Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1.Устойчивость растений к недостатку или отсутствию кислорода 12
2.1.1.Морфолого-анатомические приспособления к корневой гипоксии 13
2.1.2.Метаболические приспособления кгипо- и аноксии 14
2.2. Активные формы кислорода 15
2.2.1. Особенности активных форм кислорода и пути их образования 15
2.2.2. Биологическое значение активных форм кислорода 19
2.2.3.Активные формы кислорода в условиях аноксии и постаноксической аэрации 22
2.3.Механизмы защиты от активных форм кислорода у растений 24
2.3.1.Способы снижения образования активных форм кислорода 24
2.3.2.Системы антиоксидантной защиты 25
2.3.2.1.Неферментативная антиоксидантная система 25
2.3.2.2. Роль антиоксидантов при аноксии и постаноксической аэрации 28
2.3.3.Ферментативная антиоксидантная система 30
2.3.3.1.Супероксиддисмутаза 30
2.3.3.2.Каталаза 31
2.3.3.3.Пероксидазы: структура, локализация, функции 32
2.3.3.4.Роль пероксидаз в стрессовых реакциях 46
2.3.3.5. Антиоксидантные ферментные системы при кислородной недостаточности и окислительном стрессе 49
3. Объекты и методы исследования 52
3.1.Растительный материал 52
3.2.Определение продукции супероксидного анион-радикала... 53
З.З.Определение продукции пероксида водорода 54
3.4. Получение гваяколпероксидазы и каталазы клеточной стенки 55
3.5.Экстракция цитоплазматической гваяколпероксидазы и каталазы 56
3.6.Определение активности каталазы 56
3.7. Экстракция и определение активности аскорбат-пероксидазы 57
3.8. Экстракция и определение активности глутатион-пероксидазы 60
3.9.Определение активности гваяколпероксидазы 62
3.10.Определение изоферментного состава пероксидаз 63
4. Результаты 64
4.1.Влияние аноксии и последующей реаэрации на содержание супероксидного анион-радикала в тканях растений 64
4.2.Влияние аноксии и последующей аэрации на содержание пероксида водорода в тканях растений 64
4.3. Влияние аноксии и последующей аэрации на активность каталазы в клеточной стенке и цитоплазме растений 68
4.4.Влияние аноксии и последующей аэрации на активность аскорбатпероксидазы в тканях растений 72
4.5.Влияние аноксии и постаноксической аэрации на активность глутатионпероксидазы в тканях растений 74
4.6.Влияние анаэробиоза и постаноксической аэрации на активность гваяколпероксидазы в клеточной стенке и цитоплазме растений 76
4.7.Действие ингибиторов на активность каталазы и различных пероксидаз 80
4.8.Влияние аноксии и постаноксическои аэрации на изоферментныи состав гваяколпероксидаз 90
5. Обсуждение 96
6. Выводы 111
7. Список литературы 113
- Особенности активных форм кислорода и пути их образования
- Антиоксидантные ферментные системы при кислородной недостаточности и окислительном стрессе
- Экстракция и определение активности аскорбат-пероксидазы
- Влияние аноксии и последующей аэрации на активность каталазы в клеточной стенке и цитоплазме растений
Введение к работе
Живые организмы постоянно испытывают на себе влияние различных факторов окружающей среды. Растения, в силу своего прикрепленного образа жизни, особенно подвержены этим воздействиям. Одним из широко распространенных неблагоприятных факторов является кислородная недостаточность, которая наблюдается при затоплении растений, образовании ледяной корки на поверхности почвы при выращивании озимых злаков, создании асфальтовых покрытий в городах и т.д. С гипоксическим или аноксическим воздействиями тесно связано влияние еще одного неблагоприятного фактора - окислительного стресса, который возникает сразу после действия кислородной недостаточности, когда растения вновь оказываются в условиях нормальной аэрации. В природе окислительный стресс - прямое следствие гипоксии и аноксии, поэтому устойчивые к кислородной недостаточности растения, по-видимому, должны обладать устойчивостью и к этому воздействию.
