Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 11
2.1 Низкотемпературный стресс у растений 11
2.1.1 Причины гибели растительной клетки при низкотемпературном стрессе 14
2.1.2 Адаптация растений к низким температурам 16
2.2 Структурные и функциональные особенности митохондрий растений 19
2.2.1 Краткая характеристика растительных митохондрий 20
2.2.2 Дыхательная система растительных митохондрий и окислительное фосфорилирование 21
2.3 Термогенез у растений 25
2.3.1 Выделение тепла у термогенных растений 26
2.3.2 Альтернативная оксидаза 30
2.3.3 Возможность терморегуляции у нетермогенных растений при действии низких температур 33
2.3.4 Разобщающие белки 36
2.3.4.1 UCP-подобные белки животного происхождения 38
2.3.4.2 Растительные разобщающие белки 39
2.3.4.3 Механизм разобщения 42
2.3.4.4 БХШ 310 - растительный разобщающий белок, не принадлежащий к семейству UCP-подобных белков 44
2.4 Низкотемпературный стресс и перекисное окисление липидов 47
2.4.1 Перекисное окисление липидов 47
2.4.2 Механизм реакций ПОЛ 49
2.4.3 Активные формы кислорода 52
2.4.4 ПОЛ и повреждения в клетке 56
2.4.5 Взаимосвязь ПОЛ и различных видов стресса 59
2.4.6 ПОЛ в митохондриях растений 64
2.5 Выводы из обзора литературы, цель и задачи исследования 67
3 Материалы и методы 71
3.1 Подготовка растительного материала 71
3.2 Измерение термогенеза тканей проростков растений 71
3.3 Получение препаратов стрессового белка БХШ 310.72
3.3.1 Выделение цитоплазматических белков 72
3.3.2 Получение белковой фракции, обогащенной стрессовым белком БХШ 310 72
3.3.3 Фракционирование белков с помощью гель-фильтрации 73
3.3.4 Подготовка к работе неиммунной сыворотки и антисыворотки против БХШ 310 73
3.4 Определение интенсивности дыхания проростков 74
3.5 Определение диеновых коньюгатов 74
3.6 Определение изменений ростовой реакции проростков озимой пшеницы после обработки разобщителем и действия низкой температуры 75
3.7 Определение выживаемости проростков после низкотемпературного стресса 75
3.8 Статистическая обработка данных 76
4 Результаты и их обсуждение 77
4.1 Термогенез у проростков растений при низкотемпературном стрессе 77
4.1.1 Дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой пшеницы при заданной внешней температуре 78
4.1.2 Дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой ржи, кукурузы и гороха при заданной внешней температуре 80
4.1.3 Вклад различных термогенных систем в термогенез у растений 82
4.1.3.1 Влияние ингибиторов на дыхание проростков озимой пшеницы 83
4.1.3.2 Влияние ингибиторов на дифференциальные термические кривые проростков озимой пшеницы 84
4.1.3.3 Влияние БХШ 310 и сыворотки против данного стрессового белка на дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой пшеницы 86
4.1.3.4 Роль различных термогенных систем при термогенезе у проростков гороха в течение низкотемпературного стресса 89
4.2 Изучение влияния разобщителей и ингибиторов дыхания на выживаемость проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе 90
4.2.1 Влияние различных концентраций СССР на интенсивность дыхания проростков озимой пшеницы 90
4.2.2 Динамика дыхания проростков озимой пшеницы, инфильтрованных водой и водным раствором СССР 92
4.2.3 Сравнительный анализ воздействия БХШ 310 и СССР на дыхание проростков озимой пшеницы 93
4.2.4 Влияние разобщителей окислительного фосфорилирования на дифференциальные термические кривые проростков озимой пшеницы... 94
4.2.5 Разработка методики определения выживаемости проростков растений 95
4.2.6 Влияние разобщителей окислительного фосфорилирования на выживаемость проростков озимой пшеницы, подвергнутых холодовому шоку 97
4.2.7 Изменения ростовой реакции проростков озимой пшеницы после обработки разобщителем и действия низкой температуры 99
4.2.8 Влияние ингибиторов митохондриальных термогенных систем на выживаемость проростков озимой пшеницы, подвергнутых низкотемпературному стрессу 100
4.3 Исследование термогенеза у закаленных проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе 103
4.3.1 Воздействие низкотемпературного стресса на дифференциальные кривые охлаждения незакаленных и закаленных проростков озимой пшеницы 104
4.3.2 Влияние ингибиторов дыхания на выживаемость закаленных проростков озимой пшеницы 106
4.4 Изучение роли разобщенного и несопряженного дыхания в процессах пол у проростков озимой пшеницы в течение низкотемпературного стресса 109
4.4.1 Сравнительный анализ влияния ингибиторов и активаторов несопряженного и разобщенного дыхания на ПОЛ у проростков озимой пшеницы в течение низкотемпературного стресса 110
