Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние изученности вопроса о процессах регенерации и реакции разных структур растений на действие солевого стресса 8
1.1. Характеристика процессов регенерации у растений и мозаичность индивидуума в их реализации 8
1.2. Чувствительность к солевому стрессу разных структур растений в интактном и изолированном состоянии 16
1.3. Физиолого-биохимические изменения изолированных структур при действии засоления 23
Глава 2. Задачи, объекты и методы исследования 30
Глава 3. Выживаемость и процессы регенерации у отделенных органов при действии водных растворов NaCl 39
3.1. Жизнеспособность отделенных органов при культивировании в благоприятных условиях 39
3.2. Процессы регенерации у отделенных органов при постоянном культивировании в условиях засоления среды 42
3.2. Эффект кратковременного действия солевого стресса на отделенные органы 67
Глава 4. Действие солевого стресса на отделенные органы при культивировании их на питательной среде 70
4.1. Изменение эффекта солевого стресса при культивировании отделенных органов на питательных смесях 70
4.2. Проявление эффекта солевого стресса в культуре in vitro 74
Глава 5. Состояние гомеостаза отделенных органов в условиях солевого стресса 91
5.1. Изменение содержания ионов в условиях засоления 91
5.2. Последствия культивирования в растворах NaCl для изменения баланса ионов в тканях отделенных органов 99
5.3. Изменение содержания пролина в тканях отделенных органов в условиях солевого стресса 102
Глава 6. Качественная характеристика действия солевого стресса на отделенные органы растений 116
Заключение 123
Выводы 134
Литература 136
- Характеристика процессов регенерации у растений и мозаичность индивидуума в их реализации
- Процессы регенерации у отделенных органов при постоянном культивировании в условиях засоления среды
- Проявление эффекта солевого стресса в культуре in vitro
- Качественная характеристика действия солевого стресса на отделенные органы растений
Характеристика процессов регенерации у растений и мозаичность индивидуума в их реализации
Оценку способности растений к регенерации пытаются давать давно. При этом возникает вопрос, все ли структуры одного и того же растения обладают одинаковой способностью к регенерации, или она у структур различна. В 20-е годы Миэ (Miehe, 1926) считал, что не может быть идеального растения, у которого все структуры проявляют одинаковую способность к регенерации, и это различие он объяснил наличием или отсутствием в тканях гипотетической археплазмы, которая определяет саму возможность реализации потенций к регенерации. Допускалось также, что у растений имеются специальные клетки (і - клетки), которые, как правило, неравномерно распределены по растениям, и их скоплением объясняли ту или иную возможность к регенерации.
Однако во многих работах по черенкованию растений корнями, листьями, побегами были обнаружены различия в регенерации (корне- и побегообразовании) указанных структур в пределах одного и того же индивидуума и при сравнении разных видов растений. В этой связи сложилось представление, в соответствии с которым больше уделялось внимание вопросу о различиях регенерации растений и разных органов или структур растения. Однако с развитием метода культуры тканей и органов складывается мнение, что растительная клетка является тотипотентной и поэтому практически из клеток любой ткани можно достичь получения целого растения. Поэтому сам по себе вопрос мозаичности индивидуума в реализации процессов регенерации на сегодня нельзя считать окончательно решенным. Исход решения этого вопроса упирается в трудности - по каким показателям и по каким структурам ее оценивать? При этом необходимо разграничить сами понятия: способность и активность регенерации (Юсу-фов, 1967). В последующем изложении рассмотрены литературные данные, касающиеся мозаичности проявления потенций к регенерации и выбора показателей для их оценки.
Заметим, что в целом литература по регенерации растений обширна и труднообозрима. Способность к регенерации у растений рассматривается как универсальное явление (Кренке, 1950; Юсуфов, 1982). Виды и формы чаще всего отличаются по типам и формам ее проявления. Принимается во внимание не только тотипотентность изолированных клеток (Бутенко, 1975), но и разнообразие форм регенерации у растений (Юсуфов, 1982). С другой стороны, способность к регенерации обнаруживает большую изменчивость в зависимости от многих факторов (Дубровицкая, 1961; Турецкая, 1961; Комиссаров, 1964), что затрудняет оценку истинных потенций растений.
