Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 7
1.1 Молекулярные механизмы устойчивости к стрессовым факторам 7
1.2 Некоторые вопросы клеточной селекции на устойчивость к срессовому фактору 14
1.3 Клеточная селекция к температурному фактору in vitro 20
1.4 Биохимическая адаптация растений к стрессам 22
Глава 2.Экспериментальная часть. Материалы и методы 27
Глава 3. Результаты исследований 32
3.1 Получение линий картофеля, устойчивых к высокой температуре 32
3.2 Водный режим растений картофеля, полученных методом культуры тканей 45
3.3 Устойчивость растений к засухе 48
3.4 Жароустойчивость растений 51
3.5 Морфология культуры тканей 52
3.6 Содержание хлорофиллов 54
3.7 Содержание свободного пролина в условиях водного стресса 58
3.8 Удельная поверхностная плотность листьев (УППЛ) 64
3.9 Развитие и продуктивность температуроустойчивых растений и исходных форм в полевых условиях 66
Заключение 70
Выводы 79
Литература 82
- Некоторые вопросы клеточной селекции на устойчивость к срессовому фактору
- Биохимическая адаптация растений к стрессам
- Водный режим растений картофеля, полученных методом культуры тканей
- Содержание свободного пролина в условиях водного стресса
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы для подъема сельскохозяйственного производства картофеля все больше используются нетрадиционные технологии, такие как генная и клеточная биотехнология. В биотехнологии растений особую роль играет клеточная селекция, при которой отбор клеточных линий и растений с новыми хозяйственно-ценными свойствами проводится на уровне культивируемых in vitro клеток.
Получение таким путем растений из отработанных в селективных условиях каллусных клеток возможно благодаря уникальному свойству растительной клетки - ее тотипотентности. Приемы культивирования растительных клеток и регенерации из них растений разработаны для многих сельскохозяйственных культур и они позволяют реализовать возможности клеточной селекции для создания новых сортов растений (Tall, 1983; Dix, 1986; Сидоров, 1990; Носов, 1999). Мощным источником генетического разнообразия растений является сомаклональная изменчивость, возникающая при прохождении растениями стадии неорганизованного роста, и/или при длительном культивировании в условиях in vitro (Носов, 1999; Высоцкая, 2003).
Вместе с тем в селекции растений in vitro следует реально учитывать и ограничения клеточной технологии. Несмотря на большое количество работ методы целенаправленного улучшения хозяйственно-ценных признаков растений in vitro на основе технологии клеточной селекции все же остаются еще несовершенными. До настоящего времени использование клеточной технологии для получения клеточной линии и растений-регенерантов, резистентных к высокому температурному фактору, остается нерешенным, что и определяет актуальность проведения таких исследований. Получение устойчивых к высокой температуре растений с помощью клеточной технологии имеет для Таджикистана особую практическую значимость, т. к. у многих культурных растений, выращиваемых в Таджикистане (хлопчатник, картофель, овощные культуры), период накопления урожая приходится на
самый жаркий период, что является одним из факторов снижения урожайности и качества продукции (Алиев и др., 1997). Эта задача должна решиться в том числе за счет умелого использования достижений современной биотехнологии и природно-климатических факторов Таджикистана.
При равных условиях возделывания, для получения высокого урожая картофеля, так и других культур, наиболее значимы особенности сортов и качество семенного материала, определяемые системой семеноводства и методами получения семенного материала (Муминджанов, 2003; Каримов и др., 2004; Давлятназарова и др., 2004).
К сожалению, имеющиеся в производстве сорта не всегда отвечают запросам картофелеводства из-за неустойчивости к болезням и воздействию стрессовых природных факторов горных регионов республики. Поэтому создание форм, линий, сортов картофеля как методами традиционной селекции, так и современной биотехнологии (клеточной селекции, генной инженерии), адаптированных для каждой зоны, в будущем имеет большую перспективу.
