Содержание к диссертации
Введение
Глава I АТФазные системы плазматических мембран клеток высших растений
1.1 Общая характеристика транспортных АТФаз 9
1.2 Катионные насосы в плазматических мембранах клеток высших растений 12
1.3 Исследование АТФазной активности в го«-могенатах растительных тканей 17
1.4 Краткая характеристика АТФазных систем очищенных фракций плазматических мембран клеток высших растений 20
1.5 Отношение АТФаз плазматических мембран клеток высших растений к действию одновалентных катионов 23
1.6 Отношение АТФаз плазматических мембран клеток высших растений к действию двухвалентных катионов 29
1.7 Действие ингибиторов на АТФазную активность плазматических мембран клеток высших растений 32
1.8 О некоторых свойствах солюбилизированных АТФазных белков плазматических мембран клеток высших растений 35
Глава 2 Объект и методы исследования 43
2.1 Выделение фракции, обогащенной плазмати ческими мембранами клеток высших растений 44
2.2 Идентификация фракции плазматических мембран
2.2.1 Электронно-микроскопическое исследованиє фракции плазматических мембран 50
2.2.2 Определение малатдегидрогеназной активности 53
2.3 Определение АТФазной активности во фракции плазматических мембран 53
2.3.1 Люциферин-люииферазный метод определения АТ 54
2.3.2 Спектрофотометрическое определение АТФаз-ной активности с помощью малахитового зеленого 60
2.4 Определение ду и дрН во фракции изолированных плазматических мембран с помощью флуоресцентных зондов 61
2.4.1 Измерение ду с помощью флуоресцентных зондов АНСҐ и АУ+ 63
2.4.2 Определение дрН с помощью флуоресцентного зонда 9-аминоакридина 65
2.4.3 Проведение люминесцентного анализа 66
2.5 Определение концентраций ионов К* и №а+ на пламенном фотометре 69
2.6 Определение содержания белка во фракции плазматических мембран по методу Лоури с учетом поправки на сахарозу 72
2.7 Статистическая обработка результатов 73
Глава 3 Изучение АТФазной активности фракции изолированных плазматических мембран клеток флоэмы борщевика
3.1 Электронно-микроскопическое и биохимическое исследование чистоты фракции плазматических мембран клеток флоэмы борщевика 74
3.2 Обнаружение АТФазной активности во фракции плазматических мембран клеток флоэмы борщевика 80
3.3 Исследование природы пиков АТФазной активности плазматических мембран клеток флоэмы бор» щевика 101
3.3.1 Исследование АТФазной активности плазмалеммы клеток флоэмы борщевика с оптимумом рН 6,0 103
3.3.2 Исследование АТФазной активности плазмалеммы клеток флоэмы борщевика с оптимумом рН 6,5 106
3.4 Локализация АТФазной активности с оптимумами рН 6,0 и 6,5 в плазматических мембранах различных клеток флоэмы борщевика 115
Глава 4 Анализ транспортных свойств АТФазных систем плазматических мембран клеток флоэмы борщевика
4.1 АТФ-завиеимый транспорт Н+ в везикулах плазматических мембран клеток флоэмы борщевика при рН 6,0 123 4*1.1 АТФ-зависимая генерация дУв везикулах плазмалеммы клеток флоэмы борщевика при рН 6,0 124 4.1.2 АТФ-зависимая генерация дрН в везикулах плазматических мембран клеток флоэмы борщевика 137
4.2 АТФ-зависимый транспорт К+ и в везикулах плазматических мембран клеток флоэмы борщевика при рН 6,5 147
Заключение 159
Выводы 173
Литература 175
- Краткая характеристика АТФазных систем очищенных фракций плазматических мембран клеток высших растений
- Электронно-микроскопическое исследованиє фракции плазматических мембран
- Обнаружение АТФазной активности во фракции плазматических мембран клеток флоэмы борщевика
- АТФ-зависимый транспорт К+ и в везикулах плазматических мембран клеток флоэмы борщевика при рН 6,5
Введение к работе
Вопросы транспорта веществ через биологические мембраны привлекают в настоящее время всё большее внимание исследователей (Лев, 1974, Кларксон, 1975, Веренинов, 1978, Котык, Яначек, 1980). Установлено участие в транспортных процессах, и, прежде всего, в активном транспорте ионов против их электрохимических градиентов, специализированных ферментных систем. Особое место среди этих систем занимают транспортные аденозинтрифосфатазы (АТазы). Являясь основой ионных насосов, транспортные АТ$азы сопрягают гидролиз АЇФ с транспортом соответствующих ионов.
