуцированное фотоингибирование.
Действие стресс-факторов или индукторов неспецифической устойчивости на растения изучали по следующим схемам:
1. На высших растениях - кратковременный прогрев; кратковременный прогрев—»свет различной интенсивности; свет высокой интенсивности; обработка растений ХСС— УФ (кратковременный тепловой стресс). Облучение растений или отделенных листьев низкоинтенсивным светом различных длин волн —»УФ.
2. Цианобактерии: фотостресс ± солевой стресс.
Исследования на пшенице. Растения пшеницы использовали для экспериментов по исследованию влияния ХСС на фотосинтез и активность ФА, а также в опытах по влиянию термообработки на устойчивость ФА растений к вторичному стрессу и для определения уровня антиоксидантной активности. В отдельных экспериментах с пшеницей для сравнения с СС и ССС использовали ацетилхолин и глицинбетаин. В опытах использовали 8-12-дневные растения озимой пшеницы (Triticum aestivum L. Московская-35), выращенные в ящиках с просеянным песком на питательном растворе Кнопа (1/4 Кнопа), иногда на вермикулите. При этом 12-дн. проростки достигали стадии начала формирования 2-ого листа. Обработку проводили путем замачивания семян в 0. 5-1% водном растворе ССС или 2% СС в течение 6 ч, контрольные семена замачивали в дистиллированной воде. Растения выращивали в контролируемых условиях при средней интенсивности света 20-60 Вт м 2 ФАР (фотопериод 16 ч), температуре 20±1С до полного развития первых листьев. После чего оценивали ростовые параметры, устойчивость ФА к стрессовым факторам (УФ, тепловой стресс), содержание пигментов и антиоксидантную активность в листьях Часть растений использовали для тепловых обработок в разных световых режимах, другую часть использовали в качестве контроля.
Прогревание растений проводили в темноте путем погружения их в воду при температурах - 39С, 40С, 42С и 44С, используя термостат (± 0.1 С). Затем растения снова помещали на питательный раствор и экспонировали на свету различной интенсивности (20-800 рЕ м- с ФАР) в течение 1-4 суток. До температурных или световых обработок растения держали в темноте 30 минут для адаптации. Для создания необходимых световых режимов использовали лампу накаливания (1=1000 Вт) и тепловой фильтр (кювета 7 см, наполненная дистиллированной водой, которую периодически меняли), при этом растения пшеницы находились в термостате в горизонтальном положении. Для получения менее интенсивного света (до 60 Вт м 2) использовали либо люминесцентные лампы, либо лампы ДРЛФ-400.
В опытах по исследованию эффектов предварительного теплового закаливания растений на действие последующего стресса нативные проростки нагревали при 40С (20 мин) в темноте. Использовали для прогрева 40С, так как именно эта температура является закаливающей для проростков пшеницы (Акимова и др., 1994). Затем после выдерживания растений сутки или двое на свету (40-80 дБ квантов M V1 ФАР) подвергали вторичной тепловой обработке при температурах 40-44С (20 мин) или освещению светом 1000 Вт лампы накаливания (1=900-1000 дЕ м-V1 ФАР) для создания условий фотоингибирования. При этом растения лежали в горизонтальном положении в термостатированной кювете, в которой поддерживалась температура 20±1С.
Исследования на фасоли. Выращивали 10-12 д. растения фасоли (Phaseolus vulgaris L. Бербукская), которые использовали в основном для исследования влияния ХСС на стресс-устойчивость ФА растений. Холинсодержащие ретарданты: ССС и СС вводили в растения либо через питательный раствор (корневое введение), либо обрабатывали ретардантами листья. При корневом введении семена растений фасоли проращивали в дистиллированной воде при 24±1С в чашках Петри на слабом свету (5 Вт м 2). Через день после появления первых настоящих листьев воду часть проростков выдерживали 24 ч на растворе ССС (1.6 мМ) или СС (19 мМ). Затем проростки промывали и сажали в пластиковые сосуды, заполненные вермикулитом или песком. Растения выращивали на свету 60 Вт м 2 при фотопериоде 10 ч и температуре 18-22С. После 6-дн. выращивания растения брали на анализ и подвергали соответствующим световым обработкам с помощью УФ-В (7-8 ч, 0.45-1 Вт м 2) или воздействию теплового стресса при 43С, 6 мин. В опытах с обработкой листьев, проращенные семена помещали в сосуды с песком и выращивали 6 дней на свету 30-60 Вт м 2 при фотопериоде 10 ч и температуре 19-20С. Затем один из парных листьев обрабатывали ХСС, другой - дистиллированной водой. Этот лист считали контролем. Обычно на вариант использовали не менее трех пар листьев. Затем в пределах 0-4 суток проводили соответствующие анализы.