Постоянное или временное переувлажнение характерно для многих регионов Земли, и в том числе для Северо-Запада России. Подобные условия способствуют возникновению кислородной недостаточности, при этом ограничивается жизнедеятельность представителей дикой флоры и создаются трудности для возделывания сельскохозяйственных культур. Поэтому изучение путей адаптации растений к кислородной недостаточности и последующей реаэрации представляет большой интерес и имеет значительную практическую ценность.
У большинства растений отсутствие кислорода вызывает остановку роста, что характерно, например, для пшеницы. Тем не менее, существуют растения, способные произрастать не только в обедненной кислородом среде, но даже при его полном отсутствии. В первую очередь это гидро- и гигрофитные виды. Многочисленные исследования, направленные на изучение этого феномена, показали, что подобные растения обладают рядом морфолого-анатомических и физиолого-биохимических приспособлений, затрагивающих главным образом дыхательный метаболизм и энергетику клетки (Чиркова, 1988). К адаптивным реакциям этих растений относится синтез аноксических стрессовых белков и перестройки в структуре и функциях мембранных компонентов (Чиркова, 1988). У устойчивых к гипоксии растений может происходить удлинение побегов, в то время как рост корней обычно тормозится. Так, например, при постоянно сменяющихся условиях гипоксии и реаэрации растет рис (Drew, 1997).
В литературе известно большое количество работ, посвященных проблеме окислительного стресса у животных объектов. Это связано с тем, что активные формы кислорода (АФК) в клетках животных участвуют в таких процессах как фагоцитоз, бактерицидные эффекты, различные виды патогенеза при ишемической болезни сердца, лучевом поражении, катаракте, воспалительных процессах и многих других болезнях. Известно, что АФК, образующиеся в период реоксигенации, принимают участие в механизмах программируемой смерти клетки у животных, растений и микроорганизмов (Levine et al.,1996). У растений же этой проблеме до недавнего времени уделялось недостаточное внимание, хотя роль АФК в их мембранных структурах очень велика (Мерзляк, 1989). Влияние реоксигенации на клетки растений после выдерживания их в условиях гипо- и аноксии рассмотрено лишь в нескольких работах (Monk et al., 1987; Van Toai et al.,1991, Biemeltetal., 1998).
Первым шагом в образовании АФК является генерация супероксид-аниона 02 , который представляет собой начальный компонент окислительного каскада. Образующийся супероксид, при помощи супероксиддисмутазы переводится в пероксид водорода (Н2О2), который в настоящее время рассматривается и как компонент сигнальной трансдукции. Однако, вместе с тем, это соединение запускает перекисное окисление липидов, нарушает стабильность мембран, т.е., оказывает повреждающее воздействие на клетку.
Клетки растений располагают многоуровневой системой защиты от повреждающего действия АФК. К ней относятся ферментные системы, предотвращающие образование супероксид-аниона, а также антиоксидантные системы, убирающие продукты одноэлектронного восстановления кислорода. К этой группе помимо супероксиддисмутазы относят каталазу, а также различные виды пероксидаз, среди которых выделяют аскорбат-, глутатион- и гваяколпероксидазы. Гваяколпероксидаза связана с фенольным обменом в клетках растений и способствует функционированию таких процессов как, например, лигнификация клеточной стенки. Аскорбат- и глутатионпероксидазы входят в состав антиоксидантных систем клеток и играют важную роль в разрушении Н202. Таким образом, растительные пероксидазы входят в антиоксидантную систему растений, и, кроме того, гваяколпероксидазы связаны с ростовыми процессами. Исследование антиоксидантных систем при переходе растений от гипо- или аноксии к нормальной аэрации проводились в немногих работах (Чиркова, 1988; Blokhina et al., 2001; Biemelt et al., 1998 и некоторых другие).
Итак, взаимодействие аноксии и окислительного стресса, а также особенности функционирования комплекса защитных антиоксидантных систем у растений, различающихся по устойчивости к недостатку кислорода, остаются почти не исследованными. Поэтому, целью настоящей работы явилось изучение влияния анаэробиоза и последующей реаэрации на продукцию некоторых АФК (супероксид-аниона и пероксида водорода), а также на активность как
цитоплазматических, так и связанных с клеточной стенкой ряда пероксидаз и каталазы, участвующих в разрушении различных пероксидов в проростках пшеницы и риса.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:
1. Определить продукцию супероксидного анион-радикала и пероксида водорода побегами и корнями проростков пшеницы и риса при аноксии и последующей аэрации.
