Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 9
1.1 Ультрафиолетовая радиация и озоновый слой атмосферы - экологические факторы жизни растений 9
1.2 Восприятие и передача УФ-В сигнала 10
1.3 Повреждение растений УФ-В радиацией 13
1.4 Адаптация растений к УФ-В радиации 15
1.4.1 УФ-рассеивающие и поглощающие экраны 15
1.4.2 Восстановление повреждений ДНК 19
1.4.3 Детоксикация активных форм кислорода при УФ-В стрессе 21
1.5 Роль полиаминов при стрессах и в регуляции роста и развития растений 21
1.5.1 Протекторные свойства полиаминов 22
1.5.2 Полиамины - регуляторы роста и развития растений 26
1.6 Метаболизм полиаминов и его регуляция 32
1.6.1 Синтез и катаболизм полиаминов 32
1.6.2 Локализация в клетке полиаминов и ферментов их метаболизма 37
1.6.3 Влияние стрессоров на содержание полиаминов в растениях 39
1.6.4 Участие фитогормонов в регуляции уровня полиаминов 44
Глава 2 Объект и методы исследования 48
2.1 Объект исследования и условия выращивания 48
2.2 Облучение растений УФ-В светом 50
2.3 Обработка растений АБК 51
2.4 Обработка растений этиленом 52
2.5 Определение выхода электролитов 52
2.6 Определение содержания свободных полиаминов 53
2.7 Определение содержания АБК 56
2.8 Определение выделения этилена 57
2.9 Математическая обработка данных 60
Глава 3 Результаты исследования и их обсуждение 61
3.1 Влияние УФ-В на рост растений A. thaliana 61
3.2 Влияние УФ-В радиации на выделение этилена и содержание АБК 63
3.3 Влияние УФ-В радиации на содержание полиаминов 65
3.4 Взаиморегуляция синтеза этилена и АБК 67
3.5 Влияние экзогенной АБК на рост A. thaliana при УФ-В стрессе 69
3.6 Влияние экзогенной АБК на содержание полиаминов в A. thaliana при УФ-В стрессе 72
3.7 Влияние этилена на содержание полиаминов в растениях Л. thaliana 74
Глава 4 Заключения и выводы 76
Список литературы 79
- УФ-рассеивающие и поглощающие экраны
- Локализация в клетке полиаминов и ферментов их метаболизма
- Определение содержания свободных полиаминов
- Влияние экзогенной АБК на содержание полиаминов в A. thaliana при УФ-В стрессе
Введение к работе
Восприятие растениями условий окружающей среды, передачу полученных сигналов и физиологические ответы на них интенсивно изучают во всем мире. Проблема реакции растений на повышающийся уровень УФ-В радиации находится в ряду наиболее актуальных.
Ультрафиолетовая радиация с длиной волны 280-320 нм (УФ-В), возрастает у поверхности Земли в результате редукции озонового слоя стратосферы. Этот мощный абиотический фактор, способен вызывать снижение продуктивности сельскохозяйственных культур, а в естественных экосистемах вытеснение чувствительных растений устойчивыми, что ведет к уменьшению разнообразия растительных форм [Jansen et al, 1998]. Показано, что УФ-В в зависимости от дозы может воздействовать на рост и морфогенез, повреждать фотосинтетический аппарат и, что особенно опасно, структуру ДНК [Brosche, Strid, 1999; Jansen et al, 1998; Jansen et al, 2000; Strid, 1990; Strid et a/., 1993; 1994; 1996]. УФ-В включает пути трансдукции сигналов, регулирующих экспрессию генов, которые контролируют ряд защитных механизмов, в частности, синтез полиаминов [Predieri et al, 1993; Lin et al, 2002]. Протекторные свойства полиаминов заключаются в их способности стабилизировать структуру макромолекул и служить ловушками активных форм кислорода, причем определяющая роль в этих процессах принадлежит спермидину и спермину [Galston, 1986; Galston, Kaur-Sawhney, 1990; Kaur-Sawhney et al, 2003]. Передача стрессового сигнала происходит с участием вторичных мессенджеров, в качестве которых способны выступать такие фитогормоны как этилен и абсцизовая кислота (АБК) [Larkindale et al, 2002].