Опыты на шпинате и салате. Схемы экспериментов. Основные опыты по влиянию предоблучения КС (ДКС), а также других длин волн, на устойчивость ФА к УФ-облучению проводили на листьях двух видов растений: нативных семядольных листьях растений салата и отделенных (настоящих) полностью развитых листьях растений шпината. Большое количество использованных небольших растений салата (более 100 на вариант) позволило получить хорошую статистику и возможность изучать эффекты на нативных листьях. Растения шпината имели большие достаточно зеленые листья, однако их было сложно облучать, поддерживая одинаковые условия (одинаковую интенсивность света на поверхности листьев), поэтому мы использовали для облучения отделенные листья. Половину каждого листа облучали светом, другую половину не облучали, затем данные по нескольким (обычно 3) листьям усредняли, считая каждую половину за 100%. В этом случае также был исключен транспорт метаболитов из корня и стебля, инициированный облучениями, что нельзя было исключить в случае нативных растений салата. Так что каждый подход имел свои плюсы и минусы.
Использовали два типа низкоинтенсивного предоблучения: 1) - 5-10 мин КС и ДКС, что соответствует классическим низкоэнергетическим обратимым ДКС с максимумом 730 нм фитохром-контролируемым реакциям, которые инициирует свет с максимумом 660 нм; 2) - если облучение проводится достаточно длительно (несколько часов и более), это соответствует высокоэнергетическим фитохром-контролируемым реакциям (рис. 7). Их может инициировать как КС, так и ДКС.
1. В первой серии экспериментов растения салата (Lactuca sativa L., сорт Берлинский) выращивали на непрерывном свету в течение 72 ч с момента замачивания при фотопериоде 10 ч, температуре 23С и интенсивности света люминесцентных ламп 25 Вт м"2. Затем после последнего темнового промежутка времени (14 ч) растения подвергали световым обработкам, после чего снова выдерживали 24 ч в темноте. Для облучения использовали УФ-В (5 Вт м 2, 30 мин или 1ч), а также кратковременные КС и ДКС (7.5 мин) с максимумом 660 нм и 730 нм, соответственно. Далее растения росли в прежнем режиме с фотопериодом 10 ч в течение 2 сут. После этого измеряли соответствующие ростовые параметры и содержание Хл (а+в).
2. Во второй серии экспериментов было исследовано совместное действие кратковременного облучения КС с А,м=660 нм и УФ-А-радиации на эффективность темновых процессов фотосинтеза, выраженную как (Fm- Fs)/Fs, скорость фиксации СО? (Рп) и содержание Хл (а+в) и каротиноидов в листьях растений салата, а также на ростовые параметры. Растения выращивали на свету низкой интенсивности (1=0.5-1.5 Вт м 2, в некоторых случаях 10 Вт м 2) в большой кювете при фотопериоде 12 ч и температуре 20±1С в течение 8-10 дней. Сразу после последнего ночного периода растения облучали в течение 40-50 минут УФ-А (20 Вт м"2). Часть растений предварительно облучали КС (1 Вт м 2, 7.5 мин), затем сразу же подвергали облучению УФ. В некоторых случаях использовали облучение КС, затем ДКС (1.5 Вт м 2, 7.5 мин). Другую часть растений не подвергали световым обработкам (контроль). Затем после облучения все растения держали достаточно длительное время в темноте и в процессе выдерживания измеряли вышеупомянутые параметры, (п=5-7).