2. Изучить действие аноксии и последующей аэрации на активность каталазы и гваяколпероксидазы в клеточных стенках и цитозоле растений пшеницы и риса.
3. Выяснить влияние анаэробиоза и последующей аэрации на активность аскорбат- и глутатионпероксидаз в проростках пшеницы и риса.
4. С помощью ингибиторов транскрипции, трансляции и везикулярного транспорта изучить возможный вклад этих процессов в изменение активности анализируемых ферментов в условиях аноксии и реаэрации у проростков пшеницы и риса.
5. Определить влияние аноксического и окислительного стресса на изоферментный состав гваяколпероксидаз опытных растений.
6. Сопоставить активность различных форм каталазы и пероксидаз с возможностью детоксикации пероксида водорода и участием в работе антиоксидантной системы.
Научная новизна.
Впервые проанализирована продукция основных АФК (супероксидного анион-радикала и пероксида водорода) у растений, различающихся по устойчивости, в условиях анаэробиоза и
последующей аэрации. Рассмотрен комплекс цитоплазматических и апопластных форм антиоксидантных ферментов в условиях аноксии и реаэрации у растений, контрастных по уровню приспособления к недостатку кислорода. Проведено сопоставление продукции АФК и эффективности работы антиоксидантной энзиматической системы у растений, различающихся по устойчивости. Использование ингибиторного анализа и электрофоретического разделения пероксидаз позволило предположить о связи активации антиоксидантных ферментов с синтезом de novo ряда их изозимов. Полученные данные позволяют заключить, что растение, устойчивое к дефициту кислорода благодаря эффективно работающей антиоксидантной системе, способно лучше противостоять и окислительному стрессу при выходе растения из анаэробной среды в условия аэрации.
Практическая значимость.
Изучение адаптационных механизмов к кислородной недостаточности и окислительному стрессу необходимо для разработки способов выращивания растений на затопляемых почвах, приёмов защиты от повреждения или повышения устойчивости растений, введения в культуру приспособленных к недостатку кислорода растений. Более глубокое представление о механизмах адаптации важно для создания тестовых систем для селекционного отбора устойчивых к затоплению видов и сортов растений, для программирования урожая различающихся по устойчивости к кислородному дефициту растений. Полученные результаты могут быть также использованы как в лекционных курсах, так и практикумах по экологической физиологии растений.
Положения, выносимые на защиту.
• Меньшая интенсивность продукции АФК у растений, контрастных по устойчивости к кислородной недостаточности, в условиях аноксии и постаноксической аэрации находится в прямой зависимости от эффективности работы антиоксидантной системы.
• Отсутствие накопления АФК у устойчивого к гипоксии растения связано с активацией апопластных форм антиоксидантных ферментов, обеспечивающих детоксикацию АФК вне клетки, препятствуя тем самым их проникновению в цитоплазму.
• Растение, устойчивое к кислородной недостаточности обладает способностью противостоять и окислительному стрессу, возникающему при выходе растения из анаэробной среды в условия аэрации.
Особенности активных форм кислорода и пути их образования
При ограничении доступа кислорода к тканям, прежде всего корней, растения пытаются сохранить в тканях его уровень, необходимый для выживания. Показано, что у многих растений происходит утолщение и укорачивание корней, на них становится меньше корневых волосков. Некоторые из них образуют при затоплении поверхностные дополнительные корни (Чиркова, 2002). У представителей болотной флоры в тканях возникают воздухоносные полости - аэренхима. Образование аэренхимы, по которой может поступать в корни кислород, происходит благодаря активации ряда ферментов: пероксидазы, полигалактуроназы, целлюлозо-деградирующих и лизирующих клеточные стенки (Drew, 1997). Повышению активности этих ферментов способствует образующийся в условиях гипоксии этилен. Так, показано, что обработка растений этиленом вызывала экспрессию гена ксилоглюканэндо-трансгликозилазы и образование аэренхимы в корнях растений при затоплении. Важную роль в снабжении корневой системы кислородом играют и листья (Чиркова, 1998).
