Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Симбиозы высших растений и цианобактерии 12
1.1. Синцианозы различных таксономических групп высших растений 13
1.2. Общая характеристика синцианозов высших растений 18
1.3. Клеточная дифференциация цианобактерий 21
1.3.1. Гормогонии 22
1.3.2. Гетероцисты 27
1.3.3. Акинеты 33
1.3.4. Вегетативные клетки 36
1.4. Морфофизиологические модификации цианобионтов 42
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 45
2.1. Объекты экспериментальных исследований 45
2.2. Методы исследования 48
2.2.1. Модельные системы 48
2.2.2. Определение биосинтетической активности растительных партнеров 51
2.2.3. Микроскопическое исследование 52
2.2.4. Определение физиологической активности цианобактерий 53
ГЛАВА 3. Смешанные культуры партнеров разных видов и уровней организации 56
3.1. Рост и жизнеспособность партнеров в смешанных суспензионных культурах 57
3.2. Рост и жизнеспособность партнеров в смешанных каллусных культурах и растениях, инокулированных цианобактериями 69
3.3. Пространственная интеграция партнеров в смешанных культурах 80
3.3.1. Клеточная адгезия 80
3.3.2. Анатомическая организация 83
3.4. Влияние цианобактерий на морфогенные процессы растительных партнеров 101
3.5. Биосинтетическая активность клеток и тканей при взаимодействии с цианобактериями 105
3.6. Ассоциативные взаимодействия растительных и цианобактериальных партнеров (Обсуждение результатов) 120
ГЛАВА 4. Влияние растительных партнеров на формирование и таксис гормогониев цианобактерии 124
4.1. Сравнение штаммов цианобактерий по способности дифференцировать гормогонии 124
4.2. Формирование гормогониев при взаимодействии с растительными партнерами 128
4.3. Таксис гормогониев при взаимодействии с растительными партнерами 133
4.4. Комплексность воздействия растительного партнера 135
4.5. Выводы и их обсуждение 139
ГЛАВА 5. Влияние растительных партнеров на цианобактериальную систему регуляции ассимиляции азота 146
5.1. Формирование гетероцист 148
5.2. Накопление резервных полимеров 150
5.3. Деградация цианофицина 162
5.4. Дифференциация гетероцист при высоком внутриклеточном содержании цианофицина 166
5.5. Анализ динамики расходования цианофицина 167
5.6. Выводы и их обсуждение 170
ГЛАВА 6. Гетероморфизм цианобактерий, индуцированный растительным партнером 175
6.1. Гетероморфизм цианобактерий разных видов 175
6.1.1. Характеристика чистых культур 176
6.1.2. Характеристика монокультур 182
6.1.3. Характеристика смешанных культур 184
6.2. Формы с редуцированной клеточной стенкой 196
6.3. Гигантские клеточные формы 203
6.4. Механизмы гетероморфных изменений 212
6.4.1. Изменения структуры пептидогликана. 212
6.4.2. Особенности клеточного деления 215
6.5. Выводы и их обсуждение 225
ГЛАВА 7. Коммуникация пространственно разделенных партнеров 230
Заключение 235
Выводы 241
Список цитированной литературы 243
- Общая характеристика синцианозов высших растений
- Определение биосинтетической активности растительных партнеров
- Пространственная интеграция партнеров в смешанных культурах
- Формирование гормогониев при взаимодействии с растительными партнерами
Введение к работе
Актуальность проблемы. Развитие современной биологии ознаменовано, с одной стороны, осознанием значимости биологического разнообразия в устойчивости развития жизни на Земле, а с другой стороны, пониманием ограниченности представлений человечества о широте самого биологического разнообразия. Львиная доля «незнакомцев», конечно, относится к миру прокариот. Другим, не иссякшим до настоящего времени, источником «новых» представителей биосферы Земли является открытие ранее неизвестных симбиозов и, возможно, их возникновение de novo или экспериментальное создание. Симбиозы все чаще рассматриваются не только как способ совместного существования организмов разных видов, но и как особые формы жизни, в которых комбинация разнородных компонентов преобразуется в интегрированную систему, имеющую собственную уникальную морфологию и анатомию, физиологию и экологию [Sapp, 1994; Baumann, 1998; Головлев, 2000 и др.]. Значение симбиозов в эволюции жизни, в частности, в происхождении эукариот уже неоспоримо [Margulis, 1998; Sugi-ura, 1999; Raven, 2002 а, б]. Кроме того, непрерывность существования жизни на Земле в целом рассматривается, как следствие устойчивой способности организмов формировать симбиозы, которые являются скорее нормой, чем исключением для различных биоценозов [Маргелис, 1983; Zook, 1994; Osborne, Bergman, 2002].
Среди известных симбиозов особое положение занимают синцианозы, т.е. симбиозы цианобактерий с протистами, животными, грибами и растениями [Rai, 1990; Schenk, 1992; Rai et al., 2000; 2002]. Основанием для этого служат филогенетическое разнообразие макросимбионтов, структурно-функциональная пластичность микросимбионтов, сочетающих способность к фотоавтотрофии и диазотрофии, многообразия сред обитания и, наконец, древность происхождения синцианозов. За последнюю четверть века синцианозы из странных и редких явлений природы переместились в разряд важнейших повсеместно распространенных компонентов биосферы. С открытием морских симбиозов цианобактерий с диатомовыми водорослями синцианозам отводится роль основного компонента глобальной биологической азотфиксации [Carpenter, Janson, 2000; Rai et al., 2002; Carpenter, 2002]. Хотя некоторые из симбиозов цианобактерий с высшими растениями, как феномен, известны с конца 19 века [Reinke, 1872; Leitgeb, 1878; Wandner, 1878], а синцианоз папоротника Azolla столетиями используется в практической деятельности человека, многие аспекты симбиогенеза остаются не выясненными.
