Содержание к диссертации
Введение
Глава I. МЕХАНИЗМЫ МАКРО- И МЙКРОЭВДОЦИТОЗА У ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК 14
История открытия и распространения эндоцитоза Типы эндоцитоза и его основные фазы 16
Факторы, влияющие на первую стадию эндоцитоза
Индукторы эндоцитоза 17
Факторы, влияющие на. адсорбцию индукторов на плазматической мембране во время эндо
цитоза *..... 20
Участие сократительных белков в эндоцитозе . . 25 Участие сократительных белков в перераспределении рецепторов на. поверхности мембраны 25 Участие сократительных белков в образовании инвагинаций и вакуолей 26
Влияние ионов кальция на эндоцитоз ...... 29
Зависимость макроэндоцитоза от энергии .... 33
Микроэндоцитоз 36
дальнейшая судьба плазматической мембраны, по глощенной эндоцитозом 37
Глава 2. ПРОБЛЕМА ЭНДОЦИТОЗА У РАСТЕНИЙ
Попытка регистрации эндоцитоза у растительных объектов 38
Вероятные механизмы эндоцитоза, наблюдаемого у корневых клеток 44
Поглощение ионов 44
Поглощение макромолекул 46
Дальнейшая метаболизация материала, поглощенного растительными клетками, в том числе пиноцитозом 49
Глава 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ 55
Замечания к методической части работы 55
Растительные объекты и методы их исследования . . 58
Объекты 58
Методы электронной микроскопии корневых клеток редиса 59
Техника модельных экспериментов (объекты, их получение и методы исследования) 62
Липиды 62
Липосомы 63
Протеиноидные микросферы 63
Световая микроскопия липосом и протеиноидных микросфер 64
Измерение и расчет радиоактивности испытуемых соединений 65
Инфракрасная спектроскопия липидов 66
Ультрафиолетовая спектроскопия липидов .... 67 Статистическая обработка экспериментальных
данных 67
Результаты
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ ЭНДОЦИТОЗА У РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК ... 69
Ультраструктурные доказательства эндоцитозного типа поглощения веществ у растительных клеток . . 69
Локализация маркера уранилацетата в корневых клетках редиса 69
Количественный учет эндоцитозных структур 83
Диагностика эндоцитоза с помощью микроденситометрии мембран 83
Ультраструктура растительных клеток, находящихся в состоянии индуцированного эндоцитоза 88
Эндоцитозная и секреторная активность клеток различных зон корня 95
Влияние 2,4-динитрофенола и /^-меркаптоэтанола на поглощение солей уранила клетками корня редиса 99
Влияние на эндоцитоз уранила 2,4-динитрофенола ... 99 Воздействие на эндоцитозное поглощение уранилацетата tl -меркаптоэтанола 101
Обсуждение НО
Доказательства эндоцитоза у растительных клеток .
Изучение отдельных сторон механизма эндоцитоза у растительных клеток 115
Участие метаболической энергии и роль неметаболических процессов в эндоцитозе у растений 115
Механизм инвагинирования и везикуляции мембраны на стадиях эндоцитоза, не зависимых от метаболической энергии, у растений 120
Выводы 123
Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИША ЭНЕРГОНЕЗАВИСИМОГО ЭВДОЦИТОЗА НА МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ 125
Липосомы 125
Влияние амфотерних и анионных соединений на поведение липосом 125
Влияние положительно заряженных соединений: Белки 126
Лантан, калий и натрий 128
Металлы переменной валентности . 131
Воздействие радиоактивных соединений на липосомы . . 135 Влияние липооксиданта хлорида железа на липосомы из некоторых индивидуальных липидов 137
Влияние метаболических ингибиторов на эндоцитозоподобную реакцию липосом , 140
Влияние липооксиданта и индуктора эндоцито-за - уранилацетата на химическое строение ли-
пидов липосом 141
Протеиноидные микросферы ....