Таким образом, попытка компенсировать недостаток кислорода в среде, окружающей корни, за счет его транспорта из надземной части оказывается важным способом адаптации растений, особенно при образовании дополнительных морфологических и анатомических приспослоблений. Однако при длительной гипоксии и особенно при аноксии дефицит кислорода становится настолько значительным, что растениям приходится изменять обмен веществ и приспособливаться к функционированию в бескислородной среде, то есть использовать метаболические приспособления (Чиркова, 1988). Метаболические способы адаптации растений к недостатку кислорода весьма разнообразны. Они обспечивают противодействие и репарацию изменений при возвращении в нормальные условия аэрации (у устойчивых растений), либо ведут к необратимым повреждениям вследствие истощения приспособительных возможностей.
Метаболические приспособления могут выражаться или в снижении интенсивности обмена веществ, например, у гигрофитных растений, или в компенсаторных изменениях обмена веществ. Компенсаторные изменения связаны, прежде всего, с трансформацией дыхательных путей, состоящей в возрастании доли ПФП при гипоксии, увеличении скорости и доли гликолиза при аноксии или в использовании альтернативных путей окисления восстановленных коферментов при накоплении малата, аспартата, аланина, сукцината и др. Эти изменения обеспечивают необходимый для выживания энергетический уровень, разнообразие интермедиатов. А также поддержание равновесия окисления и восстановления коферментов. Сдвиги в обмене веществ у устойчивых растений включают также торможение распада липидов и белков и синтез многочисленных аноксических стрессовых белков, главным образом, ферментов гликолитического распада. В комплекс метаболических приспособительных перестроек входят также сдвиги в гормональном балансе, различающиеся в условиях гипоксии и аноксии, метаболизация продуктов анаэробного обмена, удаление токсических веществ в окружающую среду и, наконец, стабилизация мембран, которые у устойчивых растений меньше повреждаются в условиях анаэробиоза (Чиркова. 1988). В последние 20-30 лет исследования физиолого-биохимических особенностей гипоксии и аноксии ведутся довольно интенсивно. Гораздо меньше внимания пока уделяется рассмотрению своеобразия процессов в растениях, возникающего при возвращении их в аэробную среду. Вместе с тем, такая перемена газового режима также не может быть безразлична для растения, поскольку вслед за анаэробным возникает окислительный стресс, связанный с появлением АФК.
Кислород довольно медленно реагирует с органическими молекулами, так как сам имеет на внешних орбиталях два неспаренных электрона с параллельными спинами, а органические молекулы, как правило, имеют на внешних орбиталях пары электронов с антипараллельными спинами. Активация кислорода может происходить либо при поглощении энергии, необходимой для изменения спина одного из электронов кислорода, либо в ходе реакций восстановления. В первом случае образуется химически активный синглетный кислород. Во втором случае образуются различные АФК, являющиеся промежуточными продуктами восстановления кислорода до воды в электрон-транспортных цепях. 02 + е" - 02- + е" + 2Н+ — Н202 + е + Н+ - Н20 - ОН + е + Н+ -» 2Н20 Наименьшей стабильностью среди АФК отличаются супероксидный анион-радикал (02 ), образующийся при передаче кислороду одного электрона (Misra, Fridovich, 1972) и гидроксильный радикал (ОН ), которые интенсивно вступают в химические реакции. Супероксидный анион-радикал генерируется, в основном, за счёт «паразитных» химических реакций, происходящих в начале и середине цепи дыхательных ферментов митохондрий. При этом донорами электронов служат ионы Fe3+, Cu2+, семихиноны и некоторые другие продукты дыхания (Кулинский, 1999). Этот радикал непосредственно не является тем агентом, который обуславливает окислительные процессы в биологических мембранах, поэтому инициирование свободнорадикальных процессов связывают с другими АФК (Мерзляк, 1989). В отличие от кислорода, для передвидвижения которого мембраны не представляют преграды, супероксидный анион-радикал, обладая зарядом, окружен молекулями воды, что не дает ему возможности преодолеть гидрофобный мембранный барьер. Кроме того, время полужизни радикала составляет несколько микросекунд, поэтому он быстро становится источником других АФК, дисмутируя до пероксида водорода. Протонированной формой 02" (при слабокислых значениях рН) является гидропероксильный радикал (Н02 ). Он способен пересекать биологические мембраны и свободно диффундировать между компартментами клетки и реагировать с ненасыщенными жирными кислотами, некоторыми аминокислотами, такими как гистидин, метионин и триптофан (Dat et al.,2000).