5 Изучение растительных синцианозов, начавшееся с флористического описания и попыток идентифицировать компоненты и понять их роль в системе, столкнулось со сложностями, обусловленными тем, что в интактном симбиозе физиолого-морфологические свойства микросимбионта, в том числе, служащие критериями его таксономического положения, не соответствуют таковым при развитии цианобактерий в свободноживущем состоянии. Кроме того, не всегда удается разделение партнеров. Исследование симбиозов in situ не позволяло также ответить на вопросы о том, какие свойства макро- и микросимбионтов важны для формирования симбиотических систем, что необходимо и достаточно для эффективного симбиогенеза, каковы специфичность взаимодействия партнеров, их сенсорно-сигнальные системы и пути интеграции метаболических процессов исходных организмов при формировании ими функциональных симбиотических систем.
Исследование в этих направлениях требовало разработки подходов, которые позволили бы применить современный арсенал молекулярных, генетических и физиологических методов для выяснения механизмов, задействованных в создании и поддержании симбиозов как единой биологической системы, и изучения факторов, влияющих на симбиогенез. Такими экспериментальными подходами стали: 1) разделение симбиозов на составляющие компоненты и исследование изолированных симбионтов в лабораторных условиях; 2) реконструирование симбиозов с использованием исходных партнеров (ресинтез) или с заменой одного из них на организм другого вида (штамма);
моделирование in vitro разных этапов взаимодействия растений и цианобактерий и
получение искусственных ассоциаций, партнерами в которых могут выступать и не симбиотрофные по происхождению организмы.
Первые удачные попытки дезинтеграции и реконструирования природных симбиозов цианобактерий с талломными мхами [Ridgway, 1967; Rodgers, Stewart, 1977] и покрытосеменными рода Gunnera [Silvester, McNamara, 1976] показали перспективность и широту потенциальных возможностей таких методических приемов. Впоследствии эти подходы стали базовыми в большинстве исследований структуры пищевых связей партнеров и обмена между ними соединениями углерода и азота, генетического разнообразия симбиотически компетентных цианобактерий и специфичности взаимодействия партнеров, регуляции метаболической активности цианобионта, его клеточной дифференциации и генных систем, активируемых в симбиозе и т.д. [Rai, 1990; Bergman et al., 1996; Meeks, 1998; Meeks et al., 1999; Rai et al., 2000; 2002; Meeks, Elhai, 2002 и др.]. Сравнение искусственных ассоциаций, полученных в лабораторных условиях через этап смешанного культивирования цианобактерий с растительными объек-
тами разного уровня организации (выращиваемые in vitro изолированные протопласты, клетки, ткани, органы, растения-регенеранты и целые растения), с природными син-цианозами показало, что коадаптационные изменения партнеров в этих системах аналогичны [Корженевская и др., 1989; Корженевская, 1990; Gusev, Korzhenevskaya, 1990; Korzhenevskaya et al., 1993]. Это позволило более смело применять методы смешанных культур для моделирования отдельных этапов взаимодействия партнеров и выявления закономерностей формирования и жизнедеятельности синцианозов [Gusev et al., 2002; Rai, Bergman, 2002], а также послужило свидетельством корректности использования для создания жизнеспособных искусственных синцианозов широкого круга организмов, включая тех, которые самостоятельно не реализовали в процессе эволюции свои потенциальные способности к формированию симбиотических систем.
Изучение физиолого-морфологических модификаций цианобионтов в процессе формирования и жизнедеятельности синцианозов поставило вопрос о том, сами ли цианобактерии адаптируют свой метаболизм к новым условиям существования в организме макросимбионта, или эти изменения вызваны воздействием (возможно, однонаправленным) растительного партнера [Bergman et al., 1996; Meeks, 1998; Rai et al., 2000; Meeks, Elhai, 2002]. В исключительном большинстве исследований проявление изменений цианобионта в составе симбиоза оценивается при сравнении с характеристиками изолированных или апосимбиотических цианобактерии, растущих в оптимальных условиях, хотя более информативным такое сравнение было бы в случае создания для цианобактерии условий питания и среды, аналогичных таковым в симбиотических тканях. Осуществить такой прием до некоторой степени удается при моделировании взаимодействий партнеров [Корженевская, 1990; Gusev, Korzhenevskaya, 1990; Korzhenevskaya et al, 1993; Gusev et al., 2002].
Таким образом, очевидно, что изучение симбиозов относится к ряду актуальных современных биологических проблем, а применение экспериментальных подходов, включая разработку и использование различных модельных систем, является важнейшим направлением в этой области исследований. Кроме того, попытки получения новых симбиозов растений с азотфиксирующими микроорганизмами, и особенно с циа-нобактериями, актуальны в связи с проблемой повышения доли биологического азота в питании растений как экономически выгодного и экологически чистого источника азота [Gusev, Korzhenevskaya, 1990; Korzhenevskaya et al., 1993; Rai et al., 2000; Gusev et al., 2002; Rai, Bergman, 2002].
Цель и задачи исследования. Работа посвящена изучению физиологии симбиозов высших растений с цианобактериями. Основная цель работы - оценка роли расти-
7 тельных партнеров разных видов во возникновении и интенсивности проявления изменений физиолого-морфологических характеристик микросимбионта, обнаруживающихся в процессе формирования и жизнедеятельности природных и модельных син-цианозов.
Задачи исследования:
1). Проверка способности к сосуществованию партнеров разных видов и исследование особенности их физиологии при взаимодействии.
2). Сравнительное изучение пространственной интеграции партнеров в природных синцианозах и искусственных ассоциациях.
3). Изучение влияния растений, их культивируемых клеток и тканей на формирование и таксис гормогониев цианобактерий, а также оценка сопряженности этих процессов с эффективностью формирования ассоциаций.
4). Изучение участия растительных партнеров разных видов в регуляции ассимиляции азота ассоциациями, в осуществлении цианобактериями функции азотфикси-рующего компонента системы, включая процессы воспроизводства и клеточной дифференциации микросимбионта.
5). Выявление возможности коммуникации пространственно разделенных партнеров путем обмена экзометаболитами.
6). Оценка последовательности и пространственно-временной координации мор-фофизиологических изменений партнеров на разных этапах развития природных син-цианозов и искусственных ассоциаций.