В настоящее время наиболее хорошо изученными транспортными АТвазными системами являются Н+~АЗФаза, Иа^"К+-А1Фаза и Са2+, м^+-АІФаза. На изолированных мембранных структурах исследованы их биохимические и транспортные свойства (Mitchell, 1966, Скулачев, Козлов, 1977, Болдырев, 1978, Мартиросов, 1980, Гершанович, 1980, Schuurraana Stekhoven, Bonting 1981). Встраивая очищенные АТФазные белки в искусственные фосфолипидные мембраны, удалось убедительно показать роль этих белков в процессах переноса определенных ионов через мембраны (Рэкер, 1979).
Транспортные АТФазы плазматических мембран растительных клеток стали изучаться в самое последнее время. Пока не совсем ясно, какие типы АТ&аз функционируют в плазматических мембранах клеток высших растений. Вопрос осложняется тем, что растительные клетки в отличие от животных и микроорганизмен-ных клеток кроме плазмалеммы имеют еще одну мембрану - тоно-пласт, в которой, как и в плазмалемме, функционируют активные транспортные системы. Предполагают, что в плазматических мембранах клеток высших растений находятся катион-стимулируемые
«6-
АТФазы, а в мембране тоногшаста - анион-стимулируемые Ala-зы С Poole , 3978, Sze , 1982).
Рядом исследователей показано наличие в ппазмалемме
клеток высших растений К+-зависимой АТФазы (Hodges »1976,
Leonard, Hotchkiss » 1976), Имеются немногочисленные
данные, свидетельствующие о работе в растительных плазмати***
ческих мембранах Na+, К+-АТФазы (Kyiin , 1973, Тихая и
др.., 1976). Косвенные данные о функционировании в плазма-
лемме клеток высших растений Н+~насоса ( Poole t 2978» Ля
лин, ДЭ79, Воробьев, J980, Bentrup , 3980), позволяют
сделать предположение о наличии в этих мембранах Н*-АТФазы;
Таким образом, вопрос о типах АТФаз, функционирующих в плаз
матических мембранах клеток высших растений, пока остается от
крытым^
До последнего времени не было прямых экспериментальных доказательств, свидетельствующих об участии АТФазных систем в транспорте различных ионов через плазматические мембраны растительных клеток. Как правило* исследования в этой области проводились на целых растениях или на отдельных растительных тканях и велись или в плане обнаружения определенных АТФазных систем и косвенно доказывалось их возможное участие в транспорте тех или иных ионов, или в плане изучения транспорта различных ионов (ІС+, ш+, н+, С1~) и возможного участия в транспортных процессах АТФаз.
До настоящего времени большая часть работ по изучению растительных АТФазных систем была проведена на корнях растений. Исследователи обоснованно полагали наличие в тканях корня активных транспортных систем, принимающих участие в поглощении корнями питательных веществ из почвы. Исследование АТФазных
tftm
систем других растительных тканей позволит выявить универсальность или специфичность этих систем. Особый интерес в связи с этим может иметь исследование проводящей ткани флоэмы, основной функцией которой является транспорт ассимиля-тов, что позволяет предположить функционирование в плазма-лемме клеток этой ткани активных транспортных механизмов;
В связи с вышеизложенным в задачи представляемой работы входило:
~ выявление типов АТіаз, функционирующих в плазмалемме клеток флоэмы высших растений,
** изучение биохимических свойств выявленных АТФаз,
3 - доказательство участия обнаруженных АТаз в транспорте
определенных катионов через плазматические мембраны.
Наиболее убедительно поставленные задачи можно решить при исследовании их на фракции изолированных плазматических мембран. Поэтому одна из частных задач работы состояла в получении фракции, обогащенной плазматическими мембранами клеток флоэмы."