Цель и задачи работы: Получение клеточной линии картофеля, устойчивой к природным стрессовым воздействиям (высокой температуре, водному дефициту и т. д.), а также возможности регенерирования из них фертильных растений методами современной биотехнологии и использование их как модель изучения физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений к стрессу. В связи с поставленной целью в задачу исследования входило:
Подбор оптимальных условий культивирования;
Подбор культуральной среды, типа экспланта и оптимальных условий
культивирования картофеля in vitro;
Изучение особенностей морфогенеза каллусных клеток при действии
высокой температуры;
Подбор усолвий селективного отбора клеток и регенерантов, устойчивых к действию высокой температуры;
Изучение некоторых морфо-физиологических параметров температуроустойчивых растений-регенерантов при действии высокой температуры;
Изучение некоторых биохимических особенностей температуроустойчивых растений-регенерантов (ТУ-регенеранты) при действии засухи (водного дефицита).
Научная новизна. Проведен скрининг морфофизиологической характеристики компетенции в культуре in vitro растений картофеля сорта Жуковский ранний. Получен ряд линий, различающихся по некоторым физиологическим признакам и продуктивности.
При воздействии высокой температуры (41 С, 45С и 47С) на культивируемые каллусные ткани картофеля отобраны устойчивые линии. Полученные от них растения отличались по некоторым морфологическим признакам от исходного варианта. Стабильными оказались изменения, вызванные действием более высокой температуры - 47С, тогда как у самоклональных, при меньшей температуре 41 С, они со временем терялись. Отселектированный признак (повышенная резистентность к 47С) сохранялся на протяжении 8 лет испытания в полевых условиях, а также in vitro. Полученные резистентные линии существенно отличались друг от друга по структуре урожая. Показано, что адаптированные к температурному стрессу регенераты картофеля, полученные в результате клеточной селекции, характеризуются более высоким содержанием свободного пролина по сравнению контрольными растениями, и это можно использовать как тест -признак при оценке уровня устойчивости генотипов картофеля к температурному стрессу и другим природным неблагоприятным факторам.
Практическая ценность диссертации. Отработана система каллусогенеза и регенерации картофеля, что позволило оптимизировать процесс регенерации в стрессовых условиях in vitro. Важным результатом
работы является выделение регенерантов, устойчивых к высокой температуре и водному дефициту (засухе). Эти свойства можно использовать для расширения генетического базиса селекции как донора генов устойчивости к стрессу, а также для решения прикладных задач в научных целях как модель физиологической, молекулярно-генетической и прикладной биотехнологии.
Апробация диссертации. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научно-практических конференциях: первой республиканской конференции "Экология и здоровье," 2001; конференции "Молодые ученые и современная наука", 2001; 2002; конференция "Вопросы сохранения и рационального использования растительного разнообразия Таджикистана", 2002; научно-педагогической конференции Таджикского государственного национального Университета 2002-2005 г.
Некоторые вопросы клеточной селекции на устойчивость к срессовому фактору
Устойчивость растений к стрессовым факторам внешней среды является предметом интенсивного изучения физиологов, биохимиков, генетиков и привлекает все большее внимание клеточных и молекулярных биологов. Особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение экспрессии генов при внешнем стрессе, стресс-индуцируемых белков и кодирующих их генов, что уже сейчас позволяет конструировать растения, более устойчивые к условиям внешней среды. Одним из главных ограничений применения клеточной селекции для улучшения культурных растений, в частности, повышения стойкости к стрессам, пока еще остается низкий уровень знаний о клеточных и молекулярно-генетических основах устойчивости. Несмотря на эти недостатки и некоторые ограничения метода клеточной селекции, данный подход в селекции на выносливость к отдельным стрессам в настоящее время рассматривается как биотехнологическая альтернатива традиционных селекционно-генетических приемов.
Все большее внимание уделяется селекции сельскохозяйственных культур, более выносливых (толерантных) к засолению. Наличие генетического контроля толерантности растений к солям является общепринятым. В общем, солеустойчивость рассматривают как полигенный признак (Abel, 1969).
С развитием биотехнологии растений потенциально возможным является получение солевыносливых генотипов у важных сельскохозяйственных культур путем селекции на уровне соматических клеток, слияния протопласта или переноса генов при использовании техники рекомбинантных молекул ДНК (Сидоров, 1990).