Научная новизна работы. В ходе работы изучена способность к совместному росту 13 видов растительных партнеров, имеющих разный уровень организации (от культивируемых клеток и тканей до интактных растений) с 10 штаммами 8 видов сво-бодноживущих цианобактерий и 4 штаммами цианобактерий, изолированных из природных синцианозов. Скрининг проведен в 73 парах партнеров. Созданы экспериментальные ассоциации со сбалансированным ростом структурно интегрированных партнеров. Получены новые данные о жизнеспособности, росте, метаболической активности, биосинтезе видоспецифических продуктов, морфогенезе и клеточной дифференциации растительных партнеров и цианобактерий при их взаимодействии.
Впервые показано, что растительный партнер оказывает комплексное воздействие на формирование и ориентированное распространение подвижных трихомов цианобактерий (гормогониев). Установлено, что на дифференциацию гормогониев, с одной стороны, и их таксис, с другой стороны, оказывают разные по химической природе и степени специфичности факторы растительного происхождения. Впервые продемонст-
8 рировано, что при взаимодействии организмов, формирующих стабильные ассоциации, растительный партнер продуцирует факторы как стимулирующие, так и ингибирующие дифференциацию гормогониев, а также факторы их положительного и отрицательного таксиса. Попеременное проявление активности каждого из этих факторов зависит от физиологического статуса растительного объекта и условий инкубации (состав среды, фоторежим, исходное расстояние между партнерами). Это позволяет определить ткань-мишень растительного партнера, локализовать и ограничить продолжительность потенциального инфицирования цианобактериями. Индукция растительным партнером положительного таксиса цианобактерий — обязательное условие формирования сим-биотических систем.
При сравнительном изучении пространственной интеграции партнеров разных видов впервые описано формирование в экспериментальных ассоциациях новых морфологических структур с инкорпорированными в растительные ткани цианобактериями. Тип организации таких структур в виде смешанных агрегатов зональной организации и внутритканевых «вместилищ» зависит от вида растительного партнера. Цианобактерий влияют на морфогенные процессы в растении, в том числе, ингибируют дифференциацию хлоропластов в окружающих клетках партнера и стимулируют пролиферацию растительных клеток, вызывают изменение их биосинтетической активности (накопление стеринов, антоцианов, стероидных и индолиновых алкалоидов).
Впервые получены свидетельства индукции растительным партнером усиления гетероморфизма цианобактерий вплоть до образования форм несбалансированного роста и L-форм, а также сопряженности этого явления с сохранением жизнеспособности популяции цианобактерий в ассоциациях. Впервые описано формирование цианобактериями под влиянием растительного партнера гигантских клеточных форм и продукция ими ультрамикроформ, подобных элементарным телам. Продемонстрировано, что механизмами вызванных растительным партнером гетероморфных изменений ассоциированных цианобактерий являются лизис пептидогликана клеточной стенки, модификация его синтеза и дезорганизация клеточного деления (торможение цитокинеза, нарушение баланса роста и деления клеток, повышение частоты асимметричных и аномальных делений, нарушение функционирования септального сократительного комплекса).
Впервые показано, что растительный партнер способен стимулировать потребление цианобактериями экзогенного связанного азота и накапливать его внутриклеточ-но в виде цианофицина, а также влиять на скорость гидролиза цианофицина и индуцировать экстраординарную дифференциацию гетероцист и азотфиксирующую актив-
9 ность при повышенном уровне внутриклеточного азота в вегетативных клетках микропартнера, т.е. игнорируя цианобактериальную сенсорно-сигнальную систему «азотной недостаточности». Влияние растительного партнера на азотный метаболизм цианобак-терий видоспецифично и зависит от стадии и условий взаимодействия с ними. Созданы экспериментальные модели, демонстрирующие формирование интегрированной системы азотного гомеостаза, в которых выявлена координация по времени проявления интенсификации синтеза (накопления) растительными клетками азотсодержащих соединений с индукцией экстраординарной дифференциации гетероцист и повышением скорости гидролиза цианофицина цианобактериями.
Показано, что при пространственном разделении партнеров между ними устанавливается коммуникация путем обмена экзоцеллюлярными агентами, диффундирующими в агаризованной или жидкой, но не воздушной среде. При этом действие растительного партнера не ограничивается регуляцией формирования гормогониев и индукцией их таксиса, а включает влияние на ассимиляцию азота и гетероморфные изменения цианобактерий, что установлено впервые.
Положения, выносимые на защиту. На основании анализа собственных и литературных данных о формировании и жизнедеятельности природных и искусственных растительных синцианозов можно заключить:
синцианозы представляют собой интегрированную форму жизни, в которой происходит формирование не только устойчивых пищевых связей партнеров, но и объединенных сенсорно-сигнальных систем, управляющих жизнедеятельностью симбиоза в целом;
в синцианозах растительный партнер, инкорпорируя в своих тканях микросимбионта, помимо выполнения общеизвестной функции фотосинтезирующего компонента, осуществляет контроль роста и стратегии клеточной дифференциации ассоциированных цианобактерий;
осуществление растительным партнером диспетчерской функции достигается посредством продукции внеклеточных агентов, спектр и количество которых может изменяться как в зависимости от вида (штамма) и физиологического статуса растения (его клеток и тканей), так и вследствие влияния цианобактерий;
ключевое условие образования эффективного диазотрофного симбиоза - формирование интегрированной системы азотного гомеостаза, в которой растительный партнер исполняет роль сенсорно-сигнального компонента, а цианобактерий - компонента, реализующего физиологический ответ на сигнал об азотном статусе системы че-
10 рез аккумуляцию связанного азота или фиксацию молекулярного азота и гидролиз резервных азотсодержащих полимеров;
5) контроль роста микросимбионта растительным партнером включает последовательную смену стимуляции деления клеток цианобактерий, увеличения частоты дифференциации неспособных к репродукции гетероцист, торможения цитокинеза и трансформацию части вегетативных клеток в L-формы.