В результате проведенных исследований на изолированной фракции плазматических мембран впервые было показано, что в плазмалемме клеток флоэмы высших растений функционируют две АЇФазнне системы: Н+*»АТФаза и ііа+,К+~АТФаза. Показано, что обе АЗФазы работают в кислой области рН. Первая имеет оптимум рН 6,0, вторая рН 6,5'. Изучены их некоторые биохимические свойства: субстратная специфичность, кинетические параметры катализируемых реакций, отношение ферментов к действию некоторых одно- и двухвалентных катионов. Получены данные, свидетельствующие, что растительные плазмалемные АТазы имеют ряд особенностей, отличающих их от аналогичных систем, функ-
т О **
ционирующих в плазматических мембранах клеток животных и микроорганизмов.
Впервые получен комплекс прямых экспериментальных данных, показывающих, что обнаруженные АТФазы функционируют как транспортные системы. АТФ-зависимое изменение электрохимии ческого градиента протонов, возникающее на плазматической мембране, свидетельствует об участии АТФазы с оптимумом рН б, 0 в транспорте Н+. Вышедшая недавно работа, в которой по*-казано изменение химического градиента Н+ при функционировании солюбилизированной АТФазы плазматических мембран клеток корней овса, встроенной в фосфолипидный бислой (Vara, Serrano , 1982), является хорошим подтверждением полученных нами результатов, свидительствующих о том, что основой протонного насоса плазмалеммы клеток высших растений является Н+~АТФаза.
Вторая АТФазная система с оптимумом рН 6,5 принимает участие в мембранном транспорте К* и На +. Было обнаружено АТФ*индуцированное изменение потоков К+ и Na+ через плаз** малемму клеток флоэмы в противоположных направлениях.
Полученные данные имеют определенное значение как в разработке в целом проблемы мембранного транспорта, так и в решении ряда актуальных задач физиологии и биохимии высших расте» ний. Они вносят определенный вклад в изучение процессов, спо* соботвующих передвижению ассимилятов и ионов во флоэме, что в перспективе может создать дополнительные возможности в ре* гуляции этих процессов на мембранном уровне с целью улучшения полезных свойств сельскохозяйственных растений.
-9-. Глава I. АТФазные системы плазматических мембран клеток высших растений
Краткая характеристика АТФазных систем очищенных фракций плазматических мембран клеток высших растений
Изучение АТФазной активности клеток высших растений началось недавно с исследования этой активности в гомогенатах или недостаточно очищенных микросомальных фракциях. В то время было известно, что в плазматических мембранах клеток животных функционирует Иа+, К+-АТФаза, выполняющая транспорт ионов Na+ и К+ через мембрану. Поэтому для ряда исследователей растительных АТФаз поиск этого фермента определялся некоторыми свойствами Na+, К+-АТ$азы животных клеток и, в первую очередь, отношением фермента к одновалентным и двухвалентным катионам и к сердечным гликозидам, как ингибиторам Na K -A K&asH.
