Введение к работе
Актуальность темы. Проблема иммунитета растений является в настоящее время одной из важнейших, и достижения в этой области связаны с практическими вопросами, стоящими перед сельским хозяйством. В тесной связи с данной проблемой находится и понятие «стресс», включающее в себя механизмы первичных ответных реакций растительных организмов [Кузнецов и др., 1990; Кузнецов, 2001; Шакирова, 2003]. Известно, что у растений функционирует восемь сигнальных систем, обеспечивающих своевременную реакцию и координацию метаболизма растений на всем протяжении жизненного цикла, а также при изменении условий обитания [Тарчевский, 2001]. Среди них аденилатциклазная сигнальная система является одной из наименее исследованных; в литературе имеются лишь скудные сведения о ее функционировании у растений, как в норме, так и при стрессах.
Эффективность работы любого сигнального пути в значительной степени зависит от фермента-триггера сигнала. Для аденилатциклазной системы таким ферментом является аденилатциклаза, синтезирующая циклический аденозинмонофосфат (цАМФ). Считается, что у растений есть одна изоформа мембранной аденилатциклазы (мАЦ) [Тарчевский, 2001], а наличие «растворимой» формы (рАЦ) этого фермента до сих пор ставится под сомнение [Kamenetsky et al., 2006]. В то же время, у животных идентифицированы 9 изоформ мАЦ, а рАЦ на сегодняшний день обнаружена у многих про- и эукариот. Между тем необходимо отметить, что общие принципы работы рассматриваемой сигнальной системы у разных видов организмов в значительной степени универсальны. Это касается единого принципа организации рецепторов, встроенных в клеточные мембраны, ассоциированных с ними G белков, структуры ключевых ферментов и т. д. Исходя из этого, следует ожидать, что у растений функционирует более сложно организованный, чем представляется сегодня, аденилатциклазный сигнальный путь, включающий многие компоненты, возможно, аналогичные или похожие по структуре и функциям на соответствующие элементы этого сигналинга у животных. В этой связи разработка проблемы трансдукции внутри- и межклеточных сигналов посредством аденилатциклазной системы у растений и влияние на этот процесс специфических и неспецифических стрессоров представляется весьма актуальной.
Цель работы: изучить механизмы активации аденилатциклазной сигнальной системы, а также мембраносвязанной и «растворимой» форм аденилатциклаз у растений под влиянием стрессов различной природы, длительности и интенсивности.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
-
Установить зависимость между вирулентностью и мукоидностью ряда штаммов возбудителя кольцевой гнили картофеля - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieck.et Kotth) Skaptason et Burk (Cms) и интенсивностью сорбции патогена на клетках двух сортов картофеля, контрастных по устойчивости к данному возбудителю.
-
Выявить рецепторы к экзополисахаридам (ЭПС) Cms на плазмалемме клеток растений картофеля двух сортов, контрастных по устойчивости к данному патогену.
-
Определить основные кинетические параметры тотальных мАЦ и рАЦ растений картофеля (оптимум рН, Km, Vmax,) в норме и под действием кратковременного биотического стрессора (ЭПС Cms).
-
Изучить влияние абиотического и биотического стрессоров различной длительности и интенсивности на внутри- и внеклеточную концентрационную динамику цАМФ в клетках разных видов растений (арабидопсис, картофель).
-
Изучить специфичность системного ответа аденилатциклазного пути и мАЦ растений картофеля на биотический и абиотический стрессоры, а также установить сортовые особенности системного ответа этого пути растений картофеля на биотический стрессор.
-
Выявить у растений (картофель, пшеница) изоформу мАЦ, иммунородственную 6-ой изоформе мАЦ животных. Изучить влияние длительных биотического и абиотического стрессоров на активизацию синтеза этой изоформы мАЦ.
-
Изучить спектры изоформ рАЦ у разных видов растений (картофель, пшеница) в норме и под влиянием длительных биотического и абиотического стрессоров.
-
Изучить влияние биотического стрессора на изменение активности мАЦ и рАЦ во фракциях ядер и хлоропластов, выделенных из клеток растений картофеля сортов, контрастных по устойчивости к бактериальному патогену.