Этилен принимает участие в регуляции практически всех физиологических процессов в растениях - от прорастания семян до созревания плодов [Abeles et al, 1992]. Он также регулирует синтез и катаболизм других фитогормонов и, что особенно важно, АБК, которой принадлежит существенная роль в адаптации растений к биотическим и абиотическим стрессам [Grossman et al, 2001]. При холодовом стрессе показано, что АБК участвует в адаптации через стимуляцию синтеза полиаминов [Kim et al, 2002]. АБК также регулирует синтез этилена [Grossman, Hansen, 2001; Ракитина и др., 1994; Ракитина и др., 2001; 2004; Spollen et al, 2000; LeNoble et al, 2003]. Необходимо отметить, что в некоторых случаях чувствительность растений к АБК контролируется геном EIN2, кодирующим белок, который функционирует и в пути передачи этиленового сигнала [Ghassemian et al, 2000; Beaudoin et al, 2000; Gazzarini et al, 2003]. Наличие общих компонентов, участвующих в передаче сигналов этилена и АБК позволяет предположить их взаимодействие в регуляции синтеза полиаминов. Современные представления об участии фитогормонов и полиаминов в ответах растений на стресс приводят к необходимости исследования их совместного действия в защитных реакциях на УФ-В радиацию.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании взаимодействия этилена и АБК в регуляции уровня полиаминов в растениях Arabidopsis thaliana при УФ-В стрессе. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Определить величины низких, умеренных, высоких и летальных доз УФ-В по их воздействию на рост растений.
Изучить динамику образования этилена, содержания АБК, свободных полиаминов и устойчивость растений Arabidopsis thaliana при воздействии низких, умеренных, высоких и летальных доз УФ-В радиации.
Выяснить действие экзогенного этилена на содержание АБК и полиаминов в растениях Arabidopsis thaliana .
4. Исследовать влияние экзогенной АБК на выделение этилена, содержание полиаминов и устойчивость растений Arabidopsis thaliana при УФ-В стрессе.
Научная новизна. Впервые на одном объекте (Arabidopsis thaliana) продемонстрирована динамика выделения этилена, содержания эндогенных АБК и полиаминов после воздействия низкой, умеренной, высокой и летальной доз УФ-В радиации. Впервые показано, что экзогенная АБК в широком диапазоне концентраций ингибирует УФ-В индуцированное образование этилена и стимулирует накопление путресцина, тогда как экзогенный этилен в физиологических концентрациях стимулирует, а в высоких тормозит накопление АБК и полиаминов. Полученные данные показывают, что образующийся при УФ-В стрессе этилен вызывает накопление АБК. Абсцизовая кислота в свою очередь ингибирует синтез этилена и дополнительно усиливает индуцированное УФ-В радиацией образование путресцина, предшественника спермидина и спермина, - полиаминов, поддержание определенного уровня которых необходимо для выживания растений при УФ-В стрессе.
Практическая значимость. Полученные в работе данные имеют существенное значение для понимания регулируемых этиленом, АБК и полиаминами процессов, реализующихся при адаптации растений к УФ-В радиации. Результаты работы могут быть теоретическим основанием при создании хозяйственно важных трансгенных растений, устойчивых к УФ-В излучению. Теоретические обобщения и совокупность экспериментальных данных работы могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических факультетов высших учебных заведений.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 26-28 мая 2003), V Съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 15-21 сентября 2003), VI Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 13-17 июня 2005 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Работа изложена на 101 странице машинописного текста, включает 1 таблицу и 17 рисунков; библиография содержит 214 названий, в т. ч. 193 на иностранных языках.
УФ-рассеивающие и поглощающие экраны
В отличии от других стрессоров УФ излучение действует прежде всего на поверхностный слой клеток, где в значительной степени происходит отражение и его поглощение различными УФ абсорбирующими соединениями.
Листья многих растений покрыты трихомами, рассеивающими значительную часть УФ-В, УФ-А и синего света, обеспечивая защиту не только от ультрафиолетового, но и от высоких доз видимого излучения. УФ абсорбирующая эффективность трихом является результатом присутствия в них УФ абсорбирующих соединений (Karabourniotis et ah, 1996; Skaltsa a/., 1994).