4.4.2 Влияние разобщающего стрессового белка БХШ 310 на перекисное окисление липидов у проростков озимой пшеницы при низкотемпературном стрессе 113
5 Заключение 117
6 Выводы 124
7 Литература 125
- Дыхательная система растительных митохондрий и окислительное фосфорилирование
- БХШ 310 - растительный разобщающий белок, не принадлежащий к семейству UCP-подобных белков
- Дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой ржи, кукурузы и гороха при заданной внешней температуре
- Влияние ингибиторов митохондриальных термогенных систем на выживаемость проростков озимой пшеницы, подвергнутых низкотемпературному стрессу
Введение к работе
Изучение адаптивных возможностей растений и их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды относится к центральным проблемам биохимии и физиологии растений. Особенно актуальными в данном направлении остаются исследования, направленные на установление механизмов адаптации растительных объектов к низким температурам. Прежде всего, это связано с тем, что низкотемпературный стресс и вызываемые им повреждения являются одними из основных факторов, ограничивающими рост, урожайность и распространение растений на земном шаре. Во многих случаях повышение морозоустойч^июсти_ культурных растений всего на 2-3 С может обеспечить получение хорошего урожая там, где они пока не выращиваются из-за низкой температуры. Известно, что в нашей стране большинство пахотных земель находятся в так называемых «зонах рискованного земледелия», где неблагоприятные температурные условия возникают часто, либо постоянно. Таким образом, исследование механизмов адаптации растений к низкотемпературному воздействию имеет не только важное теоретическое, но и огромное практическое значение, поскольку дает возможность определения путей для создания приемов, повышающих холодоустойчивость ценных сельскохозяйственных культур.
В настоящее время общепринятой точкой зрения на причины гибели iff'Г «. растительной клетки при действии низких \у температур считается образование внутри- и внеклеточного льда. В последние годы особое внимание исследователей привлекает также токсичное действие на организм активных форм кислорода (АФК), содержание которых резко возрастает как при гипотермии, так и при других типах стресса. За более чем столетний период изучения адаптационных механизмов растений создана огромная база данных, показывающая, что низкотемпературный стресе сопровождается рядом физиологических и биохимических изменений, направленных на преодоление действия неблагоприятного фактора. К ним относятся изменения в метаболизме липидов и фосфолипидов, накопление криопротекторных веществ, что в целом позволяет избежать механического повреждения мембран кристаллами льда, последствий обезвоживания и повреждения клеточных структур. Установлено, что температурное воздействие изменяет генную экспрессию: происходит индукция синтеза стрессовых, обладающих специфичными функциями, белков на фоне замедления или прекращения общего белкового синтеза. В последнее десятилетие была выделена и охарактеризована группа белков низкотемпературного стресса [Thomashow, 1998], среди которых, в частности, выделяют белки разобщающие окисление и фосфорилирование в митохондриях. Изучение разобщающих белков началось с открытия белка, названного термогенином или UCP-1, специфичного для бурой жировой ткани млекопитающих. UCP-1 является высокорегулируемым переносчиком протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, транспорт которых активируется жирными кислотами. В активированном состоянии UCP-1 служит промежуточным звеном возврата протонов в матрикс, в результате чего энергия электрохимического потенциала, генерируемая дыхательной цепью, рассеивается в виде тепла и происходит разобщение дыхания и фосфорилирования [Скулачев, 1989; Palou et al., 1998]. Все разобщающие белки (в англ. транскрипции - uncoupling proteins, UCP) имеют высокую степень гомологии и принадлежат к семейству митохондриальных анионных переносчиков. Основными физиологическими функциями UCP-подобных белков у животных считаются участие в терморегуляции посредством термогенеза [Ricquier et al., 2000], регуляция метаболического и энергетического баланса, а также снижение образования АФК. Впервые наличие у растений разобщающих белков (plant mitochondrial uncoupling proteins, PUMP) было показано Vercesi с соавторами [Vercesi et al., 1995], которыми был выделен и охарактеризован белок внутренней мембраны митохондрий клубней картофеля. В дальнейшем PUMP были обнаружены в митохондриях других растений [Laloi et al., 1997; Jezek et al., 1998; Vercesi etal., 2001].