На фоне признания тотипотентности растительных клеток среди факторов, влияющих на проявление потенций к регенерации, наибольшие споры ведутся по вопросу о мозаичности индивидуума в этом отношении. Известно, что образующиеся в процессе дифференциации разные структуры растений имеют общую генетическую основу. В этой связи возникают сложности объяснения мозаичности потенций к регенерации. Однако показано, что способность к дифференциации и морфогенезу даже каллусных тканей определяется, среди прочих факторов, органоспецифичностью экс-планта (Бутенко, 1964; Каллак, Луук, 1986; Митрофанова, 1997). Одной из причин этого явления считают уровень специализации структур. Так, по мере усиления специализации структур у тканей (хлоренхима и механическая ткань) и органов (цветки, усы, соцветия, плоды), как правило, наблюдается снижение регенеративной активности (Юсуфов и др., 1981; Юсуфов, 1982, 1991). Вопрос состоит еще и в том, чтобы выяснить природу указанного различия. Структуры индивидуума отличаются по регенерации - по активности или способности? Как известно, эти понятия неоднозначны (Юсуфов, 1967).
На примере разных растений показана неодинаковая способность их органов и частей к каллусообразованию и ризогенезу, а также различия их отзывчивости к фитогормонам в культуре in vitro. Так, активность к каллу-согенезу наиболее выражена у эксплантов стеблей винограда (Абед Аль Азиз, 1994; Гамзатова, 1997), ежевики, малины, шиповника (Агаева, Хали-лова, 1978; Юсуфов и др., 1981), наименее - у листовых пластинок, чашелистиков и лепестков. Экспланты из стеблей указанных растений, в отличие от листовых пластинок и черешков, образовывали каллус даже на среде без фитогормонов. На такой среде не развивали каллус экспланты листьев сои, тогда как у гипокотилей, семядолей, стеблей он развивался (Гаджиева и др., 1991). В опытах с культивированием кусочков листа, соцветий, почек, стеблей Spathiphyllum с. Clevelandii, пролиферация и развитие было отмечено только на эксплантах почек и стебля (Fonnesbech М., Fonnesbech А., 1979). Наиболее высокой каллусообразующей способностью у сортов картофеля обладали кусочки клубней и стеблей. На них уже через две недели от начала культивирования формировалась большая кал-лусная масса. Получение каллуса из листьев требовало больше времени, и он отличался медленным ростом (Тикк, Коллист, 1992). В опытах же А.П. Шаровой и др. (1995) более высокая (по сравнению с листьями и стеблями) способность к формированию почек отмечена на эксплантах корней картофеля. В то же время у 7-дневных проростков Vigna trilobata к формированию каллуса и корней оказались способны экспланты гипокотилей, эпи-котилей, семядолей и листьев. Однако 100%-ную дифференциацию почек наблюдали только на каллусах эпикотилей. Экспланты из гипокотилей и целых листьев формировали растения с частотой 20% (Maruti et all, 1988). Подобные примеры можно привести и по другим объектам. Вопрос не только в наличии различий у разных структур индивидуума, но и у гомологичных образований у разных видов по активности к регенерации. Так, например, у Vigna trilobata низкая частота регенерации (органогенеза) наблюдалась при использовании каллусных культур, индуцированных из гипокотилей (Maruti et all, 1988), тогда как у люцерны такие структуры обнаруживали высокую морфогенную активность по сравнению с корнем и семядольными листьями (Калинина, 1994). У нескольких индийских сортов баклажана наиболее активно процессы регенерации реализовывались у гипокотилей, менее активно - у листьев и семядолей. На органогенез и соматический эмбриогенез очень значимое влияние оказывали и происхождение экспланта, и генотип, и взаимодействие генотип - эксплант (Sharma, Rajam, 1995).