Важную роль в защите играет эпидерма листа, являющаяся эффективным фильтром для УФ-В-лучей. Эпидерма пропускает в среднем менее 10% падающей на листовую пластинку УФ-радиации. Мезофилл тоже поглощает УФ-лучи. В отличие от клеточных стенок, состоящих из целлюлозы и гемицеллюлозы, хорошо пропускающих УФ-лучи, лигнифицированные клеточные стенки способны поглощать до половины всех УФ-лучей (Кузнецов, Дмитриева, 2005).
В большинстве случаев именно абсорбция эпидермой является главной причиной, определяющей низкое пропускание УФ радиации (Robberetch et ah, 1980). Эпидерма растений покрыта кутикулой, которая примерно в два раза повышает способность отражать УФ-В радиацию. Химический состав кутикулярного воска, состоящего из спиртов, эфиров и углеводородов, может изменяться в зависимости от интенсивности и длины волны УФ-излучения (Gonzales et ah, 1996). Для оценки защитных свойств поверностных структур растений были исследованы оптические свойства изолированной кутикулы и кожуры плодов яблони (Malus domestica Borkh., cv Antonovka). Было обнаружено, что кутикула в значительной степени рассеивает ультрафиолет и незначительно абсорбирует излучение в пределах 500-800 нм. В среднем пропускание кутикулой составляет от 36± 20% и 14 ± 7% при 375 и 300 нм соответственно (Solovchenko, Merzlyak, 2003). Эффективно защищают растение от УФ радиации фенольныс соединения, расположенные главным образом в верхних эпидермальных слоях листьев (Beggs et al., 1986; Bochereau, 1998; Bieza, Lois, 2001; Casati, Walbot, 2003; Chappel, Hahlbrock, 1984; Hahlbrock, Scheel, 1989; Wellman, 1982). Эти соединения смягчают повреждающий эффект УФ света, но пропускают фотосинтетически активную радиацию. Стратегии накопления и распределения фенольных соединений, абсорбирующих УФ радиацию, могут быть самыми разнообразными. Эти соединения могут быть распределены по всему листу и сконцентрированы в стенках клеток эпидермиса, но особенно много их в хлорофил-содержащих клетках (Semerdjieva, Sheffield et al., 2003). На затененной стороне плодов Malus domestica Borkh., cv Antonovka абсорбция эпидермой УФ-лучей идет главным образом за счет кутикулярных фенолов, в то время как на солнечной абсорбция обусловлена вакуолярными флавоноидами кожицы. Основная часть флавоноидов в кожице локализована под кутикулой, что обеспечивает рассеивание радиации в широком спектральном диапазоне и играет главную роль в долговременной адаптации плодов яблони к повышенному уровню солнечной радиации (Solovchenko, Merzlyak, 2003). Облучение УФ радиацией ведет к накоплению гликозидов флавоноидов (Solovchenko.,Schmitz-Eiberger, 2003). В изолированной кутикуле и кожуре плодов яблони (Malus domestica Borkh., cv Antonovka) в качестве основного вещества, абсорбирующего УФ свет выступает кверцетин-гликозид, содержащийся в количестве от 10 до 70 нМоль/см (Solovchenko, Merzlyak, 2003). Лютеолин, кверцетин были обнаружены в листьях оливы (Karabourniotis et al., 1993), а гликозиды феруловой кислоты - в листьях дуба (Skaltsa et al., 1994). Эти флавоноиды и другие фенолы локализованы в клеточной стенке трихом (Karabourniotis, Fasseas, 1996; Karabourniotis, 1998). Растет количество доказательств того, что эфиры коричных кислот выступают в высших растениях в роли протекторов от УФ-В (Beggs et al.,1986; Caldwell et al, 1971; Martinanguy,1985). Исследование мутантов арабидопсиса с нарушеным синтезом флавоноидов (мутант по халконсинтазе) transparent testa 5 (tt5) и эфиров синаповой кислоты (мутант по гидроксилазе феруловой кислоты) (fahl) уточняет наши представления о роли фенолов, включая флавоноиды и эфиры коричных кислот в формировании устойчивости к УФ радиации. Было показано, что несмотря на то, что fahl может накапливать флавоноиды, он был более чувствителен к УФ-В, чем дикий тип и мутант tt5. Эти данные позволили сделать вывод о том, что более эффективную защиту от УФ радиации у арабидопсиса обуславливают эфиры синаповой кислоты, нежели флавоноиды. (Landry etal., 1995).