3. В 3-ей серии экспериментов использовали отделенные от растений полностью развитые настоящие листья либо растений шпината (сорт «Исполинский»), либо в некоторых экспериментах листья 3-х летней рябины и фасоли (Phaseolus vulgaris L. сорт «Бербукская»). Растения шпината выращивали, используя лампы ДРЛФ-400 (Саранск) при средней интенсивности 100 Вт м"2 и при средней суточной температуре 18±2С. Перед этим растения держали на белом свету низкой интенсивности (20 Вт м 2) с фотопериодом 10 ч в течение 4 суток, затем после последнего темнового периода отрезали листья и подвергали их различным облучениям - КС, ДКС и УФ-В, затем опять держали в темноте от 16 до 48 ч. В последнем случае (48 ч) часть листьев подвергали аналогичным облучениям еще один раз. Время облучений: КС и ДКС - 1-3 часа, оптимальная интенсивность света для проявления влияния КС была 1-3 Вт м"2. Доза УФ-В была порядка 1-2 Дж см"2. В этой серии определяли параметры переменной флуоресценции и содержание фотосинтетических пигментов - Хл (а+в) и каротиноидов, а также УФ-поглощающих пигментов, предположительно флавоноидов (далее флавоноиды), по соответствующей методике (Mirecki, Teramura, 1984).
Влияние предоблучения красным и дальним красным светом на содержание в листьях фотосинтетических пигментов
Известно, что в листьях растений, помещенных в темноту, старение обычно ускоряется, после некоторой лаг-фазы (Biswal, Biswal, 1984). При этом наблюдается постепенная- потеря- Хл и белков. Затемненные растения с семядольными листьями и отделенные листья подвержены часто используют для изучения старения. (Weaver, Amasino, 2001). Поэтому для- опытов использовали растения салата на, стадии семядольных листьев и отделенные полностью развитые листья шпината.
Мы наблюдали динамику изменений содержания пигментов в темновых условиях в семядольных листьях салата после соответствующих облучений проростков (рис. 33). Без УФ-облучения уровень пигментов в темноте сохранялся в течение 2 суток, затем уменьшался со временем, тогда как на свету уровень пигментов возрастал. Интересно, что экспозиция растений к свету после 2 суток темноты приводила к восстановлению уровня Хл (а+в), тогда как большее время выдерживания растений в темноте не позволяло при их переносе на свет восстановить уровень пигментов и фотосинтетическую активность (данные не показаны).
Отметим, что уровень каротиноидов снижался гораздо меньше, чем Хл а и в, а отношение Хл а/Хл в мало менялось в течение первых 2 суток, но увеличивалось через 6 суток в процессе содержания растений в темноте. По- видимому, после 2-дн. выдерживания в темноте начинается старение листьев. При этом вероятно, в основном разрушается Хл a/в светособирающий комплекс ФС 2, который обладает примерно равным отношением Хл а к Хл в (Bennett, 1981). КС-предоблучение само по себе мало влияло на содержание фотосинтетических пигментов (Хл и каротиноиды). С другой стороны уровень пигментов, поглощающих УФ (преимущественно флавоноиды) в результате облучения-КС возрастал уже через сутки на 5%.
Было детально изучено- влияние облучения УФ-А, а также пред облучения растений КС и КС-ДКС (варианты, КС— УФ, КС-»ДКС-»УФ) на содержание фотосинтетических пигментов в листьях по мере выдерживания растений в темноте в течение 5-6 суток (рис; 33)? в частности через сутки после выдерживания в темноте (табл. 10).
В результате УФ-облучения содержание пигментов, как хлорофилла айв, так и каротиноидов, регистрируемое по снижению оптической плотности в максимумах соответствующих полос в спектрах поглощения (Lichtenthaler, Wellbum, 1987), снижалось, по сравнению с темновым контролем. Снижение происходило сразу же после1 облучения, и усиливалось со временем. Возникновение-новых полос в спектрах при этом не наблюдалось.