-
Исследовать на ультраструктурном уровне локализацию рАЦ во внутриклеточных компартментах растений картофеля. Изучить влияние биотического стрессора на перераспределение цАМФ в компартментах данных клеток.
Положения, выдвигаемые на защиту:
-
Вирулентность и мукоидность возбудителя в патосистеме картофель-кольцевая гниль (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus) коррелируют с интенсивностью его сорбции на поверхности растений. Количество рецепторов к экзометаболитам этого же возбудителя на плазмалемме клеток картофеля связано с сортовой устойчивостью этой культуры.
-
Компонентами аденилатциклазной системы растений разных видов являются «растворимая» АЦ, а также изоформа мАЦ, иммунородственная 6-ой изоформе мАЦ животных. Длительные специфические стрессы не приводят к интенсификации синтеза этих форм фермента.
-
При воздействии биотического стрессора на растения картофеля одним из основных регуляторных механизмов модулирования активности аденилатциклазной сигнальной системы является изменение кинетических параметров «растворимой» и мембраносвязанной форм фермента. Высокая скорость, кратковременность, а также системность активации аденилатциклазного сигнального пути растений являются необходимым условием успешной реализации защитных механизмов при воздействии специфических и неспецифических стрессоров.
-
Как локальное, так и системное изменение уровня цАМФ у растений может выступать маркерным признаком специфической устойчивости.
Научная новизна.Впервые у растений выявлена «растворимая» аденилатциклаза во многих компартментах клеток, определена ее молекулярная масса и показано, что под воздействием длительных стрессоров различной природы количество изоформ рАЦ не увеличивается. Также впервые у растений выявлена изоформа мембраносвязанной аденилатциклазы, иммунородственная 6-ой изоформе аденилатциклазы животных и показано отсутствие интенсификации синтеза этой изоформы под воздействием длительных стрессоров различной природы. Показано, что ЭПС Cms осуществляют аллостерическую и изостерическую регуляцию активности мАЦ в клетках растений обоих сортов: у устойчивого – положительную, у восприимчивого – отрицательную. Впервые определены кинетические параметры «растворимой» АЦ растений и показано, что ЭПС Cms активируют эту форму фермента у растений резистентного сорта и ингибируют у восприимчивого сорта. Впервые показано, что модулирование активности аденилатциклазной сигнальной системы под воздействием биотического стрессора (ЭПС Cms) у растений сортов, контрастных по устойчивости к данному фактору, связано с изменением кинетических параметров мембраносвязанной и растворимой форм аденилатциклаз. Установлено, что при воздействии специфического стрессора имеется зависимость активации аденилатциклазного сигнального пути от устойчивости сорта к данному фактору внешней среды, тогда как при неспецифическом стрессовом воздействии реакция данной системы одинакова у двух сортов. Показано, что под воздействием биотического стрессора скорость передачи внутриклеточного сигнала от изучаемой сигнальной системы значительно выше у растений устойчивого сорта, чем у восприимчивого. Результаты исследований обобщены в схему передачи внутри- и межклеточных сигналов с помощью аденилатциклазной сигнальной системы растений при воздействии специфических и неспецифических стрессоров.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты вносят существенный вклад в познание механизмов внутриклеточной сигнализации у растений при воздействии стрессоров различной природы и специфичности и выявляют ряд неизвестных до настоящего времени элементов молекулярных механизмов конститутивного иммунитета растений. Это также значительно дополняет теорию иммунитета растений. Совокупность проведенных исследований позволяет предложить в качестве маркерного признака степени специфической устойчивости локальное и системное изменение уровня цАМФ в растениях, что в дальнейшем даст возможность работать над созданием сортов с высокой устойчивостью к различным неблагоприятным факторам внешней среды.
Апробация работы: Основные результаты работы докладывались на Симпозиуме «Signal system of рlant cell» (Москва, 2001), на международных конференциях «Физиология растений - основа биотехнологии» (Пенза, 2003), «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), Всероссийских научных конференциях «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007), «Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья» (Иркутск, 2007).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 19 работ.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения и выводов, и списка литературы (519 источников, в том числе 107 российских и 412 иностранных). Работа изложена на 318 страницах, содержит 64 рисунка и 12 таблиц.