Исследования АТ&аз, проведенные на гомогенатах, недостаточно очищенных микросомальных фракциях клеток высших растений, дали разнообразные и противоречивые данные по этому вопросу. Ряд исследователей обнаружили оптимум рН АТФаз-ной активности в кислой среде: Фишер и Ходжес ( Fisher, Hodges , 1969) - В Корешках ОВСа, аткинсон И П0ЛИа Atkinson, Poiya , 67) - в корнеплодах моркови и свеклы, Туркина, Крючешникова, Емельянова,(1975) - во флоэме борщевика и др. АТіазная активность с нейтральным оптимумом рН была обнаружена в корешках бобовых ( Gruener , Neumann , 1966, Ног ovitz , Waizel » 70) ЯЧМЄНЯ (на11# В70)» Кукурузы (Horowitz , Waizel , 1970). В ячмене и кукурузе АФ&азная активность стимулировалась неорганическими солями Mgci2 , Cad2, NaCi и KCI, тогда как у некоторых галофитов Пасі ингибировал растворенную АТФазную активность (Horovitz, їїаігеДД970). Активирующее действие ионов К и Na+ примерно на 13-14 по сравнению с контролем показано на препарате АТФазы неочищенной микросомальной фракции зерновок пшеницы (Саляев и др., 1975) и фракции- изолированных клеточных стенок корней 3-дневных проростков кукурузы (Саляев, По-долякина, Каменкова, 1971). Причем совместное внесение в среду инкубации ионов К4" и Na+ увеличивало активность АТФазного препарата зерновок пшеницы на 26/» (Саляев и др., 1975). Большую суммарную активность показал также препарат АТФазы, выделенный растворами высокой ионной силы из клеток флоэмы борщевика и проводящих пучков свеклы (Боулинг и др.,1972). При концентрации К 15 мМ и иа+ 65 мМ общая активность АТФазы из клеток флоэмы борщевика равнялась сумме эффектов каждого из ионов в отдельности. Стимуляция ионами К4" составила прирост над контролем 35#, ионами Ш - I33f, совместное внесение К4" и Na дало прирост АТФазной активности на 167% (Боулинг и др., 1972). Несколько противореаивые данные получены по вопросу о дей ствии на АТФазную активность неочищенных мккросомальных фракций клеток высших растений двухвалентных катионов. Многими иссле дователями ( Gruener, Neumann , 1966, Atkinson, Polya, 1967, Kasamo, Yamaki , 1974) показан стимулирующий эффект. Наиболее эффективными были Mg , Cau-+, Mn . Часто Mg + был более эффективен, чем другие двухвалентные катионы, но, например, в препаратах клеточных стенок корней ячменя и в микросомальных препаратах корешков пшеницы Са-+ сильнее акти вировал АТФазную активность по сравнению с Mg + (Hodges, 1976). В некоторых работах было показано, что ионы Mg могут даже слабо ингибировать активность АТФазы (Боулинг и др., 1972). йнгибирующее действие сердечных гликозидов на АТіазную активность показано для клеток флоэмы борщевика и проводящих пучкой сахарной свеклы (Боулинг и др.» 1972),для фракции изолированных клеточных стенок корней проростков кукурузы и зерновок пшеницы (Саляев, Подолякина, Каменкова, 1971, Саляев и др., 1975), для корней тыквы (Выокребениева, Красавина, 1971, Красавина, Выскребенцева, 1972). Однако далеко не во всех экспериментах с гомогенатами или неочищенными микросомальными фракциями показано йнгибирующее действие оуабаина. Он не ока зывал действия на АТФазу бобовых ( Gruener, Neumann, 1966), овса ( Fisher, Hodges , 1969), кукурузы ( Dodds, Ellis, 1966). Данные всех перечисленных выше работ трудно интерпретировать, поскольку, во-первых, гомогенат представляет собой неконтролируемую среду, В нем могут содержаться вещества, ингибирующие АТФазную активность, и, во-вторых, вряд ли исто следователи в данных раоотах имели дело с каким-одним определенным ферментом. Гомогенаты и недостаточно очищенные микросомальные фракции могли содержать митохондриальные АТФазы, АТФазы тонопласта, кислые фосфатазы аппарата Гольд-жи и пр. - все эти ферменты по разному относятся к действию различных катионов и сердечных гликозидов. Действительно, с помощью гистохимических методов удалось показать, что АтФазные системы могут быть локализованы в различных мембранных структурах растительной клетки: плаз-малемме, хлоропластах, тоноплаоте, эндоплазматической сети, в мембранах аппарата Гольджи, митохондриях и мембранах ядра и ядрышка ( Hall 0 1969, Hall » 1971, Edwards, Hall » 1973 Gilder, Cronsnaw , I97S, 1974, Карпилов, Биль, Гукасян, 1975, Биль, Белобродская, Карпилов, 1976, Winter-siuiter et.al.,, 1977, Bentwood, Cronshaw , 1978, Browning, Hall, Baker , 1980, Weber, Hess, Kim Chong-Куші , I980,Mogenzen, І98І). С помощью гистохимических методов труднее показать отношение обнаруживаемых АТФазных систем к различным катионам и ингибиторам. Однако, ряд исследователей выявили гистохимическим методом в плазмалемме АТ$азу, стимулируемую ионами К и на+ (Лапикова, Косулина, Потапов, 1977, Лапикова, Косули-на, Потапов, 1978).