Как считалось ранее, механизмы регулируемого разобщения окисления и фосфорилирования под действием различных факторов внешней среды [Скулачев, 1989], присущи только животным организмам. Однако в последние годы в растениях также были обнаружены физиологические системы, способные диссипировать энергию, генерируемую митохондриями [Побежимова и др., 1996; Laloi et al., 1997; Vanlerberghe, Mcintosh., 1997; Moller, 2001; Casolo et al., 2003; Rasmusson et al., 2004]. Существование у растений таких систем, одним из следствий функционирования которых является термогенез, позволяет предположить, что, несмотря на общепринятую среди физиологов точку зрения о пойкилотермности растений, они способны к некоторой регуляции температуры тела. Интерес к данной гипотезе возрастает благодаря тому факту, что в отличие от животных, имеющих только одну митохондриальную энергорассеивающую систему (UCP-подобные разобщающие белки), у растений обнаружено несколько таких систем. К ним, в частности, относится альтернативная оксидаза, открытие которой тесно связано с изучением феномена теплопродукции у так называемых «термогенных» растений [Raskin et al., 1987]. Генеративные органы некоторых цветковых за счет высокой активности цианидрезистентного дыхания поддерживают температуру своих тканей на уровне, значительно превышающем температуру окружающего воздуха. Например, установлено, что термогенез у цветков Symplocarpus foetidus может происходить с такой интенсивностью, что их температура на 35 С выше температуры окружающей среды [Knutson, 1974]. У некоторых видов, так называемых «нетермогенных» растений, было обнаружено увеличение активности альтернативной оксидазы во время холодового стресса и в процессе закаливания растения к холоду [Stewart et al., 1990; Vanlerberghe, Mcintosh, 1992; Ito et al., 1997], что позволяет предположить участие альтернативной оксидазы в термогенных процессах, связанных с защитой растения от воздействия низкой температуры окружающей среды.
Необходимо подчеркнуть, что о термогенезе у нетермогенных растений в литературе имеется весьма ограниченное число данных. Мнение исследователей о возможной терморегуляторной роли альтернативной оксидазы и UCP-подобных разобщающих белков растений при низкотемпературном стрессе остается противоречивым [Ordentlich et al., 1991; Nevo et al., 1992; Moynihan et al., 1995; Breidenbach et al., 1997; Jarmuszkiewicz et al., 2001; Jezek et al., 2001; Calegario et al., 2003].
В последние годы у озимых злаков была обнаружена еще одна энергорассеивающая система, связанная с функционированием стрессового белка — БХШ 310, который вызывает разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях при низкотемпературном стрессе. Данный белок отличается от UCP-подобных белков по механизму действия, т.к. его разобщающая активность не зависит от содержания свободных жирных кислот в клетке [Колесниченко и др., 1996; Войников и др., 2001а]. В тоже время БХШ 310 не является активатором альтернативной оксидазы, поскольку, как было показано, вызванное его добавлением увеличение нефосфорилирующего дыхания и термогенез ингибируется KCN [Войников и др., 2001а].
Таким образом, у растений имеется несколько энергорассеивающих систем, которые, возможно, участвуют в защите организма от повреждающего действия низких температур. В связи с этим настоящая работа посвящена изучению физиологической роли некоторых энергорассеивающих систем митохондрий растений при низкотемпературном стрессе.
Автор выражает благодарность всему коллективу лаборатории физиологической генетики СИФИБР СО РАН, а особенно научному руководителю Войникову В.К., руководителю исследовательской группы д.б.н. Колесниченко А.В., а также д.б.н. Побежимовой Т.П., к.б.н. Грабельных О.И.