Практическая значимость. Полученные в рамках работы данные, существенно расширяющие представления о сложном характере взаимодействий цианобактерий и растений, способствуют, с одной стороны, пониманию закономерностей симбиогенеза, включая механизмы взаиморегуляции физиологии партнеров, а с другой стороны, позволяют оценить индивидуальные особенности синцианозов с участием растений разных видов. Это, в свою очередь, содействует прогрессу в области создания симбиоти-ческих ассоциаций ключевых сельскохозяйственных культур с азотфиксирующими микроорганизмами и, особенно, цианобактериями.
Результаты работы внедрены в систему биологического образования. В рамках учебного плана на Биологическом факультете МГУ на их основе разработаны задачи большого практикума и летней практики по природным и модельным симбиозам, которые преподаются, начиная с 1986 года. Полученные данные используются также в курсах лекций «Симбиологии», «Клеточная физиология» и «Цитология микроорганизмов» (кафедра клеточной физиологии и иммунологии, кафедра физиологии микроорганизмов, кафедра микробиологии). Результаты исследований последнего десятилетия суммированы в главе «Artificial cyanobacterium-plant symbioses», написанной в соавторстве с М.В. Гусевым, О.И. Баулиной, Е.С. Лобаковой и Т.Г. Корженевской, коллективной монографии «Cyanobacteria in Symbiosis» (Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 2002). Издание предназначенно для научных работников и обучения в области растительно-микробных взаимодействий и биологической азотфиксации.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на 42 научных конференциях, среди которых: VI Европейское рабочее совещание по клеточным циклам (Прага, 1983); IV Всесоюзная конференция «Культура клеток растений и биотехнология» (Кишинев, 1983); Всесоюзное совещание «Цитология микроорганизмов» (Пущино, 1984); VII Съезд Всесоюзного микробиологического общества «Достижения микробиологии - практике» (Алма-Ата, 1985); Семинар стран-членов СЭВ «Клеточные и генные технологии для зерновых злаков» (Краснодар, 1988); VI Всесоюзный симпозиум «Ультраструктура растений» (Киев, 1988); Международная конференция «Биология культивируемых клеток и биотехнология» (Новосибирск, 1988); Все-
союзное совещание «Молекулярные и генетические механизмы взаимодействия микроорганизмов с растениями» (Пущино, 1988); Всесоюзная конференция «Регуляция микробного метаболизма» (Пущино, 1989); III Всесоюзная конференция «Биосинтез целлюлозы и других компонентов клеточной стенки» (Казань, 1990); VII Международный конгресс «Культура растительных тканей и клеток» (Амстердам, 1990); VII Международный симпозиум по фотосинтезирующим прокариотам (Амхерст, Массачусетс, 1991); Международный конгресс по симбиозу (Иерусалим, 1991); I-IV Всесоюзные планово-отчетные конференции по направлению «Генная и клеточная инженерия» (Москва, 1991-1994); VIII Общеевропейский симпозиум по биологической азотфикса-ции «Азотфиксация-92» (Саратов, 1992); Международная конференция «Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии» (Москва, 1998); III Международный конгресс по симбиозу (Марбург, 2000); Всесоюзная конференция по развитию концепции микробной экологии в XXI веке (Москва, 2000); Международная научная конференция «Автотрофные микроорганизмы: К 75-летию со дня рож. акад. РАН Е.Н. Кондратьевой» (Москва, 2000); Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках» (Санкт-Петербург, 2001); III Съезд Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), Всероссийская научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003); XXI Международный конгресс по молекулярным растительно-микробным взаимодействиям (Санкт-Петербург, 2003); VIII Международная конференция «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003); V Всероссийский Съезд Общества физиологов растений России и Международная конференция «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003). Материалы диссертации докладывались также на научных семинарах Отделения фототрофных микроорганизмов Института микробиологии АН ЧССР (Прага, Тржебонь, 1982-1983), секции Биологии Берлинского Гум-больдтского университета (Берлин, 1994), на заседаниях нескольких кафедр Биологического факультета МГУ, а также экспонировались на выставках (Москва, ВДНХ, 1989; Берлин, 1993).
Общая характеристика синцианозов высших растений
Функциональные свойства компонентов. Во всех синцианозах высших растений между доминантными партнерами осуществляется обмен азот- и углеродсодержащими метаболитами [Stewart et al., 1983; Rai, 1990; Schenk, 1992; Adams, 2000 a; Rai et al., 2000; 2002 и др.]. Цианобактериальный партнер, локализуясь в тканях растения, фотосинтетиче-ски мало активен или полностью теряет способность к фотосинтезу, но реализует функцию диазотрофного компонента системы, обеспечивая связанным азотом и себя, и растение-хозяина. Необходимые для азотфиксации субстраты у свободноживущих цианобакте-рий поставляются в гетероцисты, специализированные клетки, осуществляющие фиксацию молекулярного азота, из фотосинтезирующих вегетативных клеток [Wolk et al., 1994]. В синцианозах затраты на азотфиксацию компенсируются растением, обеспечивающим цианобионта органическими соединениями углерода, преимущественно в виде сахарозы или фруктозы. В большинстве синцианозов основная форма передачи связанного азота аммоний, но в синцианозах саговниковых цианобионты продуцируют связанный азот в виде цитрулина и глутамина в симбиозах с Macrozamia, Lepidozamia и Encephalartos (сем. Zamiaceae) или в виде глутамина и небольшого количества глутаминовой кислоты в симбиозах с Bowenia (сем. Boweniaceae) и с Cycas (сем. Cycadaceae) [Pate et al., 1988; Costa, Lindblad, 2002; Lindblad, Costa, 2002].
