Содержание к диссертации
I. Введение 5
Список сокращений 8
II. Обзор литературы 9
Механизмы холодостойкости 9
Современные концепции повреждающего действия холода 14
Окислительный стресс и антиоксидантная система 18
Трансгенные растения как объект исследования 31
III. Объекты и методы исследования 37
Объекты исследования 37
Культивирование растений 37
Измерение скорости генерации супероксидного аниона 39
Определение содержания перекиси водорода 39
Определение интенсивности перекисного окисления липидов 40
Определение активности супероксиддисмутазы 41
Определение активности каталазы 41
Определение активности гваякол пероксидазы 42
Определение содержания различных форм Сахаров (в тканях листьев растений) 43
определение содержания глюкозы 43
определение сахарозы и фруктозы 44
3.10. Определение интенсивности фотосинтеза 45
чистая продуктивность фотосинтеза 45
определение интенсивности фотосинтеза и дыхания по скорости СОг-газообмена 45
3.11. Модельная система 46
Накопление МДА при действии реактива Фентон 46
Скорость генерации супероксидного аниона при действии реактива Фентон 47
3.12. Определение устойчивости по выходу электролитов 47
Измерение функциональной активности элементов ЭТЦ хлоропла-стов 48
Определение активности различных форм инвертаз 49
Измерение скорости роста 49
Метод электромикроскопического и морфометрического исследования ультраструктуры хлоропластов 50
3.17. Статистическая обработка данных 51
Приборы и реактивы 51
IV. Результаты и обсуждение 53
4.1. Характеристика объекта исследования 53
Активность инвертаз 52
Содержание внутриклеточных Сахаров 54
Скорость роста 56
Интенсивность фотосинтеза и дыхания 58 4.1.5 Ультраструктура хлоропластов 59
4.2. Определение относительной устойчивости контрольных и ВЗЗ-
inv растений к низкой температуре 60
Влияние гипотермии на проницаемость клеточных мембран контрольных и ВЗЗ-inv растений 61
Влияние гипотермии на интенсивность перекисного окисления липидов в листьях контрольных и ВЗЗ-inv растений 62
4.3. Развитие окислительного стресса в растениях картофеля при
действии гипотермии 68
Влияние гипотермии на интенсивность перекисного окисления липидов 68
Влияние гипотермии на скорость образования супероксидного аниона 70
Влияние гипотермии на содержание Н>2 71
>
4.4. Активности ферментов антиоксидантной системы исследуе
мых генотипов при гипотермии 73
Активность супероксид дисмутазы 73
Активность каталазы 77
Активность пероксидазы гваякола 78
4.5. Влияние углеводного питания на антиоксидантную систему
контрольных и ВЗЗ-inv растений 80
4.5.1. Содержание растворимых внутриклеточных углеводов
при различной концентрации сахарозы в питательной среде 81
Скорость роста контрольных и ВЗЗ-inv растений на средах с 0%, 2% и 4% сахарозы при 22С 82
Функциональная активность ЭТЦ хлоропластов 85
Влияние углеводного питания на скорость генерации супероксидного аниона 91
Влияние углеводного питания на интенсивность ПОЛ 92
Влияние углеводного питания на активность супероксид дисмутазы в листьях контрольных и ВЗЗ-inv растений 93
Влияние углеводного питания на активность каталазы в листьях контрольных и ВЗЗ-inv растений 94
4.6. Влияние Сахаров, накопленных под действием адаптирующих
температур, на антиоксидантную систему контрольных и ВЗЗ-inv рас
тений 95
4.6.1. Изменения содержания внутриклеточных Сахаров при
адаптации 96
Интенсивность С02-газоо6мена при пониженных положительных температурах 97
Влияние адаптирующих температур на ультраструктуру хлоропластов 98
Динамика интенсивности ПОЛ при адаптации 101
Влияние адаптирующих температур на активность супероксид ди ему тазы 102
Влияние адаптирующих температур на активность ка-талазы 103
4.7. Моделирование окислительного стресса 104
Применение модельной системы Фентон для сравнения устойчивости к окислительному стрессу 104
Изменение содержания растворимых внутриклеточных Сахаров при краткосрочном охлаждении 106
Заключение 109
Выводы 111
Список литературы 113
VII. Список публикаций 127
/
Введение к работе
Действуя на растительный организм, неблагоприятные факторы среды вызывают в нем разнообразные ответные реакции. Многие из них, к которым растение эволюционно не приспособлено, могут оказывать стрессовое воздействие на организм, приводящее к различным физико-химическим аномалиям, повреждению их структур и метаболических функций [Левитт, 1983]. К одним из наиболее значимых факторов, определяющих географическое распространение и продуктивность растений, относится температура [Туманов, 1979; Дроздов и др., 1964; Sakai, Larcher, 1987].