Солевой стресс обязательно сопровождается осмотическим стрессом и ведет к утрате клеткой тургора (для поддержания соответствующего количества воды, водный потенциал внутри растения должен быть отрицательным, по сравнению с таковым окружающей среды). Для изучения токсического влияния соли и клеточных механизмов толерантности, было предложено использовать клеточные культуры (Бабаева и др., 1968; Кулаева и др., 1975). Таким образом, клеточные механизмы выносливости к засолению являются сходными для культивируемых in vitro клеток и целых растений и, что селекция на клеточном уровне представляет реальную перспективу получения устойчивых к засолению форм растений. Большинство селекционных программ направлены на выделение in vitro клеточных линий, толерантных к присутствию в среде культивирования клеток хлорида натрия.
В большинстве случаев, отобранные клеточные культуры в присутствии соли росли хуже, чем на обычной среде. Некоторые солевыносливые линии, например, люцерны (Crougham et al., 1978), риса (Nabors et al., 1980), обладали свойствами галофитов, и оптимум роста у них отмечался при наличии в среде хлорида натрия.
Генетическая природа выносливости растений к солям, отобранных через культуру клеток, остается пока неясной (Nabors et al., 1980). Наиболее подробный анализ солевыносливых линий табака проведен группой Р. Брессан (Bressan et al., 1985; Hasegawa Mori, 1986). Ими показано, что при селекции к умеренным концентрациям хлорида натрия (0.17 М), обнаруживается феномен обратимой адаптации. Причиной нестабильной обратимой адаптации клеток к NaCl, очевидно, является физиологическая адаптация, обусловленная изменением экспрессии генов. Подробно об этих изменениях при различных стрессах изложено в обзоре М. Сакса и Т. Хо (Sachs, Но, 1986). Повышенная толерантность к соли обнаружена у клеточных линий моркови, отобранных на среде, содержащей в качестве неутилизируемого осмотика в высокой концентрации маннитол (Harms, Oertli, 1985). Из этих результатов следует, что адаптация клеток к осмотическому стрессу применима для отбора солевыносливых вариантов, а исследования подобного рода представляют интерес для изучения стрессовых эффектов различных компонентов засоления как во взаимодействии, так и независимо друг от друга.
Одним из стрессовых факторов внешней среды, существенно ограничивающих увеличение продуктивность растений, является наличие в почве токсических концентраций алюминия. Стрессовое состояние у растений может быть индуцированно ионами таких тяжелых металлов как цинк, кадмий, медь, ртуть; они также довольно часто встречаются и в почвах. Широкое распространение в природе перечисленных элементов, которые являются токсичными для растений и человека, определяет практическую значимость селекции на устойчивость к данным элементам. Существование в природе большого разнообразия растений, различающихся по устойчивости к ионному стрессу, позволяет производить отбор толерантных форм, оценить природу устойчивости и использовать нужные генотипические варианты .в селекции. Факт генетического контроля устойчивости к ионному стрессу был установлен во многих случаях (Epsthein, 1972). Доказано, что устойчивость/толерантность к некоторым токсическим ионам, например Al , Zn , может быть простым доминантным признаком (Dean et al., 1978; Devine, 1982; Gilissen, Staveren, 1986). Устойчивость к ионному стрессу у растений прежде всего обусловлена наличием клеточных механизмов устойчивости.
Работы по клеточной селекции растений на устойчивость к ионным стрессам начаты недавно. Во всех экспериментах был использован метод прямой селекции, при котором в качестве селективного агента применяли токсические концентрации солей. Однако, создание стрессовых селективных условий in vitro, идентичных таковым в природе, крайне затруднительно. В природных условиях, помимо токсического действия ионов, накладываются другие факторы, в частности, наличие различных метаболитов и кислые значения рН среды. Для селекции на клеточном уровне были предложены среды, которые хотя не полностью соответствовали естественным стрессовым условиям, все же обеспечивали экспрессию признака устойчивости и давали возможность отбирать нужные варианты.