В то же время есть данные о том, что регенерационные процессы идут активнее у листьев, чем у стеблей. Так, у зизифуса экспланты листьев реализовывали свой морфогенетический потенциал более активно, чем междоузлия (Пандей, Митрофанова, 1997).
Удается культивировать и укоренять даже экспланты лепестков, цветы и соцветия (Ono, Uehara, 1982; Юсуфов, Нуантхасинг, 1991; Юсуфов, Магомедова, 1998). Достигнуты большие успехи в культивировании изолированных корней (Строгонов, 1962; Смирнов, 1970; Wareing, Phillips, 1978).
Происхождение экспланта имеет значение и для других объектов: земляники, малины (Хамукова, 1994), чая, эхинацеи (Ling Jing Tian, Sauve Roger, 1996) и др. Различия в форме и активности проявления регенераци-онных процессов наблюдаются даже в пределах одного органа (Christopher et all, 1991). В большинстве случаев способность к органогенезу прогрессивно уменьшается у тканей, изолированных по направлению от верхушки до основания побега (Калинин и др., 1980; Катаева, Бутенко, 1983). Так, на первом листе от верхушки побега зизифуса (Zizyphus mauritiana и Zizyphus jujuba) образовался каллус максимальной величины (Пандей, Митрофанова, 1997). У эксплантов гипокотиля баклажана наблюдался базипетальный градиент органогенеза (т.е. снижение числа побегов от основания к верхушке). В тканях с высоким эмбриогенным потенциалом выявлен более высокий уровень коньюгированного спермидина наряду с высоким общим уровнем полиаминов (в особенности свободных фракций) (Sharma, Rajam, 1995). По данным J.W. Gilissen Luud et all (1996), у эксплантов из растущих междоузлий табака наблюдалась высокая способность к формированию зачатков побегов. Число же почек на один эксплант увеличивалось с увеличением длины междоузлия от 1 к 46 ярусам. Экспланты из зрелых междоузлий менее активно регенерировали почки, хотя на них каллус развивался хорошо. Способность к образованию зачатков корней была выше у эксплантов из зрелых верхних междоузлий, чем из растущих верхних междоузлий. Различия в регенерационной способности у эксплантов из разных ярусов многие авторы связывают с изменением уровня ауксина в них.
Почти любой орган растения (стебель, корень, лист, гипокотиль, цветоножку и цветок) можно использовать для культивирования. Показана способность корней и соцветий к формированию побегов (Синнот, 1963; Юсуфов, 1982; Юсуфов, Магомедова, 19986). Проведено сравнение активности к регенерации у стеблевых и листовых черенков одного и того же растения. При этом выделены растения, у которых побеги и листья укоренялись одинаково - хорошо (альтернантера, бегония королевская, пеперо-мия, плющ, табак, фикус, хризантема и др.); или плохо (вяз приземистый, клен, гортензия); или у которых укореняемость одних не зависела от уко-реняемости других (бирючина, ива белая, портулак, вишня, молочай, тополь) (Юсуфов, 1982).
Процессы регенерации у отделенных органов при постоянном культивировании в условиях засоления среды
Солеустойчивость - свойство целого растения, регулируемое на разных уровнях от клеточного до организменного (Хочачка, Сомеро, 1977; Лапина, Строгонов, 1979), поэтому его ткани и органы могут иметь неодинаковую чувствительность к действию солей (Комизерко, Хретонова, 1973; Керимов и др., 1993) . Отсюда предварительно важно было уточнить пороговую чувствительность разных структур к солевому стрессу . С этой целью мы изучали реакцию разных структур на растворы NaCl в широком диапазоне концентраций (5-80 мМ). На рис.4 приведены концентрационные кривые выживаемости разных структур. Исходя из этих данных, были отобраны концентрации для их культивирования в последующих опытах. Раствор 80 мМ NaCl оказался летальным для всех испытанных структур и объектов, состояние же их в растворе 5 мМ обычно не отличалось от контрольных. Поэтому в большинстве опытов (за исключением кратковременного действия засоления) изучалось действие растворов в диапазоне 10-40 мМ NaCl.