Действие низких температур, вымерзание посевов и насаждений наносят сельскому хозяйству большой ущерб, что усугубляется снижением урожайности тех растений, которые выживают. Пшеница, кукуруза, рис, картофель и соя - пять самых употребляемых человеком в пищу растений. Все они подвергаются воздействию пониженных температур различной длительности, причем из них только пшеница обладает относительно высокой степенью устойчивости к низким температурам [Levitt, 1980; Сандухадзе и др., 2003]. В силу этого внимание ученых все больше концентрируется на изучении механизмов толерантности и адаптации высших растений к гипотермии.
На основании ряда исследований выдвинуто несколько теорий, объясняющих механизм повреждений от мороза, а также устойчивость и адаптацию некоторых видов к отрицательным температурам [Levitt, 1980; Lyons, 1973; Туманов, 1979], тогда как устойчивость группы холодостойких растений к низким положительным температурам изучена гораздо меньше [Дроздов и др., 1984]. По этой причине исследованиям физиологических и молекулярных основ холодостойкости следует уделить больше внимания. Существует также потребность в точной оценке адаптивного потенциала этих растений, которая невозможна без изучения их устойчивости и повреждений при стрессовых воздействиях окружающей среды.
Общий адаптационный синдром, чаще называемый как стресс, представляет собой комплекс ответных реакций организма на внешние воздействия, по силе превосходящие обычные физиологические и при длительном воздействии заканчивающиеся развитием патологий [Селье, 1972]. Представления о действии на клетки низких температур и морозов значительно изменились и расширились в связи с установлением взаимосвязей между различными видами стресса и выделения группы неспецифических реакций. Одной из таких общих ответных реакций на понижение температуры, является накопление защитных веществ, в частности, растворимых углеводов [Туманов, 1979].
Углеводный метаболизм и функции Сахаров были изучены практически только на морозостойких растениях, для которых характерно накопление больших количеств Сахаров (до 50% от сухой массы), что необходимо для противодействия морозу, а не низким положительным температурам [Levitt, 1980]. Применительно к теплолюбивым и холодостойким растениям при низкотемпературном стрессе в основном рассматривалась роль липидов, тогда как у последних, в том числе типичного представителя - картофеля, в период адаптации тоже происходит увеличение содержания Сахаров, но в гораздо меньшей степени [Дерябин и др., 2003].
К неспецифическим реакциям относится также обусловленный накоплением активных форм кислорода (АФК) окислительный стресс, который зафиксирован как один из самых ранних эффектов охлаждения [Scandalios, 1993]. Он развивается у холодостойких растений сильнее, чем у морозоустойчивых, и в ряде случаев служит причиной повреждения растений [Мерзляк, 1989; Лукаткин, 2002, а]. Для защиты от этого стресса в растениях существует антиоксидантная система, состоящая из ферментов (супероксиддисмутаз, каталазы, пероксидаз и др.) и низкомолекулярных антиоксидантов (аскорбата, глютатиона, каротиноидов, флавинов и др.). Однако, способностью к нейтрализации АФК, характерной для низкомолекулярных антиоксидантов, обладает ряд выполняющих и другие функции веществ: полиамины [Кузнецов и др. 2006], стероиды [Кузьменко и др., 1997], полиспирты [Duncan, Widholm, 1991]. Имеются данные, полученные в модельных опытах, о
способности растворимых углеводов к перехвату АФК [Аверьянов, Лапикова, 1989]. Тем не менее, особенности окислительного стресса и антиоксидантной системы при гипотермии у холодостойких растений, в отличие от теплолюбивых, изучены недостаточно. Роль растворимых Сахаров в связи с окислительным стрессом почти не рассматривалась, чему, возможно, в числе прочих причин, препятствовало многообразие их функций в живых клетках.
В связи с выше изложенным, целью нашей работы было изучить особенности окислительного стресса, вызванного гипотермией, и роль Сахаров в системе антиоксидантной защиты на примере типичного представителя группы холодостойких растений - картофеля, с углеводным метаболизмом, измененным вследствие экспрессии гена инвертазы дрожжей. В задачи работы входили: подтверждение экспрессии введенного гена инвертазы дрожжей,, сравнительная оценка ранних физиологических реакций растений картофеля на действие низкой температуры, оценка интенсивности окислительного стресса и эффективности антиоксидантной системы исследуемых генотипов, выявление роли Сахаров в противодействии окислительному стрессу. Решению этих задач может способствовать использование трансформированных растений с измененным углеводным метаболизмом [Sonnewald et al., 1997].