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Дыхательная система растительных митохондрий и окислительное фосфорилирование
Суть процесса окислительного фосфорилирования состоит в сопряжении потока электронов, направленного от субстратов (например, НАДН или сукцината) к кислороду, с перемещением протонов из матрикса митохондрий через мембрану в межмембранное пространство. Перенос протонов через мембрану осуществляется дыхательной цепью, представляющей собой электронтранспортный мультиферментный ансамбль. При этом на внутренней мембране генерируется градиент электрохимического потенциала протонов (протондвижущая сила), используемый для синтеза АТФ.
Дыхательная цепь митохондрий растений и животных имеет сходную организацию, основные отличия касаются цианид (С1М)-резистентного пути переноса электронов и строения НАДН-дегидрогеназного сегмента дыхательной цепи [Robertrs et al., 1995; Soole, Menz, 1995]. Растительные митохондрии способны окислять как эндогенный, так и экзогенный НАДН. Все переносчики электронов в митохондриях сгруппированы в четыре комплекса (рис. 1).
Комплекс I осуществляет перенос электронов от НАДН к убихинону. Он содержит ротенончувствительную НАДН-убихинон-оксидоредуктазу. В его состав входят ФМН и железосерные центры. Согласно современным данным на поверхности внутренней мембраны локализована НАДН дегидрогеназа, резистентная к ротенону [Palmer, Ward, 1985]. Благодаря деятельности «внешней» НАДН-дегидрогеназы окисляются цитозольные НАД(Ф)Н. Митохондрии животных используют для этой цели челночные механизмы, работающие с затратой энергии.
Комплекс II (сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза) осуществляет транспорт электронов от сукцината к убихинону. В его состав входят ФАД и три железосерных центра. Перенос электронов на данном этапе ингибируется малонатом и оксалоацетатом; активируется сукцинатом, АТФ, АДФ, НАДН и др. агентами. Имеются сведения, что торможение активности сукцинат-дегидрогеназы оксалоацетатом, появляющееся после 2-6-ти часового охлаждения, выступает в качестве одного из механизмов, позволяющих растениям адаптироваться к действию низких температур [Войников, 1987].
Комплекс III (убихинон-цитохром с оксидоредуктаза) переносит электроны от восстановленного убихинона к цитохрому с. Его структурная организация в митохондриях растений изучена пока слабо. Известно, что в его состав входят цитохромы Ь5бо и bs66 цитохром с і и железосерный белок Риске. Этот комплекс чувствителен к антимицину А [Шугаев, 1991].
Комплекс IV (цитохром ооксидаза) осуществляет одну из терминальных реакций дыхательной цепи растений (другую обеспечивает альтернативная оксидаза). Цитохром с-оксидаза катализирует окисление цитохрома с, локализованного в межмембранном пространстве митохондрий, и восстановление кислорода до воды. Фермент содержит две простетические группы гема (а и аз), а также два атома меди. Цитохром с-оксидаза блокируется цианидом, азидом, СО. Это очень консервативный фермент, мало изменившийся в процессе эволюции [Геннис, 1997].
В переносе электронов участвуют еще два переносчика, определяющих полную электронтранспортную последовательность: убихинон (CoQ) и цитохром с. Убихинон функционирует как переносчик электронов между НАДН - и сукцинатдегидрогеназами и цитохромной системой. В литературе также обсуждается его участие в антиокислительной защите клетки [Побежимова, Войников, 1999].
Перенос электронов через комплекс I, III и IV сопровождается транслокацией протонов через мембрану из матрикса в межмембранное пространство. По теории П. Митчелла электрохимический градиент протонов А Дн+ является источником энергии для синтеза АТФ за счет обратного тока протонов через канал митохондриальной АТФ-синтазы [Скулачев, 1989]. Механизм, по которому протоны переносятся к АТФ-синтазе, до конца не установлен [Fergyson, 1985]. Растительная АТФ-синтаза относится к АТФазам FoFi-типа и состоит из двух частей: гидрофильного Fi-комплекса, содержащего места связывания нуклеотидов и функционирующего в качестве АТФазы, и мембраносвязанного Fo-комплекса, который функционирует как протон-проводящий канал.