Влияние некоторых индукторов эндоцитоза -липооксидантов на морфологию протеиноидных
микросфер 145
Обсуждение 147
Липосомы - модель для изучения эндоцитоза .... 147
Схема молекулярных перестроек в липидной
бислойной мембране, индуцирующих ее инвагинирование 152
Выводы 160
Глава б. ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ 163
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ 169
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 171
ЛИТЕРАТУРА 173
- История открытия и распространения эндоцитоза Типы эндоцитоза и его основные фазы
- Попытка регистрации эндоцитоза у растительных объектов
- Методы электронной микроскопии корневых клеток редиса
- Ультраструктурные доказательства эндоцитозного типа поглощения веществ у растительных клеток
- Липосомы
Введение к работе
Эндоцитоз широко распространен в живой природе. Он встречается у организмов, находящихся практически на всех ступенях эволюции - начиная от простейших и кончая высшими организмами. У простейших организмов эндоцитоз является одним из основных способов амебоидного движения и поглощения более мелких организмов, частиц или высокомолекулярных соединений. В тканевые клетки разнообразные макромолекулы, в том числе энзимы, гормоны, также проникают эндоцитозом, выполняя функцию питания и регуляции метаболизма. Эндоцитоз имеет прямое отношение к иммунной защите организма. Дегенеративные клетки, патогенные микроорганизмы или их токсины заглатываются макрофагами и лимфоцитами. В последнее время эндоцитозу придают большое значение как процессу, лежащему в основе "лизосомотропной терапии". Так, недостающий организму фермент (свободный или заключенный в ли-посому), вводится в клетку эндоцитозом, накапливается в лизосо-мах, и тем самым предотвращается угроза "лизосомной болезни". Наконец, эндоцитоз, наряду с противоположным процессом - экзо-цитозом - участвует в обновлении поверхностной мембраны и, та.-ким образом, сохраняет нормальный уровень жизнедятельности клетки.
В клетках животных организмов выделяют два типа эндоцито-за: макро- и микроэндоцитоз. Первый характеризуется образованием крупных инвагинаций и пузырьков, видимых в светооптический микроскоп, второй - формированием субмикроскопических структур (60-130 нм в диаметре). Механизм макроэндоцитоза в значительной степени изучен. Установлено, что он состоит из четырех фаз: адсорбции поглощаемого субстрата на. клеточной поверхности;: инвагинации этого участка; замыкания инвагинации с образованием вакуоли и отрыва вакуоли от мембраны. Адсорбция - процесс физико-химический, практически никогда не зависящий от метаболической энергии. В ней принимают участие рецепторы разной степени специфичности. Дальнейший процесс поглощения зависит от метаболической энергии. Он происходит с участием сократительных структур: микротрубочек и микрофиламентов. Для работы контрактильной р. системы необходимы метаболическая энергия клетки и Са . Источниками энергии могут быть либо гликолиз и гексозомонофосфатный шунт, либо дыхание, либо гликолиз и дыхание одновременно, в разной степени. Выявлены некоторые механизмы локализации и мобилизации Са2+ и др.
Второй тип эндоцитоза (микроэндоцитоз) протекает без участия метаболической энергии, он изучен недостаточно, и его механизм не выяснен.
У растений функционирование эндоцитоза долгое время оставалось спорной проблемой. Это было обусловлено тем, что клеточная стенка, которая могла служить барьером для крупных молекул с диаметром > 6 нм, рассматривалась как серьезное препятствие для эндоцитоза. Кроме того, считалось, что плазмалеммные пузырьки и то-нопласт из-за различного химического состава не могут сливаться, что является препятствием для дальнейшей метаболизации поглощенного вещества. Некоторые исследователи полагали, что инвагинации и пузырьки можно скорее интерпретировать как секреторные, а не эндоцитозные структуры, поскольку в растительных клетках секреция, особенно в период роста, очень интенсивна. В последнее время критике подвергаются энергетические возможности растительной
КЛеТКИ В СВЯЗИ С ПИНОЦИТОЗОМ (Cram, 1980).
Однако, дальнейшими исследованиями было установлено, что наличие свободного пространства в клеточной стенке дает возмож- ность ряду крупных молекул, не проникающих через мембрану, контактировать с плазмалеммой и, возможно, поглощаться эндоцитозом (Саляев, 1965, 1969). Обнаружено, что тонопласт и плазмалемма способны к слиянию (Viemken et al., 1981) . Рядом авторов в разное время на ультраструктурном уровне были получены данные в пользу возможности эндоцитозного поглощения макромолекул органического происхождения и неорганических ионов ( Brachet,1954; 1957; Wheeler et al., 1972; Wheeler, Baker,1973) . Однако, воспроизводимых и бесспорно однозначных данных пока недостаточно.