Структурно-морфологические характеристики синцианозов. В синцианозах цианобактерии локализуются внутри тканей растительного партнера [Stewart et al., 1983; Rai, 1990; Schenk, 1992; Adams, 2000 a; Rai et al., 2000; 2002 и др.]. У печеночников цианобактерии оккупируют специфические сферические структуры (ушки) на нижней стороне таллома, формирующиеся при гипертрофированном разрастании талломных волосков [Ki-mura, Nakano, 1990; Горелова и др., 1996 б и др.] (рис. 3). У антоцеротовых цианобактерии развиваются внутри имеющих пору с вентральной стороны таллома слизистых полостей, филогенетически подобных подустьичному пространству [Duckett et al., 1977]. У папоротников цианобионт локализуется в полостях, формируемых верхними долями листьев [Peters, Calvert, 1983 и др.]. В синцианозах саговниковых цианобактерии формируют локальную зону в кортикальной паренхиме апогеотропных (кораллоидных) корней [Ahern, Staff, 1994 и др.]. У гуннер цианобактерии заселяют папилозные слизистые стеблевые железы, формирующиеся в основании каждого листа [Silvester, MacNamara, 1976; Bonnett, Silvester, 1981; Bonnett, 1990].
В большинстве синцианозов цианобионты локализуются в межклеточных пространствах растений а в симбиозах с гуннерами - внутри клеток в симбиовакуолях. Растительные структуры, заселяемые цианобактериями, существуют и в отсутствии цианобионтов и их образование генетически детерминировано. Однако при формировании синцианозов происходит их довольно существенная модификация, специфичная для симбиотического состояния [Nathanielsz, Staff, 1975 б; Peters et al., 1978; Rasmussen et al., 1994; Ridgeway, 1967; Rodgers, Stewart, 1977; Duckett et al., 1977; Lindblad, Bergman, 1985; Uheda, 1986; Ki-mura, Nakano, 1990; Горелова и др., 1996 и др.]. Это выражается в следующем: 1) в результате локальной активизации пролиферации растительных клеток увеличивается размер структур и их внутреннее пространство; 2) в полостях накапливаются полисахаридные слизи, в синтезе которых, как предполагается, могут участвовать все компоненты синцианозов; 3) происходит формирование пронизывающих колонии цианобионтов специализированных растительных клеток в виде простых и ветвящихся волосков или регулярно рас положенных вытянутых транспортных клеток, что обеспечивает увеличение контактирующих поверхностей и способствует эффективности обмена питательными веществами между партнерами (см. главу 3).Микроэлектродные измерения показали, что среда симбиотических полостей разных синцианозов различается по насыщению молекулярным кислородом: в кораллоидных корнях саговника Cycas revoluta высокое содержание кислорода [Canini, Grilli Caiola, 1993], в симбиотических полостях Azolla filiculoides оно несколько снижение (до 83% относительно атмосферного) [Grilli Caiola et al., 1989], а у роголистника Anthoceros punctatus - очень низкое (почти анаэробность) [Campbell, Meeks, 1992]. Природа этого явления не ясна, но очевидно, что нет корреляции содержания кислорода в симбиотических полостях и степенью их изолированности от окружающей атмосферы, так как полости A.punctatus сохра няют открытую пору, а зона локализации цианобионтов в кораллоидных корнях саговников отделена от внешней среды перидермой и несколькими рядами клеток кортикальной паренхимы. В отличие от бобово-ризобиального симбиоза для растительных синцианозов нет никаких данных о существовании продуцируемого растением гемоглобин-подобного белка. В симбиотических полостях, за исключением папоротников, отсутствуют ассоциативные микроорганизмы, которые могли бы поглощать кислород. Хотя у многих штаммов Nostoc обнаружен цианоглобин, гемопротеин с высоким сродством к кислороду, у симбиотических штаммов, подвергнутых проверке, он отсутствует [Hill et al., 1996].Важной особенностью синцианозов высших растений по сравнению с другими растительными симбиозами является клеточная дифференциация цианобионтов. Последние, претерпевая морфофизиологическую модификацию в составе синцианозов (эти вопросы будут рассмотрены ниже), тем не менее, сохраняют способность формировать все типы клеток, обнаруживающиеся у свободноживущих цианобактерий.
Многие виды нитчатых цианобактерий, в частности Nostoc spp., способны к клеточной дифференциации [Rippka et al., 1979; Castenholz, Waterbury, 1989]. В современной литературе выделяют четыре типа клеток нитчатых цианобактерий: вегетативные клетки, ге-тероцисты, акинеты и гормогониальные клетки [Meeks et al., 1999]. Вегетативные клетки являются основным клеточным типом, самодостаточным при развитии в оптимальных условиях роста. При наличии в среде связанных форм азота Nostoc spp. формируют вегетативные трихомы, состоящие только из вегетативных клеток. Деление последних при достижении критического размера обеспечивает перманентный рост микроорганизма. Длительность существования вегетативной клетки между актами последовательных клеточных делений колеблется от нескольких часов до нескольких недель [Meeks et al., 1999]. При дефиците в среде обитания связанных форм азота в вегетативных трихомах часть вегетативных клеток (обычно менее 10%) дифференцируется в гетероцисты, специализированные клетки, осуществляющие фиксацию молекулярного азота в аэробных условиях роста. Гетероцисты - терминальный тип клеточной дифференциации, неспособный к делению. Время жизни гетероцист составляет обычно не более двух генераций вегетативных клеток. При отклонении условий обитания от оптимальных некоторые, а иногда и все, за исключением гетероцист, клетки вегетативных трихомов могут дифференцироваться в
Определение биосинтетической активности растительных партнеров