Еще одной отличительной чертой растительных митохондрий является наличие альтернативного пути переноса электронов, устойчивого к действию цианида. Он обусловливается активностью цианидрезистентной оксидазы (альтернативной оксидазы). Местом ответвления альтернативного от основного пути переноса электронов является убихинон. Альтернативная оксидаза катализирует перенос электронов от восстановленного убихинона на кислород с образованием воды [Moore, Siedow, 1991]. При функционировании альтернативной оксидазы происходит заметное снижение эффективности синтеза АТФ, так как процесс окислительного фосфорилирования может осуществляться в данном случае только при окислении субстратов в первом пункте сопряжения (комплекс I) [Меденцев и др., 1999].
Помимо синтеза АТФ в митохондриях происходит ряд других процессов. Матрикс органелл содержит ферменты цикла Кребса, а также ферменты, окисляющие пируват и жирные кислоты. Еще одна функция митохондрий состоит в аккумуляции клеточного кальция [Nicholls, 1981]. В последнее время в литературе широко обсуждается ключевая роль митохондрий в апоптозе (запрограммированная смерть клетки) [Скулачев, 1996; Papa, Skulachev, 1997; Skulachev, 1998а; Куцый и др., 1999; Зенков и др., 1999]. Одной из наиболее слабо изученных к настоящему времени, но не менее важной альтернативной функцией растительных митохондрий является генерация тепла (термогенез).
БХШ 310 - растительный разобщающий белок, не принадлежащий к семейству UCP-подобных белков
Растительный разобщающий белок (белок холодового шока - БХШ 310) был выделен в иммунохимически и электрофоретически чистом виде из проростков озимой ржи в 1996 году в лаборатории физиологической генетики СИФиБР. Установлена молекулярная масса нативного белка 310 кДа, а также его субъединиц - 56 и 66 кДа [Колесниченко и др., 1996]. БХШ 310 увеличивает скорость нефосфорилирующего дыхания и снижает сопряжение окисления и фосфорилирования при гипотермии [Побежимова и др., 1996; Voinikov et al., 1998]. Таким образом, данный белок выполняет в растениях функцию разобщающего белка.
Показано значительное увеличение содержания БХШ 310 в течение первого часа гипотермии. С использованием радиоактивной метки доказано, что накопление БХШ 310 в первые моменты стресса происходит за счет синтеза de novo [Borovskii et al., 1999]. В ходе дальнейшего закаливания в первые сутки количество БХШ 310 в проростках озимой пшеницы уменьшается, тогда как на третьи оно начинает повышаться и достигает максимума к концу семидневного закаливания. Эти результаты согласуются с увеличением холодоустойчивости растений в период закаливания [Borovskii et al., 1999]. Оказалось также, что более морозоустойчивые сорта злаков отличаются повышенным содержанием данного белка по сравнению с менее морозоустойчивыми [Колесниченко и др., 1997].
Установлено, что гены, регулирующие экспрессию данного белка у озимой морозоустойчивой пшеницы Альбидум 114, локализованы в первой и шестой хромосомах D-генома [Войников и др., 1998]. У озимых злаков (пырейник сибирский, озимая рожь, озимая пшеница) обнаружено целое семейство белков, иммунохимически родственных БХШ 310, которое вероятно является полифункциональным [Kolesnichenko et al., 1999; Kolesnichenko et al., 2000a,b; Колесниченко и др., 2000].
В отличие от UCP-подобных белков, которые являются интегральными белками внутренней мембраны митохондрий [Jezek et al., 2000], БХШ 310 является цитоплазматическим белком [Колесниченко и др., 1996]. В опытах с митохондриями in vitro было обнаружено, что при разобщении окислительного фосфорилирования экзогенный БХШ 310 ассоциирует с органеллами и локализован снаружи митохондрий. При этом с интактными митохондриями ассоциировала нативная форма БХШ 310, а с инактивированными под действием СССР и KCN - субъединицы данного белка [Kolesnichenko et al., 2000с].
В ходе дальнейших исследований были обнаружены две формы белка. Конститутивно синтезируемая форма связана с нуклеиновой кислотой и не обладает разобщающей активностью. Белок, выделенный из проростков озимой ржи, подвергшихся низкотемпературному стрессу, не связан с лигандом и проявляет разобщающие свойства [Pobezhimova et al., 2001].