Антиоксидантные ферментные системы при кислородной недостаточности и окислительном стрессе
Из антиоксиданти ых ферментов при кислородной недостаточности наибольшее внимание было уделено активности пероксидазы. В ряде работ было показано увеличение общей пероксидазной активности в результате действия гипо- и аноксии (Рубин, Логинова, 1965; Чиркова, 1973) и появление новых изоэнзимов (Будилова и др., 1971; Чиркова, 1988). Стимуляция активности пероксидазы у устойчивых растений (ивы и манника) была выше и проявлялась после более длительных периодов аноксии (Чиркова и др., 1973). Увеличение активности пероксидазы связывали с участием ее в ограничении ПОЛ, необходимостью детоксикации накапливающихся продуктов анаэробного обмена, в том числе и фенольных соединений. Антиоксидантные ферменты способны также в анаэробных условиях катализировать образование молекулярного кислорода при разложении перекиси, что, как считают некоторые авторы, может играть важную роль в адаптации к кислородной недостаточности (Piatt et al., 1977).
При постаноксической аэрации было установлено участие гваяколпероксидазы в процессе разложения перекиси водорода у проростков сои. Для выяснения возможного вклада в распад пероксида и каталазы был использован ингибиторный анализ. Предобработка растений ингибитором каталазы 3-аминотриазолом почти не меняла уровня содержания в клетке пероксида, тогда как после действия ингибитора пероксидазы азида натрия наблюдалось 50% увеличение содержания перекиси в ткани (Amor et al., 2000). Авторы исследовали внутри- и внеклеточные формы пероксидазы и обнаружили активацию апопластного фермента, однако появления новых изоформ им обнаружить не удалось. Вместе с тем, известны данные и о снижении активности гваяколпероксидазы в условиях аноксии. Так, активность фермента клеточной стенки снижалась при анаэробиозе в колеоптилях риса, но возрастала в корнях (Lee, Lin, 1995). Снижение блокировалось абсцизовой кислотой, поэтому авторы связали это явление с регуляцией роста колеоптиля, поскольку абсцизовая кислота, как известно, оказывает тормозящее действие на рост.
О роли других антиоксидантных ферментов в условиях гипо- и аноксии, а также в пост-аноксический период данных в литературе немного. Так, показано возрастение активности СОД в корневищах ирисов при аноксии и особенно при последующей аэрации, главным образом, у устойчивого вида (Monk et.al.,1987). Предполагается, что СОД синтезируется при аноксии de novo и участвует в блокировании начальных стадий ПОЛ. Увеличение активности СОД наблюдали при гипоксии в корнях и листьях гороха и кукурузы. Однако в работе Т.В.Чирковой с соавторами (1998), наоборот, сообщается о падении активности СОД у пшеницы и риса, правда, при длительных (до 5 суток) экспозициях в бескислородеой среде. Авторы предполагают, что роль СОД удалось бы выявить или при более кратких экспозициях в условиях анаэробиоза, или в пост-аноксический период, который в данном исследовании не рассматривался.
Таким образом, в литературе имеются немногочисленные и неоднозначные данные разных авторов о влиянии недостатка кислорода на активность антиоксидантных ферментов и, прежде всего, гваяколпероксидазы и каталазы. Что касается аскорбатпероксидазы и глутатионпероксидазы, то изменение интенсивности их работы в условиях аноксии и постаноксической аэрации совсем не исследовалось. Кроме того, почти отсутствуют сведения об изменении и изоферментного состава пероксидаз в условиях окислительного стресса, возникающего после действия анаэробиоза. Недостаточно также данных о сопоставлении активности различных видов пероксидаз у растений, контрастных по устойчивости к гипоксии, с накоплением пероксида водорода, а также его предшественника - супероксидного анион-радикала.