Характерной особенностью коричных кислот, а также самой коричной кислоты является способность к цис- транс- изомерии. В тканях растений обычно преобладает итраноформа. Существующее в растворах подвижное равновесие этих двух форм при облучении УФ-светом резко сдвигается в сторону образования z/иоформы, обладающей ауксиновой активностью. Транс-формы оксикоричных кислот этой особенностью не обладают (Кретович, 1980; Запрометов, 1974; Caldwell et al.A 1971). Пары г/ш?-изомеров коричной кислоты, так же как и этилен, индуцируют эпинастическую реакцию у растений томата. В связи с наличием двойной связи и высокой летучестью предполагается, что z/мокоричная кислота может функционировать как этилен, играя важную роль в индукции фенилаланин- аммиак-лиазной активности. Однако цис- изомеры коричной кислоты не действуют через этилен-зависимый рецепторныи путь, и рецепторы этилена и z/wc-коричной кислоты различны (Yang et al, 1999).
Ключевые энзимы превращения фенилпропаноидного пути превращения фенилаланина в производные коричной кислоты -это фенилаланин- аммиак-лиаза (PAL,EC 4.3.1.5.), циннамат 4-гидроксилаза (С4Н,ЕС 1/14/13/11/), 4-кумарат:КоА-лигаза (4CL,EC 6.2.1.12) и халконсинтаза (CHS,EC 2.3/1/74) (Hahlbrock, Griesbach 1979). Эти ферменты регулируют биосинтез фенольных соединений, а их транскрипцию индуцирует УФ-В (Hahlbrock, Scheel 1989; Messner et al, 1991; Muzukami et al, 1989; Schofer, 1975).
Локализация в клетке полиаминов и ферментов их метаболизма
Поскольку полиамины представляют собой небольшие растворимые, способные к диффузии молекулы, достаточно непросто определить место их локализации в клетке. Фрагментация клетки с целью определения их распределения дает множество артефактов, особенно если при разделении клеточных структур имеют место изменения рН, вызывающие протонирование полиаминов, что в свою очередь изменяет их распределение в клетке. Тот факт, что эндогенный и экзогенный аргинин могут иметь совершенно разную метаболическую судьбу на пути к биосинтезу полиаминов, и то, что экзогенные и эндогенные полиамины по-разному включаются в метаболизм, указывает на компартментацию энзимов, необходимых для синтеза полиаминов. При изучении этого вопроса использовали такие методы, как субклеточное фракционирование, цитохимический и иммунологический анализ, ауторадиографическое определение меченых полиаминов и ферментов их биосинтеза (Slocum et ah, 1991). К сожалению, пока нет исчерпывающей информации по этому вопросу. Имеются сообщения о том, что большая часть внутриклеточных полиаминов находится в вакуолях, но полиамины обнаружены также и в хлоропластах, и в митохондриях. Исследования с использованием радиоактивной метки показывают, что отрицательно заряженная клеточная стенка, способна абсорбировать до двух третей протонированных полиаминов (Slocum et al., 1991). ъ О локализации ферментов биосинтеза полиаминов также мало известно. Способность ДФМА и ДФМО образовывать прочные ковалентные связи с АДК и ОДК используют для определения этих ферментов в тканях. Благодаря использованию ингибиторов, меченых по 14С и 3Н, на растениях табака было показано, что ОДК локализована в ядре яйцеклеток (Slocum et al, 1991). Это соответствует данным, полученным при фракционировании клеточных структур центрифугированием. На том же основании предполагают, что АДК находится в цитозоле, в то время как спермидинсинтаза - в хлоропластах. (Kaur-Sawhney et al., 1981). У злаков полиаминоксидаза локализована в клеточной стенке, что предполагает ее участие в лигнификации, поскольку образующийся Н2Ог необходим для окисления предшественников лигнина и превращения их в лигнин (Slocum al., 1991; Kaur-Sawhney et al., 1981).
В других работах показано, что ОДК, SAM-декарбоксилаза и спермидинсинтаза локализованы в цитоплазме, АДК в мембранах тилакоидов хлоропластов (Borell et al., 1996; Tiburcio et al., 1997). Однако все эти данные нуждаются в дальнейшей проверке и подтверждении.
Большинство энзимов, включенных в метаболизм полиаминов, очищены и охарактеризованы, таким образом специфические антитела к этим ферментам могут быть использованы в дальнейшем для определения их локализации (Galston et al., 1997).