Определение содержания стероидных соединений е клетках паслена S.laciniatum проводили спектрофотометрическим методом [Balcar, Zalecka, 1962], модифицированным для данной культуры [Nguyen, 1981]. Экстракцию соединений осуществляли 20% раствором уксусной кислоты в метаноле из доведенной до постоянного веса сухой биомассы. Экстрагированные вещества переводили сначала в хлороформ с добавлением боратного буфера, содержащего 2x10"4 М бромтимолового синего, а затем в 75% раствор серной кислоты в метаноле. Измерение оптической плотности проводили при 310 нм и 575 нм. Количество стероидных соединений рассчитывали по калибровочным кривым, полученным с использованием стандартных растворов соласодина и ланостерина, с которыми осуществляли все манипуляции параллельно с исследуемыми пробами. Определение проводили в Отделении фототрофных микроорганизмов Института микробиологии АН ЧССР совместно с Й. Ржержабеком. Определение содержания стероидных соединений в клетках женьшеня P.ginseng ИФР Ж1 и ИФР Ж2 проводили методом газо-жидкостной хроматографии ацетоновых экстрактов сухой биомассы с внутренним стандартом (16-ацетатдегидропредненолон) при сравнении с модельными образцами для качественной характеристики экстрактов и расчетом площадей пиков для количественного анализа. Определение проводили в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН совместно с А.Г. Лебедевым под руководством В.Н. Паукова. Определение генинов панаксозидов в клетках женьшеня P.ginseng ИФР Ж1 и ИФР Ж2 осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках "SolufoF B системе бензол+метанол (8:2) с проявлением 1 % раствором ванилина. Хроматограф провали соединения, экстрагированные этанолом из сухой биомассы. Предварительно экстракт гидролизовали соляной кислотой, осаждали аммиаком и переводили в хлороформ с последующей очисткой на колонках с силикагелем при элюировании этилацетатом и метанолом. Этилацетатные растворы проб подвергали также газо-жидкостной хроматографии с регистрацией времени удержания: 10 мин для панаксадиола, 19.30 мин для панак-сатриола. Образцы тканей анализировали в
Отделе биологии клетки и биотехнологии Ин статута физиологии растений РАН совместно с О.В. Решетняк под руководством В.Н. Паукова. Определение суммы индолиновых алкалоидов в тканях R.serpentina проводили экстракционно-фотометрическим методом [Волосович и др., 1977]. Соединения экстрагировали из сухой биомассы смесью аммиака и хлороформа с переводом в концентрированную азотную кислоту. Оптическую плотность проб регистрировали при 540 нм и рассчитывали количество алкалоидов по калибровочной кривой, полученной с использованием стандартных растворов аймалина в хлороформе. Качественное определение антоцианов в тканях R.serpentina проводили совместно с О.Б. Чивкуновой по спектрам поглощения (максимумы при 530-535 нм ) метаноль-ной фракции экстрактов сырой биомассы, полученных при экстракции смесью мета-нол+хлороформ (1:1) [Folch et al., 1957], и обратимому изменению цвета метанольных экстрактов при варьировании рН добавлением соляной кислоты или щелочи. Световую микроскопию проводили на прижизненных препаратах без или с применением красителей и контрастирующих веществ (эозин, эритрозин, метиленовый синий, раствор
Люголя, тушь и др.) в зависимости от объекта и целей исследования. Препараты просматривали с использованием светового микроскопа "Leitz Laborlux D" (Ernst Leitz Wetzlar GmbH, Германия) и инвертированного микроскопа "TELAVAL" (Carl Zeiss JENA, Германия). Электронно-микроскопическому изучению подвергали пробы, обработанные стандартно в каждом или в пределах серии экспериментов, как описано ранее [Горелова, 1986; Korzhenevskaya et al., 1993; Баулина и др., 1995]. Для трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) пробы фиксировали 0,5% глютаровым альдегидом и постфиксировали 1% тетраокисью осмия на буфере Миллонига [Millonig, 1961] или 0,1 М какодилатном буфере. Фиксированные пробы обезвоживали в серии растворов этанола возрастающих концентраций. Абсолютный этанол меняли трижды в течение трех часов, последняя его порция была насыщена уранилацетатом. Обезво 53 женный материал заключали в аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца по методу Рейнольдса [Reynolds, 1963] и изучали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100В ("Jeol", Япония). Для выявления кислых полисахаридов применяли контрастирование в процессе фиксации рутениевым красным по методу Люфта [Luft, 1968]. Для выявления гранул гликогена проводили дифференциальное контрастирование серийных ультратонких срезов уранилацетатом и цитратом свинца. Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) фиксированные и обезвоженные пробы из абсолютного этанола переносили в ацетон на ночь, после чего высушивали в критической точке на установке "Dryer НСР-2" (Hitachi). Образцы монтировали на поддерживающие столики и напыляли золотом с палладием на установке "IB-3 Ion Coater" и просматривали в сканирующем электронном микроскопе "Hitachi S-4-5A". Морфометрию клеток цианобактерий и их цитоплазматических структур проводили при просмотре микрофотографий ультратонких срезов не менее 50 случайных клеток каждого морфологического типа одного варианта культивирования с исключением серийных срезов. Размер цианофициновых гранул определяли как средний диаметр гранул, измеренный на срезах 50-250 клеток, одновременно подсчитывали среднее количество гранул на единичном срезе индивидуальной клетки.
Содержание цианофицина в клетке определяли как его суммарный объем, то есть как произведение среднего количества гранул в клетке на средний объем гранулы. Последний рассчитывали, допуская, что форма гранул близка к сферической. Нитрогеназную активность определяли по восстановлению ацетилена в этилен [Hardy et al., 1968], используя газовый хроматограф ЛХМ-8ДМ с водородным плазменно-ионизационным детектором и колонкой, заполненной Porapak Q, газ носитель - азот. Инкубацию образцов проводили в герметичных флаконах при температуре 26±1С и постоянном освещении (750-1000 лк) в течение 24 часов. Поглощение кислорода изучали полярографическим методом в герметичной ячейке с платиновым электродом закрытого типа. Контрольное ингибирование дыхания прово дили при внесении в ячейку, содержащую тестируемую суспензию цианобактерий, 10 мМ гидроксиламина. Количественная оценка формирования и таксиса гормогониев. К началу данного исследования влияние растений на дифференциацию гормогониев учитывали по частоте формирования последних в суспензионных культурах цианобактерий при добавлении в среду инкубации прижизненных выделений, культуральной жидкости или тканевых экстрактов растений. Такой метод исключал взаимодействие партнеров, ограничивая его однонаправленным эффектом растительных метаболитов, и не позволял оценить таксис гормогониев, способных к скольжению по плотным субстратам. Разработанный нами метод учитывает эти ограничения, так как основан на применении совместных культур на агари-зованных средах (рис. 5). Процедура анализа включает: 1) светооптический контроль образования и распространения гормогониев; 2) графическую регистрацию изменения площади и конфигурации распространения цианобактерий по поверхности агаризованной среды; 3) цифровую обработку полученного изображения с использованием установки Videolab-2.1 A (Uni-Export Instruments Ltd. England); 4) статистическую оценку полученных данных.