Кроме того, известно, что в бескислородной среде в анаэробных условиях у неустойчивых растений полностью прекращается рост и побегов, и корней, в то время как у устойчивых рост побегов может сохраняться. Поскольку пероксидаза играет существенную роль в регуляции ростовых процессов, важно рассмотреть особенности работы фермента у растений, различающихся по устойчивости, и в связи с этими фактами.
Исходя из вышеизложенного, мы поставили целью настоящего исследования выяснение роли антиоксидантных ферментов в защите от гибели растений, различающихся по устойчивости к кислородной недостаточности, в условиях аноксии и пост-аноксического окислительного стресса.
Объектами исследования служили 7-дневные проростки пшеницы (Triticum aestivum L) сорта "Ленинградка" и 10-дневные проростки риса (Oryza sativa L) сорта "Лиман". Семена риса были приобретены во ВНИИ Риса (Краснодар), семена пшеницы - в ОПХ "Суйда" (Ленинградская обл.). Пшеницу использовали в качестве неустойчивого, а рис - устойчивого к гипоксии растения.
Семена протравливали 5% раствором NaCIO в течение 10 мин, промывали теплой кипяченой водой и замачивали в течение 1 ч в горячей воде (45-50С для пшеницы и 50-60С для риса). Семена пшеницы проращивали в термостате при 23С двое суток, а риса - при 28С трое суток. Далее проростки пересаживали на перфорированные пластиковые пластины, покрывающие сосуды, содержащие 1,2 л 1/5 модифицированного раствора Кнопа, через который постоянно продували воздух, освещение составляло 80 Вт/м2 (фотопериод 14ч/10 ч), а температура 20-21 С.
Экстракция и определение активности аскорбат-пероксидазы
Под влиянием аноксии у неустойчивого растения не наблюдалось существенных изменений в количестве апопластных и цитоплазматических изоформ пероксидаз, однако интенсивность окраски изоформ уменьшалась, что может свидетельствовать об ограничении активности всех имеющихся изоформ и в клеточной стенке, и в цитоплазме (рис. 17). У устойчивого растения - риса подобной картины обнаружено не было. Наоборот, в апопласте клеток риса заметно возрастало количество самой подвижной изоформы (рис. 18). С помощью ингибиторного анализа было показано, что все три используемых нами ингибитора снижали активность этой изоформы, однако в большей степени это было заметно при действии циклогексимида и брефельдина А (рис. 18). По-видимому, при аноксии этот изофермент транспортируется из цитоплазмы в клеточную стенку, где он необходим как для обеспечения процесса лигнификации, так и (или) для деградации пероксида водорода. По всей вероятности, увеличение активности пероксидазы у риса при длительных сроках аноксии в апопласте связано именно с секрецией этого изофермента из цитоплазмы. Отсутствие новых изоформ и снижение активности уже имеющихся изопероксидаз у пшеницы подтверждает данные о том, что активность пероксидазы клеточной стенки снижается под действием анаэробиоза.
В условиях реаэрации у пшеницы также было отмечено снижение активности отдельных изоформ в апопласте, тогда как интенсивность окраски цитоплазматических изопероксидаз поддерживалась на уровне, близком к контролю (рис. 19). У риса, наоборот, наблюдалась усиление окраски активировавшейся при анаэробиозе изоформы, причем не только в побеге, но и в корнях, особенно после коротких сроков реаэрации (рис. 20, 21). В корнях эта активация блокировалась циклогексимидом и брефельдином, тогда как актиномицин не оказывал практически никакого влияния на активность этой изоформы (рис. 20). В побеге все три ингибитора действовали однотипно и вызывали некоторое снижение активности этой изоформы только после 24 ч реоксигенации. В цитоплазме устойчивого растения не было обнаружено каких-либо значительных сдвигов в интенсивности окраски отдельных изоформ под действием реаэрации, не обнаружено также существенных изменений и при действии ингибиторов. Таким образом, несмотря на снижение активности фермента цитоплазмы после 24 часов реаэрации под действием актиномицина изменений в изоферментном спектре нами выявлено не было (рис. 20).