Таким образом, исследования АТФаз, проведенные на гомогенатах и недостаточно очищенных микросомальных фракциях, а также гистохимическими методами, не смогли полно и однозначно решить вопрос о функционировании определенной АТЕазной системы в плазмалемме клеток высших растений.
Электронно-микроскопическое исследованиє фракции плазматических мембран
Для идентификации фракции плазматических мембран исполь-зовали метод специфического окрашивания электрошю-микроско-пических препаратов .
Фракцию мембранных везикул, предназначенную для электронно-микроскопических исследований, центрифугировали на ультрацентрифуге М0М 170 при 90 OOOg в течение 30 минут. Осадок плазматических мембран оставался на дне пробирки в виде компактной массы;. Супернатант сливали, а к осадку добавляли I мл 2% раствора глютаральдегида в натрий-фосфатном буфере. После одночасовой инкубации снова производили центрифугирование при 90 OOOg в течение SO минут, (рН 9,4), Осадок промывали в те« чение Ю минут натрий-фосфатным буфером и фиксировали в I мл 1% раствора осмиевой кислоты в течение I часа при 2бС (раствор осмиевой кислоты готовили в натрий-фосфатном буфере, рН 9,4)-І После фиксации осадок промывали 10 минут буфером и 10 минут бидиотиплятом. Обезвоживание осадка проводили, выдерживание последовательно по SO минут в 25, 50 и 70 спиртах.
На последних этапах обезвоживания осадок помещали на 10 минут в абсолютный спирт, а затем переносили в обезвоженный ацетон (2 раза по SO минут). После процедур обезвоживания производили пропитывание осадка смолой эпоном 812« Для этого сначала к осадку добавляли смесь, состоящую из 2 х частей обезвоженного ацетона и I части эпона 812. В этой смеси осадок находился в течение I часа при 40С в термостате. Потом осадок переносили последовательно в смесь из равных частей обезвоженного ацетона и эпона 8Г2, в смесь из I части ацетона и 2-х частей эпона и, наконец, в чистую смолу. Пропитывание осадка в этих смесях проходило также в термостате при 40С в течение I часа.
Пропитав чистым эпоном, осадок помещали в смесь эпона с катализатором и уплотнителем на I час при 40С. Данную смесь готовили следующим образом: к 100 мл эпона 812 добавляли 89 мл уплотнителя надик-метилового ангидрида ( НМА ). К каждым 10 мл этой смеси добавляли в качестве катализатора 0,2 мл тридиметиламинофенола (ДМР-SO) (Бирюзова и др., 1963), Выдержав в данной смеси при 40С, осадок переносили в желатиновые капсулы, заливали этой же смесью и ставили в термостат на 2 часа при 80 Ю0С. В результате получали блок, который подвергали резке на ультрамикротоме УШП Є« Исследования срезов проводили на электронном микроскопе УМВ-ЮОв. Электронно-микроскопические препараты для исследования локализации транспортных АТіаз в клетках флоэмы получали вышеописанным способом. В блок при этом заливали кусочки проводящих пучков по S мм-; Окрашивание препаратов везикул плазматических мембран проводили двумя способами: с помощью специфического красителя PACP и реактивом Рейнольдса. Роланом с соавторами (Roland, bembi, Morre, 1972) был предложен метод специфической окраски плазматических мембран клеток высших растений с помощью реактива РАСР (по наименованию компонентов окрашивающей смеси: периодной кислоты, хромовой и фосфовольфрамовой).
Срез, полученный с кусочка уплотненного центрифугированием осадка микросомальной фракции, помещали на платиновую сетку для просматривания в электронном микроскопе. На срез капали 1% раствор периодной кислоты и выдерживали в нем SO минут. После обесцвечивания промывали водой 5 раз по 10 минут. Затем срез обрабатывали в течение 5 минут 1% фосфоволь фрамовой кислотой, растворенной в 10$ растворе хромовой кислоты. После 5 ти кратного промывания дистиллированной водой срез наблюдали под электронным микроскопом.