Переходим к анализу действия растворов NaCl на отделенные органы. Высокую чувствительность к ним проявляют отделенные листья (табл.2).
Так, растворы с концентрацией выше 5 мМ оказывали все возрастающее ингибирующее действие, сопровождающееся постепенным снижением их выживаемости, продолжительности жизни, каллусообразования и укореняемости. В растворах, превышающих 20 мМ, отмечено быстрое отмирание отделенных листьев у всех изученных объектов (рис.4-6).
В растворах меньших концентраций этому предшествовало пожелтение, что наиболее было выражено у ИЛ фасоли (и распространялось пятнами по пластинке), после чего происходило их завядание. О результатах хлоротично-сти листьев свидетельствуют и данные по содержанию хлорофилла в них (табл.3). Интересно сравнить характер изменения содержания хлорофилла в листьях контрольных и опытных растений. В наших опытах до развития мощных корней (на 7 день) в контроле содержание хлорофилла несколько снижалось, после их развития опять возрастало, как и в черенках других объектов (Абдул-лаева, 1969; Варнер, 1965; Юсуфов, 1988). В вариантах же засоления (10 и особенно 20 мМ) к такому же сроку (14 дней) содержание хлорофилла оставалось на низком уровне (что, видимо, было связано с токсическим действием, приводящим к ослаблению развития корней в первом случае и полному его подавлению во втором).
При культивировании уже в 15-20 мМ растворах листья отмирали без корней, но с каллусом (фасоль и баклажан). Каллусообразование, значительно менее выраженное, чем в контроле, наблюдалось в растворах только 10-30 мМ. В растворах 40 и 80 мМ листья фасоли отмирали ко 2-5 дню культивирования в результате быстрого завядания и высыхания пластинки. Потеря ими тургора происходила уже по истечении суток после помещения в раствор соли и даже раньше, отмечено развитие множества некротических пятен и отмирание черешков.
Длительное культивирование листьев оказалось возможным только в растворах, не превышающих 15-20 мМ. При этом в растворе 5 мМ регенерацион-ная активность листьев фасоли и баклажана оказалась даже выше, чем в контроле (укореняемость и количество корней на лист), а выживаемость достоверно не отличалась от контроля. Уже в растворе 10 мМ указанные показатели снижаются (табл.2). Так, укореняемость изолированных листьев в растворе 10 мМ оказалась лишь в пределах 30-50%. Снижение укореняемости по отношению к контролю у фасоли составила 2-2.5, а у баклажана - 1.4 раз. Темпы отмирания листьев различались у разных объектов (рис.5-7). Большую толерантность к действию хлорида натрия проявили отделенные листья баклажана. Так, выживаемость их в растворе 10 мМ NaCl на 17 день составила 90%, тогда как листьев фасоли - 40%).
Интересны различия объектов по темпам ризогенеза отделенных листьев. Так, в условиях засоления развитие корней у фасоли задерживалось на 2 дня по сравнению с контролем, у баклажана задержки не наблюдалось, иногда при засолении (10 мМ) корни закладывались даже раньше (рис.5,6).
Пороговые концентрации чувствительности обычно не совпадали и для разных процессов у одного и того же объекта. Наиболее чувствительным к засолению оказался процесс корнеобразования, менее - каллусообразования у листьев фасоли. Эта же тенденция характерна и для листьев баклажана и подсолнечника, независимо от солеустойчивости самих объектов. Так, процесс корнеобразования у листьев фасоли полностью ингибировался в растворе 15 мМ NaCl, а каллусообразования - в 25 мМ. Отделенные листья подсолнечника отмирали без формирования корней и со слабым каллусом уже в 10 мМ растворе NaCl.