Исходя из вышесказанного, можно заключить, что увеличение активности апопластного фермента при реаэрации в корне и побеге у устойчивого растения связано, в первую очередь, с увеличением содержания в клеточной стенке изоформы, которая очень слабо проявлялась в контрольном варианте. Этот изофермент, возможно, синтезируется, в цитоплазме в соответствии с имеющимися в ней готовыми мРНК, поскольку, как указано выше, какого-либо действия актиномицина D на активность и спектр изозимов обнаружено не было. Что касается пшеницы, то у нее не было обнаружено ни новых изоформ, ни увеличения содержания уже имеющихся, и в апопласте, и в цитоплазме клеток. Поэтому, активация пероксидазы в цитоплазме в условиях реоксигенации у этого растения, по-видимому, связана с изменением свойств уже имеющихся в клетке ферментов.
Результаты проведённой работы показали, в условиях нормальной аэрации устойчивое к гипоксии растение (рис) продуцирует большее количество как супероксидного анион-радикала, так и пероксида водорода, чем неустойчивое - пшеница (рис. 3, 4). Однако в условиях аноксии и постаноксической аэрации у риса накопление обеих АФК отсутствовало (рис. 3, 4), в то время как в проростках пшеницы наблюдалось некоторое повышение содержания 02" и значительная аккумуляция Н202, особенно хорошо заметные после 15-30-минутной реаэрации.
Из литературы также известны примеры накопления пероксида в период аноксии и постаноксической аэрации. Аккумуляцию Н202 при гипоксических и аноксических условиях как в корнях, так и в листьях различных растений отмечали и другие исследователи (Калашников и др., 1994; Biemelt et al., 2000). Накопление пероксида водорода в апопласте и в связи с плазматической мембраной устойчивых и неустойчивых к недостатку кислорода растений при аноксии и особенно в период постаноксической аэрации показано и О.Б. Блохиной с соавторами (Blokhina et al., 2001). Авторы продемонстрировали, что в корнях и корневищах устойчивых к гипоксии растений (рис, болотный ирис - Iris pseudacorus) во время аноксии и, особенно, при постаноксической реоксигенации аккумуляция перекиси водорода происходила в основном в апопласте, а у неустойчивых (пшеница и ирис германский - /. germanicd) - в цитоплазме клеток.
Влияние аноксии и последующей аэрации на активность каталазы в клеточной стенке и цитоплазме растений
Подтверждением этого предположения стали результаты проведённого нами электрофоретического исследования, в результате которых не было выявлено появления новых изоформ в условиях аноксии и постаноксической аэрации (рис. 17-21). Однако было обнаружено значительное накопление в этих условиях самой подвижной изоформы апопластной гваяколпероксидазы. Уже при аноксии, этот изофермент, по-видимому, транспортируется из цитоплазмы в клеточную стенку, где он необходим как для обеспечения процесса лигнификации, так и (или) для деградации пероксида водорода. Однако, нельзя исключать, что новая изоформа осуществляет обратный процесс - отвечает за производство Н202 (Bolwell et al., 1995), необходимого для осуществления сигнальной функции. По всей вероятности, увеличение активности пероксидазы у риса при аноксии и в условиях реаэрации в апопласте связано именно с секрецией этого изофермента из цитоплазмы. Отсутствие новых изоформ и снижение активности уже имеющихся изопероксидаз у пшеницы подтверждают данные о том, что активность пероксидазы клеточной стенки у нее снижается под действием анаэробиоза. Подобные явления были описаны в научных работах и ранее. Например, было показано, что при аноксическом воздействии возрастало число изоформ пероксидазы с 6 до 9 изозимов, а при действии актиномицина D оно уменьшалось до 7 (Чиркова, 1988). К сожалению, в этой работе изоформы пероксидаз не были разделены на апопластные и цитоплазматические.