Реактив Рейнольдса представляет собой раствор цитрата свинца. С помощью этого реактива окрашиваются все мембранные структуры препаратам Сеточку со срезом помещали в раствор цитрата свинца на 15- 30 минут. Затем срез несколько раз промывали 0,02 н раствором NaOH и дистиллированной водой. Раствор цитрата свинца готовили следующим образом: 1,33 г Рв ш Поскольку митохондриальная А1Ф синтетаза могла бы силь но затруднить поиски протонной АТФазы во фракции плазмалеммы, необходимо было установить, насколько загрязнена выделяемая фракция плазматических мембран клеток флоэмы борщевика мито-хондриальными структурами. В качестве маркера митохондриаль-ных мембран был выбран фермент малатдегидрогеназа ( Cross, Briggs, 1977).
Реакционная смесь для определения активности МДГ состоя -ла из I мл 0,1 мМ раствора глицин-глицинового буфера (рН 7,2), 0,6 мл 15 мМ раствора малата, 0,2 мл 12 мМ раствора НАДФ и 0,2 мл 18 мМ раствора MnSO (Салькова, Звягинцева, 1975). Через SO с после добавления в реакционную смесь 0,2 мл исследуемой фракции смотрели прирост оптической плотности при 840 нм на спектрофотометре Spectromom 203. Активность фермента выражали в единицах оптической плотности на миллиграмм белка. его активности можно судить как по количеству неорганического фосфата, образующегося в результате реакции (на этом основан ряд спектрофотометрических методов определения АТаз ной активности), так и по количеству АТФ, расщепленному ферментом (на этом основан люциферин-люциферазный метод определения АТФазной активности)1;
В работе были использованы оба подхода: и по количеству расщепляемого аденозинтрифосфата и по количеству образующегося неорганического фосфата. Работа с незначительным количеством мембранного материала (концентрация выделяемого мембранного белка была около 200мкг/мл диктовала выбор наиболее чувствительных методов.
Обнаружение АТФазной активности во фракции плазматических мембран клеток флоэмы борщевика
Принцип метода пламенной фотометрии заключается в том, что при высокой температуре растворитель (чаще НрО) анализируемого раствора испаряется, а растворенное вещество диссоциирует до атомов, которые затем ионизируются или вступают в реакцию с кислородом, имеющемся в пламени. Атомы или ионы возбуждаются в пламени и затем, переходя на более низкие энергетические уровни, излучают свет определенной длины волны. Интенсивность излучения света при определенных условиях пропорциональна концентрации определяемого элемента.
При исследовании концентраций К+ и На + внутри везикул плазматических мембран клеток флоэмы борщевика использовали следующую схему постановки опыта. 0,5 мл исследуемой фракции вместе с 0,4 мл раствора, содержащего S мМ Mgso, 50 мМ NaCl и I мМ трис (рН 6,5), помещали в диализный мешочек. Диализ проводили против 5 мл 17# раствора сахарозы, содержащего I мМ трис (рН 6,5), 3 мМ Mgso и 50 мМ uaci Первые ЭО минут проводили диализ на холоду. В предварительных опытах было показано, что за это время пассивные потоки ионов через мембраны устанавливались на определенных стационарных уровнях, но существенного снижения АТФазной активности не происходило. После этого срока в диализная мешочек добавляли 0,1 мл SO мМ раствора АЇФ для инициирования АТШазной реакции. В контрольных опытах вместо АТФ добавляли 0,1 мл деионизированной воды.
После старта АІФазной реакции мешочек переносили из одного диализного раствора в другой через определенные интервалы времени (I, 3, 5, 15, ЭО, 60 и 90 минут). Диализные растворы анализировали на пламенном фотометре на присутствие в них ионов К+, вышедших из диализного мешочка..
Через 1,5 часа от начала реакции содержимое диализного мешочка фильтровали через миллипоровый фильтр. Фильтрат анализировали на содержание в нем К+. Количество К+, находившееся в фильтрате вместе с тем количеством ионов К+, которое определялось в диализных растворах, составляло общее количество ионов К+, вышедших из везикул наружу. К оставшимся на миплипоровом фильтре везикулам плазмалеммы добавляли 3 мл де ионизированной воды и ставили их в морозильную камеру холодильника на ночь. После размораживания везикулы разрушались, и концентрацию вышедших из везикул ионов К+ и иа+ определяв ли на пламенном фотометре.