Пространственная интеграция партнеров в смешанных культурах
Процесс формирования и жизнедеятельность искусственных ассоциаций циано-бактерий с растениями, их клетками и тканями, культивируемыми in vitro, сопряжен с пространственной интеграцией партнеров в формирующуюся de novo морфологически целостную систему нового уровня. Изучение широкого круга ассоциаций выявило две взаимодополняющие тенденции формирования их структуры [Gusev et al., 2002]. Первая - объединение партнеров, вплоть до образования тесных поверхностных контактов клеток. Вторая - компартментация цианобактерий внутри или на поверхности растительного партнера. Компартментацию обеспечивают растительные клеточные стенки и мембраны, а также межклеточный или поверхностный слизистый матрикс, который, как правило, образуется в процессе формирования интегрированной системы.
Пространственное сближение компонентов при получении искусственных ассоциаций в лабораторных условиях часто бывает случайным, например, при перемешивании суспензионных культур, или принудительным при нанесении суспензии цианобактерий на поверхность растительного партнера. Кроме того, в некоторых ассоциациях сближение происходит с помощью образующихся гормогониев (см. главу 4). При последующем культивировании смешанных суспензионных культур, каллусов и целых растений некоторые клетки цианобактерий адгезируют и прочно связываются с растительной клеточной стенкой (рис. 31). Это относится к большинству, но не ко всем изученным видам цианобактерий. Так, например, на клетках P.ginseng ИФР ЖЗ адгезиру-ют A.variabilis АТСС 29413, C.fritschii АТСС 27193, C.elenkinii ВКМ 10, a N.muscorum ВКМ 16, G.alpicola ВКМ 13 и S.aquatilis ВКМ 22 , напротив, не образуют тесных контактов с этим же растительным партнером [Горелова, 1984; 1986 а; Корженевская и др., 1985 а]. Адгезию цианобактерий, очевидно, нельзя назвать строго специфичной в силу перекрестного взаимодействия различных партнеров. A.variabilis АТСС 29413 адгези-рует в смешанных суспензионных культурах не только на клетках P.ginseng ИФР ЖЗ, но и на клетках M.sativa, S. laciniatum и V.faba [Горелова, 1984; 1986 а, б; Горелова и др., 1984,1986 а; Корженевская и др., 1985 а, б]. Кроме того, было показано, что отмывание корней пшеницы или их обработка различными сахарами не изменяли способности Nostoc sp. 2S9B заселять поверхность корня, что также указывает на возможную не специфичность связывания [Gantar et al., 1995]. В то же время, на корнях растений риса, выявлены различия в поверхностной локализации N.muscorum С ALU 281 и N.muscorum С ALU 304 и зависимость адгезии и роста цианобактерий от присутствия в среде различных углеводов [Горелова и др., 1989].
Прикрепление к растительной клеточной стенке может происходить с участием различных поверхностных структур цианобактериальной клетки: липополисахаридной наружной мембраны, чехлов или экстрацеллюлярной слизи (рис. 32), содержащих, как показано контрастированием рутениевым красным, кислые экзополисахариды [Баулина и др. 1989; Korzhenevskaya et al., 1993; Горелова и др., 1996 б]. Согласно существующим представлениям о механизмах взаимного узнавания растений и бактерий приобразовании контактов между поверхностными структурами клеток происходит контактное узнавание партнёров с участием лектинов. Контактное узнавание, наряду с дистанционным, являться одним из этапов в последовательности сенсорно-сигнальных взаимодействий партнеров, обеспечивающих их специфику. Для природных синциано-зов показано, что цианобактерии содержат специфические сахара, пили и, в некоторых случаях, лектины, которые играют роль в узнавании и адгезии на поверхностных структурах совместимого растения-хозяина [Serrano et al., 1999; Rai et al., 2000]. Само наличие адгезии и прочного связывания цианобактерии на поверхности растительных клеток с участием липополисахарида, чехла или экзополисахаридов в искусственных симбиозах не противоречит представлению о действии универсального механизма лек-тин-рецепторного взаимодействия на ранних этапах узнавания совместимых партнеров. В то же время, следует учитывать, что в искусственных системах, где отсутствует эво-люционно сложившаяся схема специфического взаимодействия между партнерами, связывание поверхностных структур партнеров может быть и неспецифической агглютинацией клеток [Gusev et al., 2002].
Пространственная интеграция сопряжена как с адгезией, по крайней мере, некоторых клеток, так и с сопутствующим ей формированием поверхностных колоний, что можно отнести к ранним этапам образования искусственных ассоциативных систем. Последующее пространственное объединение партнеров зависит от их совместимости, от архитектоники и метаболической активности растительных тканей, индивидуальных свойств цианобактерии и может иметь различное структурное проявление.
Формирование гормогониев при взаимодействии с растительными партнерами
Среди испытанных цианобактерий для Nostoc sp. f. Blasia характерно наименьшее распространение гормогониев в совместных культурах с каллусными тканями S.dulcamara и S.nigrum. Хотя дифференциация гормогониев при инкубации на свету происходила, они не удалялись от инокулята. Гормогонии образовывали плоские завит-ки или переплетались между собой (рис. 60). При этом, независимо от возраста партнеров, каллусные ткани S.dulcamara и S.nigrum либо существенно не влияли, либо оказывали слабое ингибирующее действие, задерживая формирование гормогониев примерно на сутки. Положительное воздействие на дифференциацию гормогониев Nostoc sp. f. Blasia в совместных культурах оказывали M.sativa и L.minuscula. Интересно, что каллус люцерны не только стимулировал формирование и распространение гормогониев Nostoc sp. f. Blasia при инкубации на свету, но и индуцировал их дифференциацию в темноте. Это наблюдали при использовании как 2-х недельных, так и 7-ми недельных инокулятов цианобактерий. Совместное культивирование с растениями L.minuscula на свету приводило к увеличению от 1,5 до 2 раз удельной площади распространения гормогониев Nostoc sp. f. Blasia по поверхности агаризованных сред BG-11, BG-11(N-) и L (табл. 14). Растения ряски в совместных культурах статистически значимо (Р 0,05) стимулировали дифференциацию гормогониев и других цианобактерий. Максимальный эффект наблюдали при взаимодействии сформирующих устойчивой ассоциации L.minuscula и N.muscorum CALU 304 на среде BG-11(N-). Аналогичные результаты наблюдали и при взаимодействии N.muscorum CALU 304 с растениями рясок других видов (L.gibba, W.arrhiza).