Биохимическая адаптация растений к стрессам
В естественных условиях на растение воздействуют многочисленные стрессовые факторы сопровождающиеся изменением клеточного метаболизма, направлениея ростовых и репродуктивных процессов. Поддержание оптимального клеточного физиологического гомеостаза и интактной структуры макромолекулы при стрессе является одним из необходимых условий выживания растений. На клеточном уровне метаболизм растений направлен таким образом, чтобы предотвратить повреждающее действие стрессовых факторов. Установлено, что это достигается за счет реализации двух путей внутриклеточной адаптации растений к экстремальным факторам среды (Кузнецов, Шевякова, 1999). 1. Индукция синтеза отсутствовавших ранее макромолекул с новыми свойствами, обеспечивающих "нормальное" протекание клеточного метаболизма при стрессе. 2. Оптимизация внутриклеточной среды функционирования ферментных систем за счет аккумуляции низкомолекулярных органических соединений, обладающих протекторными и (или) осморегуляторными свойствами (Хочачка, Сомеро, 1977). Эти пути обычно существуют одновременно или последовательно и направлены на обеспечение организма энергией, восстановителями, предшественниками нуклеиновых кислот и белков, а также на поддержание функционирования клеточных регуляторных систем в условиях стресса. Адаптационные механизмы условий делят на две стадии: стресс-реакцию и специализированную (Кузнецов и др., 1987;. Кузнецов, 1992). На первой стадии происходит мобилизация или формирование защитных систем, обеспечивающих кратковременное выживание организма в условиях стресса. На второй стадии имеет место формирование специализированных адаптационных механизмов, ответственных за протекание онтогенеза в условиях длительного воздействия стресса (Кузнецов и др., 1987; Кузнецов, 1992). В основе формирования адаптационного процесса лежит дифференцирование экспрессии генов, проявление которой зависит от длительности воздействия стресса, а также от онтогенетического состояния растений. Возможно, в таких условиях (при засухе, водном дефиците, высокой температуре) активно экспрессируются гены водного дефицита, которые кодируют белки, обладающие функциями молекулярных шаперонов, протеаз, ингибиторов протеаз (Шапигузов, 2004). Кроме того, в ходе адаптационного процесса, как к кратковременному, так и к длительному действию водного дефицита, высоких температур и других факторов, происходит аккумуляция низкомолекулярных органических соединений, таких как аминокислоты, сахара, сахаро-спирты, бетаин и других (Yencey et al., 1984; Шевякова и др., 1994). Среди аминокислот, особое место занимает метаболизм пролина, при стрессовых воздействиях на растение. В последние годы, многие работы акцентированы на физиологических аспектах защитного действия пролинов. Пролин в составе белков является обязательным компонентом растительной клетки. Содержание свободного пролина в десятки, а иногда и в сотни раз возрастает в условиях засухи, засоления и действия температур (Cavalieri, 1979; Шевякова, 1983; Delauney et al., 1993; Huang,). Как показано в обзоре Л.В. Кузнецова и Н.И. Шевяковой (1999), свободный пролин при стрессе обладает полифункциональным биологическим эффектом, проявляющимся в осморегуляторной и протекторной функциях, а также в антиоксидантной энергетической функциях, обеспечивающих поддержание клеточного гомеостаза и его переход в новое адаптационное состояние. Считают, что свободный пролин в высоких концентрациях, в условиях водного дефицита приводит к повышению осмотического давления клеточного сока и сопровождается увеличением устойчивости растений на фоне снижения водного потенциала почвенного раствора (Huang, Cavalieri, 1979; Пустовойтова, 1981), т. е. при низком водном потенциале происходит повышение концентрации осмолитов для поддержания водопоглощающей функции в условиях стресса. В этом и заключается осморегуляторная роль свободного пролина при воздействии стресса. При этом важно отметить, что пролин аккумулируется главным образом в цитоплазме. Его доля в цитоплазме составляет в среднем 5-Ю % от общего клеточного содержания (Flowers et al., 1977). Такое количество пролина в цитоплазме достаточно, чтобы обеспечить 10-20-кратное увеличение осмотического потенциала клетки.