Интересно отметить, что также как в темновом контроле, уровень» каротиноидов снижался-со временем гораздо меньше, чем Хл а и в. В варианте со световым контролем старения листьев не происходило, наоборот, содержание пигментов возрастало, свидетельствуя о хорошем, физиологическом состоянии растений. Предоблучение КС (км=660 нм, 8 мин, 1 Вт м"2) частично снимало ускоренную УФ-облучением деградацию хлорофилла и каротиноидов, особенно заметный эффект наблюдался через сутки и двое суток после облучений и последующего содержания растений в темноте, тогда как сам- КС (без УФ) практически не оказывал влияния. Если после предоблучения КС растения облучали ДКС (А,м=730 нм, 8 мин, 1 Вт м 2), то в таком случае влияние КС на УФ-индуцированное снижение уровня пигментов снималось. Это свидетельствует об участии активной формы фитохрома в действии КС, которое уменьшает негативное влияние УФ-облучения на содержание пигментов. Опыты, проведенные на листьях шпината, показали аналогичные закономерности: предоблучение КС снимало ингибирующее действие УФ-А на содержание Хл (а+в) (табл. 11). Причем само предоблучение КС уже через сутки (но не сразу после облучения) приводило к снижению содержания пигментов, что согласуется с идей развития в листе слабого окислительного стресса в ответ на предоблучение КС.
Согласно (Nooden, 2004), меньшее влияние УФ на содержание каротиноидов может объясняться тем, что жирные кислоты, освобожденные из тилакоидных мембран, связываются с каротиноидами и эти комплексы накапливаются в осмиофильных пластоглобулах, которые появляются по мере старения листьев.
Меньшая деградация Хл в может объясняться тем, что светособирающий комплекс, где содержатся все хлорофилловые пигменты, менее подвержен стрессовым условиям, чем комплексы РЦ, содержащие только Хл а.
Защитное действие КС против УФ-радиации было сильнее выражено на листьях салата, чем шпината. По-видимому, защитное действие КС зависит от интенсивности УФ-радиации, дозы света, условий выращивания, длины волны и ряда других причин. Может быть, больший эффект КС на листьях салата связан с тем, что растения салата выращивали на слабом свету (0:5—Г.5 Вт м"2), а шпината при более высокой интенсивности света: Это согласуется с тем, .что в листьях растений салата, выращенных при 0.5 Вт м 2, потеря Хл была выше, чему выращенных на свету 1 или 10 Вт м"2. .
УФ-облучение приводило к снижению содержания УФ-поглощающих пигментов; преимущественно флавоноидов, (далее флавоноиды, Lingakumar, Kulandaivelu, 1993) сразу после облучения, как в листьях салата, так и шпината (табл. 10, 11). Через 24 ч содержание в зависимости от дозы, могло быть как ниже, так и выше контрольного уровня. Однако в любом случае, при предоблучении КС этот уровень был промежуточным между контролем и вариантом УФ облучения, то есть КС облучение частично снимало ингибирующий эффект УФ или усиливало стимулирующий эффект последнего. КС, сам по себе, индуцировал небольшое увеличение уровня флавоноидов, которое возрастало в листьях салата через сутки после 8 мин облучения на 5±2% (п=4). По-видимому, сразу после облучения уровень УФ-поглощающих пигментов снижается из-за деградации части пигментов под действием УФ, а стимулирующий эффект этих облучений (УФ и КС) сказывается, вероятно, на синтезе этих пигментов. Судя по литературным данным, вероятно, УФ и КС регулируют активность ключевых ферментов фенил-пропаноидного пути: ФАЛ и халкон-синтазы (Jenkins, 1997; Wide et а, 2001).