До сих пор остается открытым вопрос и о значении эндоцитоза для растений. Пока существует очень мало работ в этом направлении. Так, Н.В.Парамоновой (1982) получены оригинальные данные по выяснению структурных основ взаимодействия клеток через апо-пласт, в котором также принимают участие эндо-экзоцитозные процессы.
Актуальность данной работы заключается в том, что эндоцитоз может являться способом питания растения крупномолекулярными фрагментами, находящимися в почве и, таким образом, вносить свой вклад в формирование урожая.
Первыми в этом направлении являются работы Мори с сотр. ( Mori, їшю-fco, 1976; Mshizawa, Mori, 1977,1978) Выяснение механизма эндоцитоза необходимо для разработки теоретических основ регуляции этого процесса.
Цель и задачи исследования
Целью работы явилось изучение эндоцитоза у растений. Для достижения этой цели, прежде всего была поставлена задача получить дополнительные доказательства эндоцитозного способа поглощения крупных молекул растительными клетками, применив различные методические подходы. После положительного решения этого вопроса была поставлена задача определить зависимость проникновения в клетки растений индуктора эндоцитоза от метаболизма и тем самым выяснить, является ли этот процесс зависимым от метаболической энергии, как и у клеток животных, и если зависит, то на всех ли этапах эта зависимость сохраняется. Для получения более полного ответа на последний вопрос мы применили модельные системы.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, заключения и списка цитируемой литературы.
Во введении обосновывается актуальность изучаемого вопроса, сформулированы задачи исследования, приведена аннотация рабо< ты.
История открытия и распространения эндоцитоза Типы эндоцитоза и его основные фазы
Экспериментальное изучение эндоцитоза началось со светооп-тических наблюдений И.И.Мечникова над фагоцитами тканей позвоночных животных. Для возникновения и развития теории иммунитета эти наблюдения сыграли колоссальную роль, и в сентябре 1980 г на Международном собрании торжественно отмечалось столетие открытия Мечникова о роли фагоцитоза в поддержании здоровья (Каг-novsky, 1981). В 1953 г это явление было впервые обнаружено в электронный микроскоп ( Pelade, 1953). Наблюдения Льюиса ( Lewis, 1931), который предложил термин пиноцитоз, и Маета и Дойля ( Mast, Doyle, 1934) дали толчок к более широкому исследованию фаго- и пиноцитоза, которые к тому времени рассматривались как процессы поглощения с участием клеточной мембраны. Сегодня большинством ученых принят взгляд на эндопитоз, как на. процесс поглощения жидких и твердых компонентов из внеклеточной среды. Долгое время считалось, что эндопитоз функционирует только у клеток животных. Но в последние два-три десятилетия делалось много попыток обнаружить и исследовать эндопитоз и в растительных клетках. Однако, бесспорных и безусловно воспроизводимых данных пока еще мало. Поэтому проблема эндоцитоза у растений все еще остается дискуссионной.
Фаго- и пиноцитоз широко распространены у клеток животных самого разного уровня их организации и специализации. Распространение эндоцитоза хорошо освещено в обзоре Р.К.Саляева и А.С. Романенко (1979), Фактически, эндоцитоз зарегистрирован у любых типов клеток животных организмов.
Механизм эндоцитоза в наибольшей мере исследован у клеток животных. И нам, для того, чтобы изучить механизм эндоцитоза у растений, необходимо было обобщить факты, полученные при изучении механизма эндоцитоза у клеток животных. Этому и посвящена первая глава обзора литературы.
Мы считаем целесообразным дать толкование основных терминов, употребляемых в диссертации, которые отражают классификацию эндоцитоза и используются в современной литературе, либо предложены в отношении растений нами.
1. Эндоцитоз - процесс, объединяющий фаго- и пиноцитоз, характеризующийся образованием внутрийлазматических везикул, отшну-ровывающихся от плазматической мембраны.