Помимо осморегуляторного, свободный пролин обладает стресспротекторным (защитным) эффектом, который проявляется в его способности взаимодействовать с белками, и приводит к сохранению их пространственной структуры и биологической активности, благодаря стабилизации интактной гидратационной сферы белков.
Поскольку пролин хорошо растворим в воде, обладая при этом гидрофильной и гидрофобной частью, он имеет способность образовывать агрегаты. По этой причине пролин связывается с поверхностными гидрофобными остатками клеточных белков с образованием макромолекулярных агрегатов. Образовавшиеся полимеры ведут себя как гидрофильные коллоиды, способствующие стабилизации функции белков при стрессе.
В ряде работ (Шевякова, 1983; Кузнецов, 1992; Taylor, 1996; Жолкевич и др., 1997; Kuznetsov, Shevyakova, 1997) показано, что в условиях одномоментного действия нескольких факторов, роль пролина, как одного из компонентов клеточных защитных систем, резко возрастает, поскольку именно в стадии стресс-реакции преимущественно приурочено функционирование неспециализированных систем устойчивости. В доказательство этой точки зрения приводятся данные о временном изменении динамики аккумуляции пролина на фоне совместного действия различных стресс-факторов (Шевякова, 1983; Жолкевич и др., 1997). В работе Шевяковой Н.И. и других (1994) было показано, что в солеустойчивых клетках табака в условиях засоления, аккумуляция пролина наблюдалась не только на стадии стресс-реакции, но и на этапе специализированной адаптации. Вместе с тем, необходимо отметить, что при совместном действии высокой температуры и засоления аккумуляция пролина носила кратковременный характер и наблюдалась лишь на стадии первичной (стрессорной) реакции, но не на этапе специализированной адаптации. Этот вывод получен в дальнейшей работе Кузнецова В.В. и других (1987). Существенно также, что предварительный кратковременный тепловой шок стимулировал способность растений аккумулировать пролины в процессе последующей почвенной засухи и засоления, что сопровождалось увеличением устойчивости к температурному и водному (дефициту) фактору (Жолкевич и др., 1997; Kuznetsov, et al., 1998).
Таким образом, выше перечисленные экспериментальные результаты позволяют высказать мысль о том, что стресс-индуцируемый пролин можно рассматривать в качестве одного из общих компонентов устойчивости растений к повреждающему действию факторов различной природы. По этой причине аккумуляция пролина, происходящая под действием стресс-факторов у различных генотипов растений, не потеряла свою актуальность и требует постоянного внимания исследователей с целью поиска доноров устойчивости растений и их использования в селекционных и биотехнологических работах. Вместе с тем, необходимо указать на то, что гены ферментов синтеза пролина уже в течение многих лет используются в качестве потенциальных кандидатов для переноса в неустойчивые формы растений с целью повышения стресс-устойчивости (Le Ruduliero et al., 1984). Первая работа в этом направлении была опубликована в 1995 году (Kishor et al.1995). Они сообщили о переносе гена синтеза пролина П5ЛС из Vigno в табак, где синтез пролина усиливался в 10-18 раз.
Водный режим растений картофеля, полученных методом культуры тканей
В последнее время широкое распространение получил метод размножения картофеля с помощью культивирования различных органов и тканей на искусственных питательных средах (Murashige, Skoog, 1962). По сравнению с традиционными методами размножения, этот метод обладает рядом преимуществ: отбор форм с нужным полезным признаком непосредственно в культуре in vitro; высокий коэффициент размножения; возможность получать растения-регенеранты круглый год независимо от сезона; размножение сортов, плохо размножающихся обычным методом; возможность наследования физиологических параметров независимо от сезонности; возможность изучения параметров продукционного процесса при переходе растения от генеративного питания к автотрофному и так далее.
В данном разделе работы мы изучали некоторые параметры водного режима растений картофеля, полученных методом культуры тканей и растений картофеля при стрессовых воздействиях на них.
В условиях оранжереи были посажены в торфо-почвенной смеси пробирочные растения сорта Жуковский ранний и ТУ-регенеранты из этого сорта формы растений. В этих растениях изучали продуктивность фотосинтеза, водный режим и продуктивность растений.