Исходя из вышесказанного, можно полагать, что увеличение активности апопластного фермента в корне и побеге у устойчивого растения связано, в первую очередь, с увеличением содержания в клеточной стенке изоформы, которая очень слабо проявлялась в контрольном варианте. Подобное явление было обнаружено при анализе изоферментного состава пероксидаз апопласта клеток сои (Amor et al., 2000), где также было показано только увеличение активности одной из изоформ, но без появления новых. Возможно у устойчивого растения существует механизм транспорта в клеточную стенку одной из изопероксидаз в условиях накопления в ней пероксида. Этот изофермент, вероятно, синтезируется в цитоплазме на основе имеющихся в ней готовых форм мРНК, поскольку, как указано выше, какого-либо действия актиномицина D на активность и спектр изозимов обнаружено не было. Указанная изоформа, вероятно, не может быть отнесена к стрессовым аноксическим белкам, однако её можно рассматривать как компонент комплекса адаптационных механизмов устойчивости к гипоксии и последующей реаэрации. При длительных сроках реоксигенации (24 часа) у устойчивого растения, как следует из результатов ингибиторного анализа, синтез белка мог происходить при участии транскрипции гена данного белка (рис. 15, 16). Возможно, это определяется тем, что готовые формы мРНК были исчерпаны или времени было достаточно, для активации генной экспрессии. Однако синтезировались при этом те же изоэнзимы, которые присутствовали и в условиях нормальной аэрации, т.е. и в этом случае не удалось выделить стрессовых цитоплазматических изопероксидаз.
Что касается пшеницы, то у нее не было обнаружено ни новых изоформ, ни увеличения содержания уже имеющихся, и в апопласте, и в цитоплазме клеток. В связи с этим, активация пероксидазы в цитоплазме в условиях реоксигенации у этого растения, по-видимому, связана с изменением свойств уже имеющихся в клетке ферментов.
Что касается цитоплазматических фракций корней и побегов пшеницы и риса, то полученные в нашей работе данные показали, что активность пероксидазы несколько снижалась под влиянием аноксии (рис. 10). Вероятно, это связано с удалением молекулярного кислорода из окружающей среды и, как следствие этого, уменьшением содержания активных форм кислорода, в том числе и Н202, как субстрата (рис. 4). Восстановление же нормальной аэрации приводило к накоплению этих радикалов и соединений, что стимулировало активацию пероксидаз (рис. 10). Длительное действие реаэрации сопровождалось повышением активности как цитоплазматического фермента, так и пероксидаз апопласта (рис. 9, 10). Повышение активности цитоплазматических пероксидаз может рассматриваться как второй (после апопластного) этап антиоксидантной защиты, связанный с детоксикацией пероксида водорода в цитоплазме клеток, который либо проникал из апопласта, несмотря на активацию пероксидазного апопластного барьера, либо был синтезирован в цитоплазме. У неустойчивого же растения пероксидаза активировалась только к 12 часам реаэрации, и только в цитоплазме, что, по-видимому, связано с отсутствием внеклеточного апопластного барьера, разрушающего пероксид еще в клеточной стенке.
Таким образом, обнаруженная нами активация пероксидазы в клеточной стенке у риса может свидетельствовать о том, что пероксидаза является одним из важных компонентов антиоксидантной системы устойчивых к гипоксии растений. Ее роль состоит в предотвращении поступления активных форм кислорода в цитоплазму из клеточных стенок.
Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что у устойчивого растения не наблюдалось накопления активных форм кислорода, что, по-видимому, связано, прежде всего, с быстрым и интенсивным возрастанием активности апопластных форм гваякол-пероксидазы и каталазы, обеспечивающих детоксикацию пероксида ещё в апопласте, препятствуя тем самым его проникновению в цитоплазму.клеток. Образующийся же в цитоплазме пероксид, а также проникающий туда из апопласта, разрушается цитоплазматическими ферментами, в первую очередь аскорбат- и глутатионпероксидазами, которые у риса, в отличие от пшеницы, сохраняют длительное время высокий уровень активности во всех вариантах опытов. Подобная схема работает как при коротких, так и при длительных сроках анаэробного и постаноксического воздействия.