Стимуляцию образования и распространения гормогониев N.muscorum CALU 304 наблюдали также в совместных культурах с каллусными тканями обоих видов паслена при экспозиции на свету (рис. 61 А). При этом в экспериментах с использованием каллусов в стационарной фазе роста (20-31 сут) величины Ks имели близкие значения. Однако если культуры инкубировали в темноте, стимулирующий эффект S.nigrum был практически таким же, как на свету, а действие S.dulcamara становилось ингибирую-щим (рис. 61 Б). распространение гормогониев (Ks) N.muscorum CALU 304 (А, Б) и N.muscorum ВКМ 16 (В, Г) при инкубации на свету (А, В) и в темноте (Б, Г). Исходное расстояние между партнерами 10 мм (1, 4), 15 мм (2, 5) и 20 мм (3, 6). Длительность инкубации 2 сут, возраст инокулята цианобактерий 1-4 нед. Дифференциация N.muscorum ВКМ 16, как и дифференциация N.muscorum CALU 304, в совместных культурах зависела от вида растительного партнера (рис. 61 В, 61 Г). Каллус S.dulcamara на свету вызывал практически двукратное увеличение образования и распространения гормогониев. В темноте действие S.dulcamara было положительным, но менее эффективным, если использовали 31-суточный каллус. В совместных культурах с S.nigrum уровень Ks N.muscorum ВКМ 16 определялся возрастом растительной ткани при инкубации не только в темноте, но и на свету (рис. 61 В, 61 Г). Средние значения Ks в опытах с 16-суточным каллусом составляли 1,28±0,10 в темноте и 1,58±0,11 на свету, в то время как влияние 31-суточного каллуса не было существенным (Ks и 1).
Дополнительно была определена двухфакторная зависимость Ks N.muscorum CALU 304 и N.muscorum ВКМ 16 от возраста каллуса S.dulcamara и от исходного расстояния между партнерами (рис. 62). Установлено, что в совместных культурах S.dulcamara и N.muscorum ВКМ 16 при инкубации, как на свету, так и в темноте образование и распространение гормогониев не зависело от расстояния между объектами (рис. 62 А, 62 Б). Возраст каллуса имел значение лишь при инкубации в темноте. В совместных культурах S.dulcamara с N.muscorum CALU 304 наблюдали более сложную картину. Так, при культивировании на свету влияние метаболитов не зависело от возраста ткани, а определялось только расстоянием между объектами (рис. 62 В). Стимуляция распространения гормогониев имела два максимума: при взаимодействии объектов на расстоянии 5-9мм и 15-20мм. При культивировании в темноте Ks зависел от фактора возраста каллуса и взаимодействия обоих факторов. Наименьшее ингибирующее влияние растительного партнера наблюдали при максимальном удалении (15-20мм) иноку-лята цианобактерий от каллуса в возрасте 5 сут, а наибольшее - при максимальном удалении от каллуса в возрасте 31 сут (рис. 62 Г).
К сожалению, мы не располагаем численными данными о влиянии в совместных культурах каллуса M.sativa на дифференциацию цианобактерий N.muscorum ВКМ 16. Однако как в суспензионных, так и в каллусных смешанных культурах этих партнеров нами достоверно установлена стимуляция роста N.muscorum ВКМ 16, а при микроско-пировании выявлено массовое формирование гормогониев [Корженевская и др., 1985; Горелова и др., 1988; 1990; Баулинаидр., 1990;Korzhenevskayaet al., 1993]. В целом, можно отметить, что растительные объекты, способные вступать в природе в асссоциации с микроорганизмами (M.sativa и L.tninuscula и другие виды рясок) , в модельных системах более стабильно, чем несимбиотрофные растения (S.dulcamara и мов. Однако стимулирующие образование гормогониев агенты не обладают высокой специфичностью, и их действие не ограничивается кругом компетентных (совместимых) партнеров, взаимодействие которых приводит к формированию устойчивых ассоциаций.
Для оценки ориентированного рапространения гормогониев использован коэффициент Ко. Согласно этому показателю ни один из испытанных растительных партнеров не индуцировал ориентированное движение медленно распространяющихся гормогониев Nostoc sp. f. Blasia. Быстро распространяющиеся штаммы цианобактерий оказались более восприимчивы к воздействию растительных объектов. Так, при икубации совместных культур на свету на средах BG-11 и BG-11(N-) наблюдали положительный таксис A.azollae к растениям L.tninuscula (табл. 14). Гормогонии N.muscorum CALU 304 на среде BG-11(N-) проявляли положительный таксис к 5-суточному каллусу S.dulcamara при инкубации в темноте (Ко = 1,70 ± 0,21) и отрицательный таксис при взаимодействии на той же среде на свету с растениями L.tninuscula (табл. 14). N.muscorum CALU 304 и A.azollae при взаимодействии с растениями W.arrhiza также демонстрировали отрицательный таксис.
Оценка двухфакторной зависимости Ко в совместной культуре S.dulcamara и N.muscorum CALU 304 показала, что расстояние между партнерами не влияло на значение Ко, а возраст каллуса был значим лишь при инкубации в темноте (рис. 63). При этом таксис был положительным к 5-суточному и отрицательным к 31-суточному каллусу. При взаимодействии каллуса S.dulcamara с N.muscorum ВКМ 16 в течение двух