Впервые на накопление полиаминов при стрессе обратили внимание в шестидесятых годах 20 века Richards и Coleman, наблюдавшие равитие некрозов, сопровождавшееся почти стократным увеличением содержания путресцина в листьях ячменя при калиевом голодании. Из этих наблюдений был сделан вывод о токсичности полиаминов и их негативной роли в процессе адаптации (Richards, Coleman, 1952; Richards, 1954).
Позднее обнаружили, что при обработке растений растворами полиаминов в концентрациях выше JjviM, они проявляют свойства токсинов широкого спектра действия. Так, введение путресцина и кадаверина в растения ячменя, конских бобов, хлопчатника, гороха приводит к потере тургора и образованию некрозов (Richards, Coleman, 1952; Строганов и др., 1961; Строгонов, 1962; Шевякова, 1979). Растворы с низкими концентрациями полиаминов (10-100 мкМ) действуют как ростстимулирующие вещества, стабилизаторы нуклеиновых кислот, белков, мембран. Содержание полиаминов в тканях изменяется в широких пределах: от 30-700нМоль/г сырой массы в норме до 3000нМоль/г и выше в стрессовых условиях.
Однако далеко не во всех случаях аккумуляция этих соединений в растениях сопровождается проявлением их токсичности. Об этом свидетельствуют работы, в которых аккумуляцию путресцина вызвали у растений используя аммоний в качестве единственного источника азота. При выращивании сои в условиях аммонийного питания концентрация путресцина в листьях возрастает более чем в 100 раз, но признаки повреждения отсутствуют. В качестве преположения высказывается мнение, что резистентность сои к аккумуляции путресцина связана с компартментацией диамина в вакуолях (Le Rudulier et al, 1975; Le Rudulier et al, 1977), а у некоторых растений, например, гевеи бразильской, в микровакуолях лизосомного характера (лютоидах) (Hanower, 1977). Устойчивость растений к высоким концентрациям ди-и полиаминов может быть связана и с особенностями их метаболизма. Так, интенсивное образование диаминов характерно для растений, синтезирующих из них алкалоиды: беладонны, дурмана, табака и др. (Smith, 1977; Шевякова, 1981).
Стрессовые условия могут вызывать увеличение или уменьшение содержания полиаминов в зависимости от типа стресса, вида растения, продолжительности воздействия стрессовых факторов (Slokum, Flores, 1991; Galston е/д/., 1997). Отношения между уровнем полиаминов и стрессом являются более сложными нежели простая индукция биосинтеза полиаминов (Bouchereau et al, 1999). Динамика содержания полиаминов в значительной степени зависит и от функционирования путей их деградации, конъюгации и транспорта (Martinanguy, 2001). Растения достаточно быстро реагируют на загрязнение воздуха двуокисью серы и озоном накоплением большого количества полиаминов (Priebe et al, 1978; Kramer et al, 1991; Wellburn, Wellburn, 1996). Солевой стресс приводит к повышению содержания полиаминов в таких растениях как рис, бобы, хлопчатник, кукуруза, сорго, хрустальная трава (Кузнецов и др, 1990, 1991, Дам, 1999). У солеустойчивой линии табака засоление вызывало усиление биосинтеза спермидина в 13 раз по сравнению с линиями, не устойчивыми к засолению (Шевякова и др., 1984).
Определение содержания свободных полиаминов
Затем ионообменную колонку подключали к колонке с обращенной фазой (С-18) (30 х 6 мм Chromosorb LC-7 "Sigma", США) и элюировали образец со скоростью 2 мл/мин 0,3N уксусной кислотой. Анализируемый образец концентрировался на данной колонке, которую после промывки 0,004 N муравьиной кислотой рН 3 (10мл) подсоединяли к следующей колонке (250 х 4,6 мм Sephasorb HP Ultrafine "Farmacia", Швеция). Элюирование проводили 0,003N муравьиной кислотой в 98% метаноле. Время удерживания АБК на этой колонке составляло 10 мин. Фракцию, содержащую АБК, собирали и высушивали в токе азота при температуре 40С.