Солеустойчивость растений и отделенных листьев не всегда коррелируют. Так, у более солечувствительной фасоли сильное подавление корнеобразо-вания наблюдалось уже в растворе 10 мМ, чего не замечено у баклажана. В этих же условиях подавлялось корнеобразование у листьев более солеустойчи-вого подсолнечника (рис.7).
Гипокотильные и стеблевые черенки одних и тех же растений проявили большую устойчивость к NaCl по сравнению с отделенными листьями при оценке ее по показателям выживаемости и корнеобразования. У них отмечен ризогенез в условиях засоления, уровень которого для листьев оказался сильно токсичным. Однако и черенки разных объектов отличались по чувствительности к засолению среды (табл.4,5).
Пороговые и летальные концентрации различались у объектов. У более солечувствительной фасоли в концентрациях, превышающих 40 мМ NaCl, наблюдалось быстрое (к 6 дню) отмирание стеблевых черенков без корней, а в растворе 20 мМ к 15 дню оставались живыми лишь отдельные из них. У подсолнечника и баклажана стеблевые черенки оказались более толерантными (табл.4, рис.8).
Черенки фасоли даже при несколько более низких концентрациях соли чаще повреждались, что сопровождалось пожелтением листьев, быстрым их опадением и отмиранием с потерей тургора, и высыханием пластинок с краев. Такие изменения происходили уже в растворе 10-20 мМ. Процессы ризогенеза у них сильнее ингибировались в условиях засоления по сравнению с ростом апекса (рис.9). Прирост побега (у 30% черенков) наблюдался и в условиях подавления ризогенеза - в 20 мМ растворе NaCl. Такое явление описано и на стеблевых черенках винограда, в том числе на примере солеустойчивого сорта Жемчуг Саба (Абед Аль Азиз, 1994).
Проявление эффекта солевого стресса в культуре in vitro
Специфика действия солевого стресса проверялась и в опытах in vitro на примере фасоли, баклажан и подсолнечника. Экспланты разных структур на среде МС проявляли неодинаковую жизнеспособность. Высокая выживаемость характерна для фототрофных эксплантов листьев (ЭЛ) фасоли и баклажан даже на минимальной среде (70 - 100%), чуть более низкая для ЭЛ подсолнечника. В этих же условиях у эксплантов семядолей (ЭС) фасоли формировался слабый каллус, тем не менее они быстро отмирали, ЭС баклажана и подсолнечника при этом обладали высокой выживаемостью и активностью каллусообразования. Эксплантам гипокотилей (ЭГ) фасоли и подсолнечника характерна лучшая выживаемость, чем баклажана. У баклажана на среде без фитогормонов замечен ризогенез в пределах 50%) у ЭГ, и в единичных случаях у ЭС. У подсолнечника на минимальной среде каллус формировали только ЭС (90%).
Интенсивность каллусо- и корнеобразования заметно возрастала при внесении в среду фитогормонов. Тип и мощность развития каллуса зависел от объекта, происхождения экспланта, изменения соотношения фитогормонов в среде и возраста материнского растения. С возрастом растений у эксплантов снижалась активность роста и каллусообразования, а также выживаемость (табл. 17,18).
Экспланты гипокотилей всех объектов in vitro формировали мощный каллус, преимущественно рыхлой консистенции и желтой окраски. Размер каллуса, образованного на ЭГ 25-30 дневных растений баклажана, уступал таковым 7 -10 дневных. Корни на минимальной среде формировались только у основания ЭГ баклажан, взятых с более молодых проростков, а почки - на верхнем конце. В варианте ИМК:БАП (0.5:2.5 мг/л) у ЭГ 7-Ю дневных проростков происходило развитие множества почек на верхнем конце, а на нижнем - только мощного каллуса (без корней). У 30-дневных в этом же варианте формировался только каллус на нижнем конце. Каллусогенез в пределах 70-85% у сравниваемых эксплантов 7-Ю и 25-30 дневных проростков наблюдался и при соотношениях ИМК:БАП 3:1, 1:3, 2:2. При этом у последней возрастной группы несколько снижалась мощность развития каллуса.