Исследования проводили после 7-Ю дневной адаптации пробирочных растений в торфо-почвенной смеси. Опыты показали, что по приживаемости между контрольными и клеточно-модифицированными растениями существенные различия не наблюдались (табл. 5).
Высоту стебля и количество листьев учитывали после 50 дней переноса пробирочных растений в торфо-почвенную смесь. Как видно из данных табл. 6, между этими растениями имеются существенные различия по изученным показателям. По этим морфологическим показателям растения, полученные методом клеточной технологии, имеют несколько более низкий рост и меньшее количество листьев, чем у контрольного варианта.
Между этими растениями различия обнаружены по отношению диаметра стебля, окраски стебля и листьев. Растения, полученные методом клеточной технологии, имеют красноватый стебель и листья. Листья этих растений более плотные и опушенные. Учет количества клубней на одно растение, веса клубней велся после 100 дней перевода пробирочных растений в торфо-почвенную смесь в условиях оранжереи. Как видно из табл. 6, по данным показателям между этими растениями (вариантами) отмечены большие различия. Растения, устойчивые к температуре, по сравнению с контрольным вариантом (сорт Жуковский ранний), имеют меньшее количество клубней при пересчете на 100 растений, однако, вес клубней при пересчете на 100 клубней оказался выше. Растения, полученные методом культуры тканей, имели меньше клубней на растении, но при пересчете на 100 клубней общий вес примерно на 1,1 раза оказался больше, чем у контрольного варианта (сорт Жуковский ранний). Таким образом, растения, полученные методом клеточной модификации, существенно отличаются по морфологии растений и имеют также некоторые различия по клубневой продуктивности. В последующих экспериментах мы пытались изучить некоторые параметры водного режима, такие как интенсивность транспирации, водоудерживающая способность листа, количество воды в листьях в зависимости от действия стресса. В качестве стрессового фактора мы использовали водный дефицит.
Выращенные пробирочные растения в почвенно-торфянной культуре Образуют бутоны после 50-55 дней. В этот период исходные (контроль) и измененные путем клеточной технологии (опыт) растения активно образовывали бутоны. На второй день засухи листья начали терять тургор. В дальнейшем почвенная засуха усиливалась и листья начали терять исходное положение. Почво-торфянная смесь подсыхала и к 5-му дню содержание воды в тазиках составляло 23,0-28,5 % (расчет на сухую массу почвы). В контрольных вариантах (исходные и ТУ-регенеранты) уровень влажности в почве поддерживали на уровне 75-78 % путем постоянного полива.
Как видно из представленных данных рис. 8, в условиях достаточного водообеспечения, исходные и модифицированные растения почти не отличались по содержанию воды в листьях. По мере создания почвенной засухи (45-50% от ППВ) листья модифицированных растений теряли гораздо меньше воды на протяжении эксперимента, то есть на 3, 4 и 5-е сутки создаваемой засухи. Оводненность листьев модифицированных растений превышала на 23 % (расчет на сырую массу) контрольный уровень. Изучение интенсивности транспирации у обоих экспериментальных вариантов растений показало, что в условиях полива наблюдается неодинаковый уровень транспирационной активности (рис.9).
Содержание свободного пролина в условиях водного стресса
Необходимо констатировать факт о том, что для модифицированных растений картофеля характерно увеличение повышеной жароустойчивости листьев в условиях засухи. Жароустойчивость модифицированных растений значительно возрастает на 5-ые сутки засухи.
Таким образом, полученные результаты опытов демонстрируют, что в процессе прогрессирующей засухи у ТУ-растений картофеля выявляются свойства, обеспечивающие их устойчивость при водном стрессе и перегреве. На протяжении 5 суток засухи оводненность, водоудерживающая способность и жароустойчивость у клеточно-модифицированных растений были выше, чем у контрольного варианта, что указывает также на их высокие адаптационные способности к неблагоприятным условиям. В этих условиях, очевидно, ТУ-растения накапливали меньше АБК и больше протекторных метаболитов, таких как свободный пролин. Так, в ряде работ продемонстрировано, что потеря тургора листьями табака ведет к повышению уровня АБК в листьях и, следовательно, к потере засухоустойчивости (Пустовойтова и др., 2000). В связи с этим, нами было изучено накопление свободного пролина при возрастающей засухе в обоих вариантах опыта (контрольные растения и ТУ-растения-регенеранты).