Метиловый эфир АБК получали, добавляя к очищенной и высушенной фракции, содержащей АБК, 200 мкл раствора диазометана в ацетоне, полученного из нитрозометилмочевины в генераторе диазометана (Wheaton Scientific, США). Реакцию метилирования вели при 0С в течение 10 мин. После завершения реакции образец высушивали в токе азота при 35С, растворяли в 50 мкл гексана, отбирали шприцем 1-2 мкл и анализировали методом газовой хроматографии.
Количественный анализ проводили, используя газовый хроматограф «Газохром 1109» (Россия), с высокочувствительным и селективным по отношению к АБК детектором электронного захвата с 63Ni источником радиоактивного излучения. Колонка 10м х 0,53мм НР-17, "Hewlett-Packard", США. Скорость потока газа-носителя азота через колонку 1мл/мин, для продувки детектора-40 мл/мин. Температурный режим - изотермический. Температура инжектора - 275 С, детектора -260С и колонки - 250С. Время удерживания метилового эфира АБК составляло 6 мин.
Этилен определяли методом газоадсорбционной хроматографии на газовом хроматографе Цвет 106 с пламенно-ионизационным детектором (Россия) и устройством для концентрирования углеводородов (Ракитин, Ракитин, 1986). Концентрирующее устройство позволяет за счет использования больших объемов воздуха в десятки раз повысить чувствительность определения и сократить время, необходимое для накопления в контейнере с биологическим объектом детектируемого количества этилена. Последнее особенно важно для измерения выделения этилена при минимальном изменении в контейнере с растением содержания кислорода, двуокиси углерода и самого этилена, способного вызывать как автокатализ (Мс Glasson et al, 1978; Yang, Hoffman, 1984), так и автоингибирование своего синтеза (Riov Yang, 1982а; Yang, Hoffman, 1984). Поскольку образование этилена является кислород-зависимым процессом, а двуокись углерода и кислород оказывают существенное влияние как на синтез, так и на чувствительность растений к этилену (Bayer, 1979) , то при измерении выделения этилена содержание двуокиси углерода и кислорода контролировали методом газоадсорбционной хроматографии на газовом хроматографе Chrom-4 с детектором по теплопроводности (Чехия) (Ракитин, Ракитин, 1986).
Еще одним критическим моментом при измерении выделения этилена, особенно при исследовании динамики его образования после воздействия различных стрессоров, является так называемая раневая реакция, возникающая после механического повреждения или отрезания органов растения. Раневая реакция развивается в течение нескольких часов и сопровождается значительным образованием и выделением этилена, что обычно приводит к абсолютно неверной трактовке данных по влиянию различных факторов на регуляцию биосинтеза этилена. Для того чтобы избежать ошибок, связанных с раневой реакцией, определение выделения этилена после воздействия экзогенной АБК и УФ-В радиации проводили на растениях Ar. thaliana непосредственно в тех флаконах, где их выращивали.
После облучения с флаконов снимали защищающую растения от завядания прозрачную для УФ-В пленку, закрывали их крышками из фильтровальной бумаги и оставляли для проветривания на 1 ч при свете люминисцентных ламп (15000 лк). За два часа до измерения флаконы с растениями герметично закрывали пробками из самоуплотняющейся резины (Suba seal red rubber septa, Aldrich) (рис.5).
Так же закрывали флаконы с агаризованной средой без растений, атмосферу которых использовали в качестве контроля по содержанию этилена в воздухе и этилена, выделяющегося из агаризованной среды после УФ-В облучения. В качестве контроля для каждой дозы облучения использовали соответствующие флаконы со средой, облученной такой же дозой УФ-В. Затем флаконы, которые находились 2 ч в темноте в термостате при 23 С, присоединяли к устройству для концентрирования углеводородов и всю содержащуюся в них атмосферу током гелия 60 мл/мин в течение 2 мин перемещали в охлажденную до -30С концентрирующую колонку (Chromosorb 108, США, 4 х 60мм). Для десорбции этилена колонку нагревали до 60С и при помощи шестиходового крана присоединяли к хроматографической колонке газового хроматографа (Chromosorb 108, США, 2 х 2000мм).