Каллус у ЭЛ фасоли и баклажан, а у последних - и семядолей, отличался более плотной консистенцией, чем у гипокотилей. В нем нередко наблюдалось формирование корней и почек (табл. 17,18). Во всех вариантах опыта отмечено разрастание ЭЛ в 2-4 раза. На ЭЛ баклажана развитие каллуса сопровождалось развитием корней в пределах 20-30% (на 30 день культивирования). Корни у ЭЛ формировались преимущественно при слабом развитии каллуса (рис.15). Торможение заложения придаточных корней у стеблевых черенков ряда растений при чрезмерном разрастании каллуса свидетельствует о том, что процессы образования каллуса и дифференциации корневых зачатков придаточных корней, несмотря на некоторую общность на первых стадиях, различны и регулируются разными механизмами (Иванова, 1982).
На среде ИМК:БАП (2:1) корнеобразование в пределах 60-70% замечено у ЭЛ даже 70-80-дневных растений, что сочеталось со слабым развитием каллуса. Обратная зависимость между мощностью развития каллуса и активностью процесса ризогенеза замечена и у ЭЛ и ЭГ фасоли (рис. 16).
При высокой выживаемости всех эксплантов у подсолнечника обычно более интенсивное каллусообразование наблюдалось у ЭГ, ЭС и ЭЧ, менее - у ЭЛ. ЭЛ, а также ЭС после помещения на среду значительно увеличивались в размерах.
Экспланты листьев и гипокотилей фасоли культивировали также с раздельным введением в среду ИМК и БАП (рис.16). В варианте с ИМК (0.5 мг/л)
ЭЛ каллус не образовывали, развивались только корни. А у ЭГ развивались и каллус, и корни. Вариант с введением БАП заметно не отличался от варианта ИМК+БАП. Сроки закладки корней существенно зависели от содержания гормонов в среде. Так, на среде с ИМК (0.5 мг/л) корни появлялись уже на 5-6 день, а с ИМК. БАП (0.5:2.5) - на 30-33 день. Различались варианты и по размерам корней. Так, максимальная их длина составила по вариантам ИМК:БАП около 18, ИМК - 51 и БАП - 20 см.
У ЭС 7-Ю - дневных проростков баклажана происходило формирование корней в варианте ИМК:БАП (3:1) в пределах 80%, при соотношении 2:2, 1:3 у 30-40%. У ЭС 30-дневных проростков в единичном виде формировались корни только в последних двух вариантах.
Экспланты черешка фасоли и подсолнечника характеризовались более высокими показателями выживаемости и каллусообразования, чем баклажана. Но ризогенеза на ЭЧ у обеих культур на 30 день культивирования не наблюдалось (табл. 17,18, 22).
Итак, экспланты разных структур фасоли, баклажана и подсолнечника, хотя в целом и обладают высокой регенеративной активностью, обнаруживают различия между собой. У фасоли экспланты семядолей отличаются низкой выживаемостью и каллусообразованием, а у баклажана и подсолнечника - высокими. Заметим, что и семядоли фасоли (в интактном и изолированном состоянии) вообще характеризуются низкой продолжительностью жизни (Юсуфов, 1992). ЭЛ имеют высокие показатели жизнеспособности. Мощный рыхлый каллус формировали ЭГ всех объектов. Различия между объектами и эксплан-тами выражены и на минимальной среде (высокую выживаемость имеют ЭЛ обеих культур, а каллус и корни формируют только ЭЛ фасоли), но особенно значительны при введении в среду фитогормонов.
Рассмотрим теперь специфику объектов и структур в условиях солевого стресса. Минимальную выживаемость при засолении среды обнаруживают ЭС фасоли (табл.19).