При исследовании механизма функционирования БХШ 310 было установлено, что основной разобщающий эффект БХШ 310 направлен на комплекс I дыхательной цепи [Grabelnych et al., 2001a]. При этом разобщающий эффект БХШ 310 не зависит от наличия СЖК в клетке [Войников и др., 2001а]. Таким образом, механизм разобщающего действия БХШ 310 отличается от механизма классических разобщающих белков. По-видимому, БХШ 310 шунтирует основную дыхательную цепь (рис. 3), передавая электроны от комплекса I к цитохрому с, с которого они транспортируются затем на комплекс IV [Kolesnichenko et al., 2005].
В связи с разобщающей способностью БХШ 310 было предположено, что этот белок может участвовать в термогенезе у растений. Биологические мембраны являются основной мишенью действия стрессовых факторов. С их повреждением связывают нарушение жизнедеятельности клетки и всего организма в целом. Было замечено, что при гипотермии, как и при действии многих других стрессоров, активируются окислительные процессы, в частности перекисное окисление мембранных липидов [Владимиров, Арчаков, 1972; Тарусов, Веселовский, 1978; Жиров и др., 1982; Куликов и др., 1988; Константинов и др., 1989; Мерзляк, 1989]. Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) постоянно происходит в клетке. Он протекает с небольшой скоростью благодаря «высоко эшелонированной» антиокислительной системе защиты. Продукты перекисного окисления вовлекаются в нормальный метаболизм клеток [Бурлакова, Храпова, 1985; Albert et al., 1986; Мерзляк, 1989]. При продолжительном действии повреждающего фактора расход антиоксидантов превышает их биосинтез, количество активных продуктов ПОЛ возрастает, что обуславливает гибель клетки вследствие ряда деструктивных процессов [Владимиров, Арчаков, 1972; Владимиров и др., 1991; Барабой и др., 1992]. Таким образом, устойчивость растений к низким температурам и другим экстремальным факторам может быть связана со способностью клеток препятствовать развитию процессов окислительной деградации мембранных липидов.
Явление перекисного окисления липидов (ПОЛ) чрезвычайно широко распространено и обнаруживается не только в искусственных, но и в природных мембранах [Владимиров, Арчаков, 1972]. Оно проявляется как при многих патологических процессах и состояниях, так и при некоторых процессах нормальной жизнедеятельности [Тарусов, 1962].
Дифференциальные кривые охлаждения проростков озимой ржи, кукурузы и гороха при заданной внешней температуре
По определению И.И. Иванова, АФК есть совокупность короткоживущих, взаимопревращающихся и относительно реакционноспособных форм кислорода, возникающих в результате его электронного возбуждения или окислительно-восстановительных превращений [Мерзляк, 1989]. АФК часто образуются в условиях нормальной жизнедеятельности клетки и участвуют в окислении ксенобиотиков или полимеризации лигнина, но в других случаях активированный кислород генерируется путем неправильного функционирования ферментов или электронной транспортной системы в результате вызванного стрессом нарушения метаболизма [McKersie, 1996].
Основное состояние молекулы О2 триплетное ( g). Два его валентных электрона находятся на орбиталях рх и ру, имеют неспаренные спины, благодаря чему кислород парамагнитен [Химическая энциклопедия, 1990]. Реакции переноса двух электронов к триплетному кислороду от молекул с полностью заполненной валентной оболочкой имеют низкую вероятность, поскольку противоречат принципу Паули (спиновый запрет). При обращении спина одного из неспаренных электронов кислорода образуется его синглетное состояние, благодаря чему преодолевается спиновое ограничение, и кислород в такой форме более активен. В реальных биологических системах образование синглетного кислорода происходит главным образом в результате фотосенсибилизированных реакций переноса энергии от молекул в возбужденном состоянии [Козлов и др., 1983; Мерзляк, 1989; McKersie, 1996]. Источниками синглетного кислорода могут быть также процессы гомолитического распада органических пероксидов [Козлов и др., 1983; Мерзляк, 1989].