Известно, что кратковременное облучение растений монохроматическим низкоэнергетическим светом с максимумом 660 нм переводит фоторецептор- фитохром в форму, которая физиологически активна (Kendrick, Kronenberg, 1994; Креславский и Аллахвердиев, 2006). И, наоборот, в растениях, облученных монохроматическим светом с максимумом 730 нм, фитохром переходит обратно в неактивную форму. Это классические фитохром- зависимые низкоэнергетические реакции с обратимостью эффектов облучения КС последующим ДКС (Музафаров и др., 1995; Креславский, Аллахвердиев, 2006). Мы показали наличие аналогичных закономерностей по влиянию- предоблучения- КС-ДКС на содержание хлорофилла (а+в) и каротиноидов (табл. 10; 11). Было обнаружено обращение влияния кратковременного- низкоэнергетического KG с Хм=660 нм, снижающего потерю- Хл при- УФ облучении, при облучении листьев- последующим ДКС с Ям=730. нм: Это является решающим доказательством в пользу фитохромной гипотезы, то. есть участия Фдк как медиатора действия КС на содержание-хлорофилла. Можно предположить, что КС в комбинации с УФ заметно модифицирует эффект последнего в ростовых и фотоморфогенетических реакциях. В результате при наличии УФ компоненты, КС действует как регулятор УФ-индуцированных реакций роста и накопления хлорофилла. Такое предположение было высказано в нашей работе (Kobzar et ah, 1998) и в других работах (Bossalandro et ah, 2001). Возможно, что такая регуляция эффектов УФ-радиации за счет изменения,доли активной формы фитохрома происходит в природе. Когда велика доля УФ радиации, то есть в полдень и в солнечный день, тогда отношение КС-ДКС высокое (Музафаров и др., 1995) и компенсация ингибирующего эффекта УФ за счет активации фитохрома, по-видимому, достаточно- велика. Вместе с тем в потоке солнечного света попадающего в листовую тень отношение КС к ДКС падает с 1.1 до 0.2-0.7 (Музафаров и др., 1995), но тогда УФ мало и компенсация, вероятно, не нужна.
В принципе влиять на рост может как изменение гормонально-ингибиторного баланса, так и фотосинтеза и дыхания. Однако облучение КС в данном случае оказывает небольшое ингибирующее действие на активность ФС2 (данные не показаны). Мы предположили, что эффект снятия ингибирующего действия УФ-В на рост гипокотилей может быть объяснен изменением содержания гормонов в листе, которое вызвано облучением КС. Действительно, опыты с экзогенно использованным фитогормоном - гибберелловой кислотой (GA3, рис. 30) согласуются с этим предположением.
Кросс-устойчивость, индуцированная тепловым стрессом
Мы предположили, что ФА, предобработанных нагреванием при 40С (20 мин) растений обладает повышенной устойчивостью не только к тепловому стрессу, но и к свету высокой интенсивности (перекрестная адаптация). Действительно, после предобработки при 40С (20 мин) ФА растений был более устойчив не только к высокой температуре (44С, 20 мин) (рис. 55, 56), что согласуется с литературными данными (Yordanov et al., 1993; Шаркова, 2001), но и к фотоингибированию (рис. 63). При этом первичная устойчивость ФА менялась мало, тогда как свето-зависимое восстановление ФА заметно ускорялось именно в предобработанных при 40С растениях, но не при 42С.
Повышенная скорость восстановления при повторном тепловом стрессе может объясняться как ускоренной репарацией ФС2 и системы фиксации С02, так и накоплением белков теплового шока уже после первичного прогревания растений. Усиленное образование Н202, обнаруженное нами в процессе постстрессового восстановления фотосинтетической активности растений, вероятно, стимулирует образование низкомолекулярных БТШ. Этот факт стимуляции синтеза БТШ при повышенном образовании Н202 известен из литературы (Konigshofer et al., 2008). БТШ стимулируют восстановление фотосинтеза при тепловом стрессе (Allakhverdiev et al., 2008) и логично предположить их участие в восстановлении активности ФА. Хотя небольшое время теплового шока (20 мин) ограничивает возможность их образования в результате теплового стресса, тем не менее, существуют ряд БТШ, которые образуются достаточно быстро (Титов и др., 2006). Кроме того, вклад в формирование повышенной устойчивости ФА закаленных растений могут вносить более высокие скорости фотосинтеза и циклического фотофосфорилирования, обнаруженные после первичного прогревания растений (рис. 54, 60). По-видимому, для формирования повышенной теплоустойчивости также важны ионы кальция. Выдерживание проростков пшеницы 24-48 ч в присутствии 50 мМ СаС12 приводило к повышению устойчивости проростков к нагреванию при 41.5С (20 мин) (Рис. 59). Определенный вклад в формирование повышенной стресс-устойчивости также может вносить более высокий антиоксидантный потенциал, так как мы наблюдали повышенную активность АсП, которая быстро проявлялась в листьях после прогревания при 40С именно в случае закаленных растений (рис. 64).