Она слабо выражена даже при 0.5 % NaCl и составила на 30 день 10 %, тогда как у ЭЛ и ЭГ ее некоторое снижение наблюдается только при засолении 1 %. В целом же экспланты гипокотилей у фасоли оказались менее чувствительными к засолению, чем листьев. Процент эксплантов с каллусом при 1 % засолении у гипокотилей снижался незначительно, а у семядолей и листьев - в 2-3 раза.
Солевой стресс сильнее подавлял прирост биомассы экспланта и каллуса у ЭЛ, чем ЭГ (рис.17).
При этом на среде МС с добавлением 0.5 % NaCl у ЭГ наблюдалось даже некоторое стимулирование процесса каллусообразования. Масса каллуса, образовавшегося на ЭГ к 30 дню культивирования, при этом составила 120 %, на ЭЛ - 96 % по сравнению с контролем. В варианте с засолением 1 % NaCl - 53 и 36 % соответственно. Тип каллуса менялся по вариантам, он был более разнообразным в варианте с 0.5 % (от рыхлого до плотного, обычно желтый или белый), тогда как в варианте 1 % NaCl формировался коричневый и плотный каллус. Более чувствительным к солевому стрессу оказался процесс корнеобра-зования, который подавлялся у всех эксплантов уже в варианте 0.5 % NaCl. Суммируя все показатели, можно построить убывающий ряд чувствительности эксплантов фасоли к солевому стрессу: ЭС, ЭЛ, ЭГ, что соответствует ряду чувствительности, полученному в опытах с культивированием структур в нестерильных условиях. Структуры баклажана также отличались по чувствительности к солевому стрессу. Засоление (1 % NaCl) приводило к высокой летальности у ЭГ (табл. 19), обычно без каллуса. У ЭС снижение показателей выживаемости, интенсивности и мощности каллусообразования оказалось менее значительным, чем у ЭГ. При этом некоторые различия наблюдались между эксплантами, взятыми с 7- и 25- дневных проростков (табл.20, 21). Так, масса каллуса, образованного на ЭС указанных возрастных групп, была в контроле (без соли) 252 и 575 мг соответственно, а при введении 1 % - уже 86 и 153 мг (табл.20). В контроле образование корней замечено у 33 % ЭС 7 дневных и 18 % - 25-дневных проростков. Введение соли в среду ингибировало ризогенез у ЭС независимо от возраста. По показателям выживаемости, прироста и каллусообразования преимущество отмечено у ЭС 25-дневных, а ЭГ -7-дневных проростков. В варианте без засоления на каллусах ЭС (и 7-, и 25-дневных) закладывались почки, что полностью подавлялось при засолении среды. Почки формировались на ЭГ 7-дневных проростков (60 %) только в контроле (табл. 17-21).
ЭЛ баклажана менее чувствительны к солевому стрессу, что проявлялось в более высоких (чем у ЭГ и ЭС) показателях выживаемости и каллусообразования (табл.19). Так, выживаемость, прирост и каллусообразование ЭЛ при введении в среду соли (1%) составили для фасоли соответственно 39, 76 и 53 % по сравнению с контролем, а для баклажан все показатели остались на уровне контроля. У всех структур и баклажана, и фасоли в условиях засоления процесс корнеобразования сильнее ингибировался, чем каллусообразование.
Засоление приводило к снижению показателей выживаемости, роста и каллусообразования также и у эксплантов подсолнечника. При этом добавление хлорида натрия (1%) к минимальной среде МС способствовало быстрому отмиранию всех эксплантов, а слабый каллус отмечен только у 10% ЭС (табл. 19, 22), наблюдалась также задержка развития каллуса.
Одновременное же введение регуляторов роста и соли приводило к полному подавлению каллусообразования у ЭЛ и ЭЧ, а у ЭС и ЭГ наблюдалось, но происходило менее активно, чем на среде без соли (рис.18). Масса экспланта семядоли к 20 дню культивирования в варианте без соли и регуляторов достигала 155±26 мг, в варианте только с солью (1% NaCl) - 64+9. На среде с регуляторами и без соли масса экспланта с каллусом составила 293±43 мг, а на среде с солью и регуляторами - 160+20 мг. Интенсивность каллусообразования ЭГ также снижалось в условиях NaCl засоления, что показано и для других сортов (Prakash, 1993).