Другой механизм «активации» кислорода связан с его ступенчатым одноэлектронным восстановлением до диоксида (02 ), перекиси водорода (Н2О2), гидроксила (НО ) и, наконец, воды в соответствии со схемой [Козлов и др., 1983; Мерзляк, 1989; Барабой и др., 1992; McKersie, 1996]:
Диоксид (супероксид) обнаруживается в ядерной, плазматической, митохондриальной, микросомальной и хлоропластной мембранах (Барабой и др., 1992). Некоторые окислительно-восстановительные ферменты, осуществляющие одноэлектронный перенос, продуцируют 02 (ксантиноксидаза, альдегидоксидаза, пероксидаза, мембраносвязанные НАДФН-оксидазы) [Мерзляк, 1989; McKersie, 1996]. Реакции образования 02 обеспечиваются также деятельностью неферментативных систем (например, система «Fe +аскорбат» или другие восстановители - цистеин, глутатион) [Козлов и др., 1983]. Диоксид характеризуется относительно высоким временем жизни в водных растворах (несколько миллисекунд), с чем связывают его способность диффундировать на значительные расстояния от реакционной зоны [Мерзляк, 1989]. Более того, супероксид способен проникать через биомембраны по анионным каналам без специфических переносчиков [Мерзляк, 1989; Барабой и др., 1992] и склонен как к окислительным (например, с аскорбатом), так и к восстановительным (с хинонами, цитохромом с) реакциям [Мерзляк, 1989; Владимиров и др., 1991; Mead, 1984; McKersie, 1996]. Его химическая активность зависит от условий окружающей среды: полярности, рН, температуры и др. При протонировании супероксида образуется радикал НОг (гидродиоксид, гидроперекисный радикал), который обладает большим сродством к электрону и может непосредственно окислять НАДН [Gebicki, Bielski, 1981]. Супероксид и гидродиоксид в водных системах претерпевают дисмутацию до перекиси водорода и кислорода, которая может происходить спонтанно или катализироваться различными супероксиддисмутазами (СОД).
Перекись в растениях образуется также в процессе фотодыхания в пероксисомах, в реакциях с участием оксидаз урата, аминокислот. Многие флаво- и металлопротеины способны осуществлять двухэлектронное восстановление молекулярного кислорода [Мерзляк, 1989]. Молекула Н2О2 достаточно стабильна и, не имея электрического заряда, легко проникает через биологические мембраны. Перекись водорода утилизируется в организме каталазой, пероксидазой. Цитотоксический эффект Нг02 объясняют тем, что внутри клетки она может разлагаться с образованием гидроксильного радикала, обладающего очень высокой реакционной активностью [Halliwell, Gutteridge, 1989]. В литературе обсуждается участие металлов переменной валентности в образовании НО радикалов. В связи с этим часто рассматривается разложение Н2О2 ионами железа -реакция Фентона [Aust et al., 1985; Halliwell, Gutteridge, 1989]:
Генерация НО радикалов за счет взаимодействия 02 с Н202 (реакция Хабера-Вайса) происходит очень медленно, но становится реальным источником гидроксильных радикалов в присутствии металлов переменной валентности. Исследователи рассматривают ее как сумму реакций Фентона и реакции восстановления ионов Fe3+ диоксидом [Владимиров и др., 1991].
Влияние ингибиторов митохондриальных термогенных систем на выживаемость проростков озимой пшеницы, подвергнутых низкотемпературному стрессу
Из литературы известно, что негативное воздействие низких температур обуславливается, прежде всего, образованием внутри- и внеклеточного льда, что приводит к обезвоживанию цитоплазмы и нарушению мембранных структур. Кроме этого, при гипотермии, как и при других экстремальных условиях, в клетках развивается окислительный стресс, который, в частности, сопровождается новыми реакциями образования активных форм кислорода (АФК), токсичных для организма. После достижения определенной концентрации АФК инактивируют многие ферментные системы и инициируется перекисное окисление, основным субстратом которого являются липиды биологических мембран [Владимиров, Арчаков, 1972; Мерзляк, 1989; Барабой и др., 1992]. В то же время низкие температуры вызывают значительную перестройку клеточного метаболизма, направленную на преодоление действия этого стрессового фактора. К числу наиболее изученных к настоящему времени защитных механизмов относятся: накопление растворимых углеводов, гидрофильных белков, пролина, т.е. веществ способных связывать воду в своих гидратных оболочках, препятствуя образованию внутриклеточного льда и обезвоживанию; увеличение степени ненасыщенности жирных кислот в составе фосфолипидов мембран, что повышает проницаемость клеточных мембран для воды и предотвращает их повреждение; накопление антиоксидантов - веществ, способных ингибировать перекисное окисление липидов; синтез специфических (стрессовых) белков на фоне падения скорости общего синтеза белка. К стрессовым белкам относят антифризные белки, молекулярные шапероны, дегидрины и белки, разобщающие окисление и фосфорилирование [Gatenby, Viitanen, 1994; Thomashow, 1998; Fletcher et al., 1999; Ricquier, Bouillaund, 2000].