2. Фагоцитоз - поглощение клеткой твердых частиц.
3. Пиноцитоз - поглощение коллоидных растворов, макромолекул или ионов в виде капелек жидкости.
4. Макроэндоцитоз (макропиноцитоз и фагоцитоз) - эндоцитоз частиц и крупных молекул, выявляемый в оптический микроскоп.
5. Микроэндоцитоз (микропиноцитоз) - эндоцитоз молекул и ионов размером 0,1 мкм, выявляемый только при электронной микроскопии.
6. Энергонезависимый эндоцитоз - эндоцитоз,, не зависимый от метаболической энергии клетки. У объектов животного происхождения обычно реализуется как микроэндоцитоз (микропиноцитоз). У растений четкой корреляции между формированием микропиноцитозных структур и ингибированием метаболической энергии нет. Поэтому для растений мы применяем классификаций, основанную только на
-16 энергетических характеристиках, исключая морфологические критерии. В главах "Результаты" и "Обсуждение" термином энергсйзависи-мый эндоцитоз или эндоцитоз, не зависимый от метаболической энергии, мы называем не отдельный тип эндоцитоза, как принято в классификации эццоцитоза у животных объектов, а лишь те стадии эндоцитоза, когда инвагинирование и везикуляция мембраны может происходить без участия энергии метаболизма.
7. Энергозависимый эндоцитоз - эндоцитоз, зависимый от метаболической энергии клетки. В клетках животных - это макроэндо-цитоз.
8. Жидкофазный (нееорбционный) эндоцитоз - процесс, при котором индуктор сорбируется слабо, и концентрация поглощаемого индуктора в эндосоме примерно равна его концентрации в окружающем растворе.
9. Адсорбционный эндоцитоз. В данном случае адсорбция индуктора ярко выражена. Концентрация индуктора, поглощаемого эн-доцитозом, в несколько сот раз выше, чем в свободной форме.
10. Дцсорбционно-концентрационный или рецептор-связанный эндоцитоз - процесс связывания индукторов с высоко специфичны ми рецепторами с последующей их кластеризацией и локализацией в окаймленных инвагинациях.
Попытка регистрации эндоцитоза у растительных объектов
Вопрос о существовании эндоцитоза у растений дебатируется многие годы, а литература по этому вопросу фрагментарна и противоречива. Попытки показать эндоцитоз предпринимались неоднократно (Buvat, I960; Palade, Jensen, I960; Geneves, 1961; Wei-ling, 1961; Саляев, Романенко, 1969; Романенко, 1971 а,б; Ro-bards, Robb, 1972, 1974; Wheeler et al., 1972; Baker, Hall, 1973; Wheeler, Baker, 1973; Парамонова, 1974; Романенко, Саля-ев, 1975, 1978; Mori, Yumoto, 1976; flishizawa, Mori, 1977 a,b; 1978; Kijne, Planque, 1979; Lutz, Vogel, 1980).
Долгое время считалось, что наличие у растительной клетки пектоцеллюлозной оболочки может препятствовать проникновению макромолекул. Однако Р.К.Саляевым (1965, 1969) экспериментально было показано наличие достаточно широких промежутков свободного пространства, оболочки, которые облегчают контакт ряда веществ, в том числе и крупномолекулярных, с плазмалеммой. Более того, есть примеры такого маловероятного для растений явления, как фагоцитоз. Речь идет о фагоцитозном поглощении клубеньковых бактерий
(Андреева,1983) коровыми корневыми клетками оооовыхУГВ процессе заражения клеток бобовых клубеньковыми бактериями наблюдали образование большого числа ломасом - складчатых инвагинаций - и пузырьков (Truchet, Coulomb, 1973; Kijne, Planque, 1979). При этом происходит направленная Модификация (ЛИЗИС) КЛеТОЧНОЙ СТенкИ (Matile, Wiemken, 1976). В противоположность гетерофагии в животных клетках фагоци-тозное поглощение бактерий не сопровождается их внутриклеточным перевариванием, Плазмалемма-гомологичные вакуоли, в которых остаются бактероиды, превращаются в переваривающие (гетерофагосом-ные) вакуоли только тогда, когда система уже минует симбиотичес-кую стадию развития. Таким образом, переваривание бактерий имеет место в стареющих клетках хозяев, которые,в свою очередь,подвергаются аутолизу (Truchet, Coulomb, 1973). Рассмотренное явление касается симбионтных клеток. В отношении несимбионтных растительных клеток ряд исследователей считали, что образование пузырьков, инвагинаций и ломасом можно объяснить исключительно секреторными процессами, которые в растениях очень интенсивны, особенно в период роста при формировании клеточной стенки ( Bonnett, Hewcomb, 1966; Newcomb, 1967; Merchant, Robards, 1968; Данилова и др., 1968; Мирославов, 1969, 1970; Patte et al., 1969; Schnepf, 1969; Васильев, 1977).