Качественная характеристика действия солевого стресса на отделенные органы растений
Говоря об угнетении процессов роста и регенерации у изолированных структур в условиях засоления (особенно с повышением его уровня), нельзя забывать и о специфике реакции разных объектов, структур и эксплантов на засоление. Для характеристики этой специфики мы обобщили наш материал (табл. 38).
Различия между реакцией стеблевых черенков разных объектов по-разному проявляются в зависимости от силы стрессового воздействия. Есть данные, что они наиболее заметны в зоне сублетальных концентраций соли (Шевякова, Каролевски, 1994). В наших опытах при слабом и умеренном уровнях засоления (от 10 до 40 мМ в зависимости от объекта) возникали специфические повреждения, соответствующие физиологической норме устойчивости объектов и структур. При возрастании концентраций раствора соли меняется и частота встречаемости разных типов повреждений. В условиях 20-50 мМ для изолированных структур характерны симптомы резкого угнетения морфогенеза, хотя специфика проявляется. С дальнейшим возрастанием токсичности раствора различия в реакции видов ослабевают (Абед Аль Азиз, 1994): в области концентраций 80 мМ и выше наблюдалось быстрое и однотипное отмирание изолированных структур у всех наших объектов.
На примере разных растений видно, что пороговые концентрации чувствительности обычно не совпадают как для разных процессов, так и структур (табл.39). Это тем более справедливо для разных объектов. По мере упрощения модели - целое растение — отделенная структура (разные по степени сложности) чувствительность к засолению, как правило, возрастает. При этом имеет значение и происхождение структуры: фрагмент эпикотиля, или гипокотиля, или листовой пластинки (с черешком или без него), их экспланты in vitro ведут себя по-разному. При одинаковой выживаемости, структуры могут отличаться по активности каллусо- или корнеообразования в условиях засоления.
Наиболее близка реакции на солевой стресс целого растения реакция стеблевых черенков. Однако еще раз надо подчеркнуть, что анализа какого-либо одного конкретного показателя, будь то выживаемость или укореняемость черенков, недостаточно для оценки реакции на засоление целых растений. Важно учитывать комплекс таких показателей.
В целом изолированные структуры фасоли составили следующий убывающий ряд по выживаемости и продолжительности жизни в условиях засоления: гипокотильные черенки стеблевые черенки отрезки гипокотиля, тогда как по у кореня емости: гипокотильные черенки отрезки гипокотиля стеблевые черенки отделенные листья отделенные листья без черешков отрезки эпикотиля. В отсутствие засоления эти ряды выглядят несколько иначе. По выживаемости и продолжительности жизни: гипокотильные черенки стеблевые черенки отделенные листья отделенные листья без черешков отрезки ги покотиля отрезки эпикотиля. По укореняемости: гипокотильные черенки стеблевые черенки.
В целом связь между солеустойчивостью объекта и жизнеспособностью его изолированных структур в условиях солевого стресса сильнее выражена у стеблевых черенков, наиболее приближающихся по уровню организации к целому растению. Это показано нами на разных объектах (табл.39, 40).
У упрощенных структур (отделенных листьев, отрезков эпикотилей или гипокотилей) такая связь не всегда наблюдается. Однако и для стеблевых черенков, как и для других изученных отделенных структур, говоря об их жизнеспособности в условиях солевого стресса, следует различать выживаемость и процесс ризогенеза. Процессы ризогенеза более чувствительны к солевому стрессу (табл.39, 40). Ризогенез оказался наиболее четким показателем, характеризующим функциональное состояние отделенных органов в условиях соле 40). В связи с этим ризогенез стеблевых черенков в условиях засоления может быть использован как тестовый показатель для оценки солеустойчивости объекта, как наиболее соответствующий реакции целого растения.