В вытяжках из листьев исходной формы и ТУ-растений-регенерантов картофеля определено содержание свободного пролина. Как видно из данных рис. 13, содержание пролина в условиях нормальной оводненности листа и влажности почвы, в листьях модифицированных и контрольных растений почти одинаково. При увеличении дефицита влаги в почве и глубокой засухе (5 суток засухи) содержание свободного пролина в листьях модифицированных растений резко повышается (почти в 5-7 раз). У контрольных растений имеет место незначительное увеличение свободного пролина (1,4-1,6 раз). Кроме того, необходимо отметить увеличение содержания аланина, глутамина, глутаминовои кислоты и серина у обоих вариантов.
Полученные данные указывают, что в условиях засухи модифицированные растения картофеля, обладали повышенной устойчивостью к засухе. Содержание свободного пролина и других аминокислот в листьях этих растений существенно увеличивалось при действии водного дефицита.
В наших экспериментах обнаружен ряд веществ, присутствие которых, очевидно, необходимо для нормального протекания адаптационной устойчивости растений к стрессу. К ним относятся пролин, органические кислоты, аспарагиновая кислота, глицин и серии, а также в значительном количестве обнаруживается аланин и амиды: глутамин и аспарагин (рис. 14 и 15). При анализе свободных аминокислот у ТУ-растений-регенерантов и у контрольных растений мы акцентировали внимание на изменение только тех аминокислот и амидов, содержание которых существенно различается. На пятые сутки засухи суммарное содержание вышеперечисленных свободных аминокислот и амидов в листьях опытного варианта растений (ТУ-растений) существенно превышает их количество у контрольных растений (табл. 9). При сопоставлении содержания отдельных свободных аминокислот и амидов между исследованными растениями при засухе и в норме, обнаруживалось, что количество пролина превышало в 10-18 раз у модифицированных растений и в 2-3 раза у исходных (контрольных) растений. Количество аланина у модифицированных растений, наоборот, резко снижалось при засухе. Количество глицина и серина у модифицированных растений при засухе практически не изменялось. Некоторые изменения содержания глицина + серина наблюдались при засухе у исходных растений. Количество глютаминовой и аспарагиновой кислот и амидов резко увеличилось при засухе уТУ-регенерантов. У контрольных растений их количество при засухе изменилось незначительно.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при воздействии стрессовых факторов (водный дефицит) клеточно модифицированные растения и исходные формы реагируют неоднозначно. Обнаружены различия в суммарном содержании некоторых свободных аминокислот и амидов у обоих исследованных форм растений картофеля при нормальном водообеспечении. Повышение содержания свободных аминокислот, таких как пролин, глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота и амиды в листьях модифицированных растений, указывают на их существенный вклад в осморегуляции. Роль этих свободных аминокислот в осморегуляции резко возрастает по мере действия засухи, особенно у температуроустойчивых (ТУ-растения-регенеранты) генотипов картофеля. Существенно увеличилось у ТУ-растений-регенерантов содержание пролина, что очевидно способствовало их высокой устойчивости к засухе. Известно, что пролин участвует в осморегуляции (см. обзор). Вместе с тем, он обладает и функцией антиоксиданта, защищает от разрушения макромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты). Видимо по этой причине у модифицированных растений картофеля обнаруживается высокое накопление амидов глютаминовой и аспарагиновой кислоты по сравнению с исходной формой растений. Известно, что глютамин и аспарагин также участвуют в обезвоживании аммиака. Итак, из полученных результатов следует отметить, что в условиях засухи ТУ-растения имеет высокое содержание пролина, глютамина и аспарагина которые способствуют адаптивности водному дефициту и возможно, его геномная перестройка направлена на усиление осморегуляции и других приспособительных реакций организма к стрессовым воздействиям, что может служить модельным объектом в физиолого-биохимических исследованиях.