Влияние экзогенной АБК на содержание полиаминов в A. thaliana при УФ-В стрессе
В настоящее время сам факт участия фитогормонов в ответе растений на УФ-В не вызывает сомнений. Однако участие этилена в синтезе АБК и роль АБК в синтезе этилена при УФ-В стрессе практически не изучены. Также существует мало сведений о влиянии этих гормонов на синтез полиаминов. Отличительная особенность нашей работы заключается в том, что нам впервые удалось продемонстрировать влияние этилена на синтез АБК и АБК на синтез этилена при УФ-В стрессе. Также впервые было показано участие этой пары фитогормонов в регуляции одного из защитных механизмов -синтеза полиаминов.
Использованное в нашей работе однократное кратковременное облучение растений УФ-В позволило нам обнаружить быстрые изменения исследуемых параметров, которые не удается обнаружить при обычно применяемом перманентном облучении растений УФ-В светом низкой интенсивности.
Подробное изучение влияния низких, умеренных, высоких и летальных доз УФ-В радиации на динамику роста растений, образование этилена, содержание АБК и полиаминов в розетках A. thaliana позволило получить дозовую и временную зависимости изменения исследованных параметров. О последовательности событий при УФ-В стрессе может свидетельствовать тот факт, что максимум в образовании этилена был обнаружен через 4 ч, АБК и путресцина - через сутки после облучения УФ-В.
Так как экзогенная АБК подавляла УФ-В-индуцированный синтез этилена, а экзогенный этилен повышал содержание АБК в необлученных растениях можно сделать вывод о взаимной регуляции синтеза и эндогенных этилена и АБК.
УФ-В радиация вызывала возрастание содержания путресцина, вероятно, для компенсации расходования пула спермидина и спермина. Накопление путресцина возрастало по мере увеличения доз УФ-В радиации от низких до умеренных, что обеспечивало приемлемое для преодоления стресса содержание спермидина и спермина. При дальнейшем увеличении доз УФ-В происходило снижение синтеза путресцина, содержание спермидина и спермина уменьшалось в несколько раз, что сопровождалось резким падением устойчивости растений.
Экзогенная АБК повышала устойчивость растений, уменьшая потери спермидина и спермина, вероятно, за счет активации УФ-В-индуцированного синтеза путресцина. Этот вывод подтверждают результаты, полученные с использованием экзогенного этилена. Экзогенный этилен стимулировал накопление путресцина в растениях, но только при концентрациях, способных увеличивать содержание АБК.
Совокупность полученных данных показывает, что этилен и АБК, принимают участие в формировании устойчивости растений к УФ-В радиации, регулируя синтез друг друга и протекторных веществ, в данном случае, полиаминов. 1 УФ-В вызывает дозозависимое торможение роста розеток А. thaliana, проявляющееся в снижении накопления биомассы. Выявлены низкая (3 кДж/м ), умеренные (6-9 кДж/м ), высокая (18 кДж/м ) и летальная (27 кДж/м ) дозы облучения. 2 УФ-В радиация вызывает транзиторный подъем образования и выделения этилена с максимумом через 4 ч после облучения. Увеличение доз облучения от низких до умеренных приводит к усилению образования этилена, дальнейшее повышение доз вызывает менее интенсивное, но более продолжительное выделение этилена. 3 Содержание АБК в растениях возрастает с увеличением дозы УФ-В радиации. Эффект нарастает в течение 24 ч. 4 Экзогенный этилен в физиологических концентрациях (0,1 - 1 мкл/л) стимулирует, а в высоких (10 - 100 мкл/л ) - тормозит накопление АБК. Экзогенная АБК в широком диапазоне концентраций (5- 5000 мкМ) ингибирует УФ-В индуцированное образование этилена. 5 Увеличение доз УФ-В от низких до умеренных значений приводит к транзиторному увеличению содержания путресцина с максимумом через 24 ч после облучения. Высокая доза тормозит, а летальная ингибирует накопление путресцина. 6 УФ-В стресс вызывает дозозависимое расходование пула спермидина и спермина. 7 Экзогенная АБК в концентрациях выше 50 мкМ увеличивает содержание путресцина и уменьшает потерю спермидина и спермина, а также позволяет растениям выживать даже после дозы УФ-В, летальной для необработанных АБК растений. 8 Экзогенный этилен повышает содержание путресцина в необлученных растениях только в концентрациях, способных увеличивать содержание АБК. 9 Этилен и АБК, взаимно регулируя синтез друг друга, принимают участие в поддержании уровня полиаминов, достаточного для сохранения жизнеспособности растений при УФ-В стрессе.