Блок-схема применявшегося в исследованиях импульсного пламенного фотометра приведена на рис. II. Излучение элементов в пламени выделяли с помощью интерференционных светофильтров: для К+ - с максимумом пропускания 770 нм, для Na + с максимумом пропускания - 588 нм. Питание ФЭУ осуществлялось от высоковольтного источника питания ВСВ-2. Определение К+ производилось при напряжении 990 в, ца+ - 1150 в. В качестве горючего для горелки использовали воздушно-пропановую смесь? Давление пропана было 17-20 мм водного столба, воздуха - Ч атмі Время регистрации пересчетным прибором составляло I Расчет концентраций ионов в пробе проводили методом ограничивающих растворов, т.е. как в люциферин-люциферазном методе последовательно получали отсчеты исследуемой пробы и двух стандартных растворов, один из которых дает больший, а другой меньший отсчет по сравнению с отсчетом для раствора поправки на сахарозу
Ранее было показано ( Gerhardt, Beevers , 1969), что присутствие в растворе сахарозы мешает точному измерению со держания белка методом Лоури. При низких концентрациях белка в растворе она дает ложное увеличение, при высоких концентра циях снижает действительную величину поглощения света. Опре » деляя количество белка во фракции плазматических мембран учитывали присутствие сахарозы, так как выделение данной фракции велось при довольно значительных её концентрациях (500 мМ в среде гомогенизации)1; Учет проводился в построении калибровочного графика. Стандартные растворы белка (0ь025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 мг/мл) готовили, растворяя бычий сывороточный альбумин не в воде или растворе масі , а в растворе сахарозы конечной концентрации 500 мМт; Остальные процедуры определения белка проводились по широко распространенным прописям метода Лоури. Проведенные до сих пор исследования по изучению АТФазной активности проводящих тканей высших растений были выполнены на недостаточно очищенных фракциях плазматических мембран или даже на гомогенатах этих тканей С Sabnis, Hart , 1974$ Боулинг и др., 1972). Поэтому нам для изучения транспортных АТБаз во фракции изолированных плазматических мембран клеток флоэмы борщевика, необходимо было, прежде всего, получить эту фракцию и установить, в какой мере она обогащена плазматическими мемб -ранами,
В настоящее время наиболее распространен метод получения фракции изолированных плазматических мембран клеток высших растений из микросомапьной фракции с помощью диффернциального цент -рифугирования. Впервые такое выделение плазматических мембран из тканей лука произвел Морре ( Morr Roiand, Lembil97D). Последующая более тщательная разработка этого метода была проведена Леонардом и Ходжесом ( Leonard, Hodges , 1973) Они выделяли из тканей корней злаковых фракций на б0«70 обогащен » ные плазматическими мембранами. Позднее был предложен другой метод выделения плазмалеммы растительных клеток . из фракции клеточных стенок (Верховская, Куркова, 1980).
АТФ-зависимый транспорт К+ и в везикулах плазматических мембран клеток флоэмы борщевика при рН 6,5
Предположение о том,, что этот белок как-то "замурован" в мембране, и поэтому на него нельзя воздействовать олиго-мицином после исследований Комозинского и Масловского (Komoszynski, Maslowski , 1981) отпадает. Эти исследователи, работая с АТФазой проростков кукурузы, показали, что солюбилизированная и очищенная АТФаза не обладает чувствительностью к олигомицину. Интересно в связи с этим отметить, что солюбилизированная АТФаза теряет также чувствительность К ДЦКД С Komoszynski, Maslowski , 198I), Т.е., вероятно, при солюбилизации разрушается Н+-проводящий канал, блокированием которого объясняется ингибирующий эффект ДЦКД. АТФаза с аналогичными свойствами, а именно: нечувстви тельная к олигомицину, но ингибируемая ДЦКД, обнаружена в плазматических мембранах некоторых бактериальных клеток, например Micrococcus lysodecticus ( Mileykovskaya et.al. 1970) И E. coli (Kobayashi, Auraku , 1974), дрожжевых грибов Saccharomyces cerevisiae ( Serrano , 1978) И Candida tropicalis (Blasco, Chapuis, Giordani ,1981) И клеток Ueurospora crassa ( Bovraianfet.al. , 1978). На основании этого можно заключить, что А Шаза плазматических мембран клеток высших растений ближе по свойствам к АТФазам плазмалеммы дрожжевых клеток и некоторых бактерий, чем к АТФазам митохондрий.