Методы электронной микроскопии корневых клеток редиса
Объекты. Объектами электронно-микроскопических исследований были корешки 3-4-х дневных проростков редиса Raphanus sativus . Семена редиса проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге с водопроводной водой при комнатной температуре. Для работы отбирали корни длиной 1,5-2 см с нормально развитыми корневыми волосками. В световой микроскоп наблюдали преимущественно поглощающую зону (корневые волоски), а в электронном микроскопе просматривали срезы, полученные с зон корневого апекса. По каждому варианту опыта просматривали 2-3 корня. Повторность опыта 2-х кратная.
Методы электронной микроскопии корневых клеток редиса. Применение маркера-индуктора и метаболических ингибиторов. Для изучения эндоцитоза, его динамики и механизма применяли несколько методических подходов: I) использование маркера-индуктора эндоцитоза, 2) применение метаболических ингибиторов, 3) количественный учет эндоци-тозных структур, 4) макроденситометрия мембран.
В качестве индуктора и маркера пиноцитоза был выбран уранил-ацетат. С помощью метаболических ингибиторов нужно было проследить динамику пиноцитозного поглощения уранилацетата. Исследования проводили на опытных образцах, приготовленных следующими методами. Проростки редиса одновременно инкубировали в течение б часов в водных растворах соединений:
1) уранилацетата (УА) - 0,15 мМ
2) УА (0,15 мМ) + ДШ (0,1 мМ)
3) УА (0,15 мМ) + МЭ (1,5 мМ)
с прединкубацией в течение I часа в растворах соответствующих ингибиторов, а в I варианте - в водопроводной воде. Контролем служили растения, выдержанные 7 часов в водопроводной воде.
Фиксацию объектов проводили в соответствии с общепринятой методикой (Гайер, 1974; Уикли, 1975). Отрезки корней фиксировали 2 часа 4% раствором глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном бу - 60 фере, рН 7.2, промывали 30 мину? в нескольких сменах фосфатного буфера и постфиксировали в 1% растворе oso. на том же буфере 2 часа. Обезвоживание проводили в серии спиртов возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне. Материал заключали на пропитку в аралдит (Piuka, Швейцария) с ацетоном, затем в чистый арал-дит. После этого объекты помещали в термостат с температурой 62 с на 16 часов, после чего подвергали медленному остыванию в о течение 10 часов. Срезы тощиной примерно 600 А (золотистого цвета) получали на ультрамикротоме ькв (Швеция). Ленты серийных срезов монтировали на палладиевых сеточках. Часть срезов наблюдали неконтрастированными, основное число срезов контрастировали либо УА, либо последовательно УА и цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963). Срезы просматривали в электронном микроскопе ЭЕМ-100 Л. Фотографирование объектов проводили на сверхконтрастные фотопластинки размером 9 х 12.
Ультраструктурные доказательства эндоцитозного типа поглощения веществ у растительных клеток
Локализация маркера уранилацетата в корневых клетках редиса. Сравнивая корневые клетки растений контрольного варианта (без УА) и растений, инкубированных с маркером эндоцитоза, мы обнаружили, что в обоих вариантах образуются инвагинации, ломасомы и пузырьки плазмалеммы, однако в опытных растениях во многих из этих структур, а также в апопласте хорошо виден маркер в виде плотных кристаллов. Они четко вьщеляются, особенно на неконтрастированных срезах (рис.1-8). Некоторые эпидермальные клетки выглядили поврежденными, очевидно, в результате избыточного накопления соли уранила. Клетки более глубоких зон оставались нормальными. У многих из них наблюдались плазмалеммные образования с кристаллами маркера: ломасомы и инвагинации.