Другой важный результат, который следует из наших экспериментов, это ключевая роль более высокой скорости восстановления ФА, прежде всего ФС2, в закаленных растениях в механизме повышенной устойчивости ФА к вторичному тепловому шоку и термо-индуцированному фотоингибированию. Поясним этот момент. При исследовании механизма эффекта закаливания мы разделили эффект действия предшествующей тепловой обработки на первичную устойчивость к тепловому шоку и на длительное свето-зависимое восстановление ФА. Первичная теплоустойчивость мало зависит от предшествующего прогревания, тогда как восстановление наблюдается только после тепловой закалки и на свету, и не происходит в темноте и в присутствии хлорамфеникола или линкомицина (Kreslavski et al, 2008) (рис. 65). Аналогичная картина наблюдалась и при нагревании нативных растений пшеницы выращенных из ССС-обработанных семян. В присутствии 1 мМ линкомицина мы не наблюдали эффект предобработки ССС, тогда как в отсутствии ингибитора белкового синтеза а ССС предобработка приводила к увеличению скорости восстановления после прогрева (рис. 65). Вероятно, действие ССС направлено, скорее, на улучшенное восстановление ФС2, чем на защиту ФС2 от повреждения. Это согласуется с данными работ по защитному действию осмолитика бетаина от NaCl-индуцированного фотоингибирования в цианобактериях (Onishi, Murata, 2006). Заметим, что бетаин - это продукт трансформации в растениях холинсодержащих соединений (Cheng et al., 2006).
Мы также показали, что ФА закаленных кратковременным прогреванием растений более устойчив к фотострессу, который сопровождается ингибированием ФС2, которое оценивалось с помощью параметров замедленной флуоресценции, характеризующей эффективность обратных процессов рекомбинации индуцированных зарядов в РЦ ФС2 (Bigler, Schreiber, 1990; Веселовский, Веселова, 1990; Goltsev et al., 2005, Li et al., 2007). Полученный результат не согласуется с обнаруженным в работах Буболо и др. (2004) и Кислюк и др. (2004) повышением термоустойчивости ФА листьев пшеницы, оцененной по скорости фиксации С02. Тепловое закаливание растений при 38-39С в течение 3 ч приводило к повышению устойчивости к прогреву при 42С, как в темноте, так и на свету, но не было повышения устойчивости к фотоингибирование в отсутствии повреждающей температуры. Возможно, отсутствие повышенной устойчивости к свету высокой интенсивности в закаленных тепловым стрессом растениях связано с использованием сильного света, так как авторы не наблюдали обратимости при фотоингибировании, тогда как в наших условиях был достаточно слабый фотостресс, который быстро снимался со временем (рис. 63). Аналогичный эффект был показан на отделенных листьях пшеницы (Шаркова, 2001). Авторы не наблюдали повышенной устойчивости к фотоинактивации электронного транспорта хлоропластов, выделенных из листьев, предобработанных при 40G. Однако они обнаружили повышение устойчивости к комбинированному действию света и температуры. Возможно, отсутствие повышенной устойчивости к фотоингибированию- при комнатной- температуре- связано с использованием в этих опытах отделенных листьев, а не нативных растений, как в нашем случае, что может в определенной степени- влиять на механизм перекрестной адаптации.