Нечувствительность АТазного фермента плазмалеммы клеток флоэмы борщевика к олигомицину также дополнительно свидетельствует о чистоте полученной фракции везикул плазматических мембран, точнее об отсутствии в ней фрагментов мембран митохондрий, содержащих олигомицин-чувствительную АІФазу-і АТаза плазматических мембран клеток флоэмы борщевика с оптимумом рН 6,0, казалось бы, проявляет некоторые черты сходства с К+ стимулируемой АТФазой, впервые обнаруженной и описанной в плазмалемме корней овса ( Leonard, Hodges, 1973). Она выявлялась при наличии в инкубационной среде ионов К+ и Mg24, ингибировалась ДЦКД и не подвергалась действию олигомицина. Но при исследовании отношения АТФазы с оптимумом рН 6,0 к действию различных одновалентных катионов был обнаружен эффект, несколько отличный от того, который наблюдался многими исследователями. Так в опытах Ходже-са, Леонарда И др. ( Hodges et.al. » 1972,Leonard, Hotchkiss , 1976, Sze , Ї980) АТШаза, которая ингибировалась ДЦКД, наиболее сильно активировалась ионами Е+. В наших экспериментах сопоставление действия ионов К+, ш+і Ж. + и Li+ показало, что все эти ионы вызывали сравнимый эффект в стимуляции АТазной активности плазматических мембран клеток флоэмы борщевика при рН 6,0 (рис. 23). Для опытов использовали диализованные мембраны, т.е. по возможности устраняли действие катионов, которые заключались при разрушении растительной ткани внутрь везикул в процессе гомогенизации. Диализ проводили в течение 12-15 часов против деиони-зированной воды. Результаты этих экспериментов не позволяют назвать обнаруженную АТФазу с оптимумом рН 6,0 К+ стимулиру-емой, поскольку она оказалась неспецифичной к действию одновалентных катионов. Аналогичное действие одновалентных катионов К+, На+, ш +, Rb+, cs+» Li+ в форме хоридсв было отмечено при исследовании АТФазной активности мембранной фракции из этиолированных эпикотилей гороха (Pierce, Hendrix , 80).
Таким образом, АТ&аза с оптимумом рН 6,0 ингибирова-лась ДЦКДі но не подавлялась строфантином-К и олигомицином и проявляла неспецифичность к действию одновалентных катионов.
Ингибиторный анализ второго пика АТФазиой активности проводили аналогичным образом, но при значении рН 6,5. Как видно из результатов этих экспериментов, представленных на рис. 24, АТФаза с оптимумом рН 6,5 ингибировалась только строфантином К. Ни ДЩД, ни олигомицин на нее не действовали. Этот факт указывает на некоторую аналогию данной АТЖазы с Na+#K АТФазой животных клеток, но аналогию далеко неполную, так как последняя ингибируется как ДЕЩ (Лишко, Колчинская, Сметана, 1972, Лишко, 1977), так и олигомицином ( Robinson 19 71). Действие ДЕЩ на иа+,К+-АТФазу плазмалеммы животных клеток объясняют тем, что молекулы этого вещества, обладая липофильными свойствами, могут проникать через гидрофобные структуры, окружающие активный центр иа,К АТазы, и взаи модействовать с карбоксильной группой, находящейся в акцеп торном центре фермента (Лишко, 1977) . Воздействием на гидро фобное окружение Са-связывающего центра объясняют также ин гибирующее действие ДЕЩ на Са-АТазу саркоплазматического ретикулума ( pick, Racker 1979). Если предположить, что обнаруженная АЗФаза плазмалеммы клеток флоэмы борщевика с оп тимумом рН 6у5 аналогична по своим свойствам Na ,К+-АТазе животных клеток, то нечувствительность её к ДІЩ, вероятно, можно объяснить наличием более сильных гидрофобных связей вокруг данной АТФазы.