Инвагинации могут иметь разнообразные размеры. Так, микроинвагинации характеризуются диаметром от 80 до 100 нм (рис.8). Макроинвагинации занимают значительную часть клетки. В одной клетке может формироваться довольно много инвагинаций (рис.9,10).
Наиболее важную информацию дал анализ серийных срезов. Он показал, что в клетках корня редиса систематически встречаются эндоцитозные пузырьки. Определенное число пузырьков содержало преципитат уранила. Их размеры колеблются от 60 до 200 нм (рис. И, 12,13).
Конечным компартментом локализации скоплений маркера при эндоцитозе являются вакуоли (рис.14,15,16,17). Интересным представляется следующий факт. Мы обнаружили внедрение в центральную вакуоль другой, меньшей по размеру вакуоли (рис.18). Последняя, как видно на фото, имеет мембрану большей толщины с четким разрешением, как плазмалемма, и этим отличается от тонопласта центральной вакуоли. Очень похоже, что мы наблюдаем контакт пиноцитозной вакуоли с центральной вакуолью в процессе эндоци-тоза, где маркер мог локализоваться в участках, не попавших на срез.
Липосомы
Механизм энергозависимого эндоцитозного поглощения веществ животными клетками изучен многосторонне. Однако этого нельзя сказать об эндоцитозе, который не требует затрат метаболической энергии (Casley - Smith, 1969; Allison, Davies, 1974). Движущие силы этого явления не ясны не только для растительных, но и для животных клеток. В предыдущей главе были изложены результаты опытов на растительных клетках с целью выяснения этих причин. В данном разделе нами была предпринята попытка более детально познать природу сил, заставляющих мембрану инвагйнировать без участия метаболической энергия
С этой целью мы применили в исследованиях модельные мембраны, испытав влияние различных веществ на их морфологию. Впервые для изучения механизма эндоцитоза в нашей работе были взяты в качестве модели липосомы - многослойные липидные везикулы. Кроме того, мы изучали влияние индукторов эндоцитоза на белковоподобные модели - протейнойдные микросферы, чтобы уточнить, в какой мере за инвагинирование мембраны ответственны ее составные части - липиды и белки.
Влияние анионных и амфотерних соединений на поведение л и я п о с о м. Поскольку поверхность клеток (гликокаликс и пограничная мембрана) обладают общим отрицательным зарядом, вещества-индукторы для осуществления прочного связывания их с клетками должны быть заряжены положительно. Поэтому, естественно, представляло интерес испытать действие соединений различной природы: анионных, амфотерних, катионных, в том числе индукторов эндоцитоза, на модельные липидные мембраны.
Наблюдения показали, что такие соединения, как металлы переменной валентности в форме отрицательно заряженного комплексного иона Ре(стт6)3", 7 мм; Сг2о72"", 7 мМ; суспензия туши (0,1$); высокополимерный углевод декотрая голубой (0,05-0,1$), не оказывали никакого влияния на морфологию липидных мембран, приготовленных на солевой среде как с добавлением Са , так и без него (табл. 3). При этом воздействие, в частности, железосинеродистого калия отсутствовало в широком интервале рН (3,2-9,2). Кислая фосфатаза и протаргол лишь несколько снижают упругость"липосом . Интересно отметить, что АТФ, эффективно стимулирующая макропиноцитоз у макрофагов (cohn, Parks, 1967 ъ) в концентрации 1,0 мМ, вызывает некоторое волнистое движение липосомальных мембран.
Таким образом, анионные и электронейтральные соединения практически не влияют на модельные мембраны, вероятно из-за. отсутствия взаимодействия с отрицательно заряженными полярными головками фосфолипидов. Хорошо известно, что проникновение анионных соединений, за. исключением яизкомолекулярных, в животные и растительные клетки также затруднено из-за преобладания на клеточной мембране фиксированных отрицательных зарядов, и в этом отношении рассматриваемые искусственные многослойные мембраны напоминают по своим свойствам естественные.