В митохондриях морозоустойчивых растений в самом начале низкотемпературного воздействия происходит разобщение процессов окисления и фосфорилирования [Войников, 1987], при этом вследствие рассеивания электрохимического градиента протонов А цн+ выделяется тепло. Генерацию тепла клетками принято называть «термогенезом». К природным эндогенным разобщителям относятся длинноцепочечные жирные кислоты, содержание которых в растительной клетке повышается при охлаждении [Войников и др., 1980]. Как разобщители окислительного фосфорилирования они действуют самостоятельно либо совместно со специфическими белками. Большинство известных к настоящему времени разобщающих белков (UCP, uncoupling protein) принадлежит к семейству митохондриальных анионных переносчиков, локализованных во внутренней мембране органелл [Jezek et al., 1998]. У злаков обнаружен также белок холодового шока с мол. массой 310 кДа (БХШ 310), который вызывает разобщение окисления и фосфорилирования в митохондриях при низкотемпературном стрессе, но в отличие от UCP-подобных белков его функционирование не требует наличия свободных жирных кислот [Войников и др., 2001а]. Помимо разобщающих белков в генерацию тепла растительными клетками вносит вклад цианидрезистентная альтернативная оксидаза [Vanlerberghe, Mcintosh, 1997]. Хотя вопрос о роли термогенеза в защите растений от повреждения низкими температурами в мировой литературе широко дискутируется [Breidenbach et al., 1997; Jarmuszkiewicz et al., 2001], общая точка зрения на это явление еще не сложилась.
Другим возможным следствием функционирования энергорассеивающих систем митохондрий является их воздействие на содержание в клетке активных форм кислорода, инициирующих перекисное окисление липидов [Skulachev, 1994; Casolo et al., 2000]. Поскольку ПОЛ является общей неспецифической реакцией растительной клетки на действие стрессовых факторов различной природы, можно допустить, что снижение уровня АФК в клетке будет приводить и к снижению вредного воздействия холодового шока. Таким образом, исходя из имеющихся в литературе данных, можно сформулировать три гипотезы, объясняющие физиологическое значение разобщенного и несопряженного дыхания при холодовом шоке: 1. Функционирование энергорассеивающих систем необходимо растению для генерации тепла в первые моменты низкотемпературного стресса. Термогенез какое-то время предохраняет клетку от образования внутриклеточного льда и создает тем самым условия для активации других защитных систем организма. 2. Термогенез является «индикатором» интенсификации уровня разобщенного и несопряженного дыхания и не играет значимой роли в защите растения от низкотемпературного стресса. Функционирование энергорассеивающих систем делает менее эффективным процесс образования АФК в клетке. 3. Термогенез и антиоксидантное действие разобщенного и несопряженного дыхания совместно защищают растения от действия низких температур. В связи с этим была определена следующая цель работы: изучение физиологической роли функционирования энергорассеивающих систем митохондрий в защите проростков растений при низкотемпературном стрессе. В связи с поставленной целью необходимо было решить ряд задач: 1. Сопоставить кривые охлаждения живых и «убитых» проростков растений при заданной внешней температуре. 2. Установить влияние степени охлаждения на генерацию тепла проростками. 3. Изучить влияние разобщения процесса окисления и фосфорилирования на уровень тепловыделения и выживаемость проростков растений при действии низких температур. 4. Изучить влияние ингибиторов митохондриальных энергорассеивающих систем на уровень термогенеза и выживаемость проростков растений, подвергнутых холодовому шоку. 5. Определить влияние закаливания проростков на интенсивность их дыхания, уровень термогенеза и выживаемость после низкотемпературного стресса. 6. Исследовать влияние ингибиторов и активаторов митохондриальных энергорассеивающих систем на интенсивность перекисного окисления липидов у проростков растений при низкотемпературном стрессе.
