Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. О двух фундаментальных биологических асимметриях — ионной и хиральной 11
1.1. Физико-химические предпосылки возникновения предшественников живой клетки 12
1.2. О сопряжении ионной и хиральной асимметрий в ион-транспортных- системах мембран 33
1.3. Физиологические и молекулярные механизмы старения 35
Глава 2. Исследование взаимодействия ионов и хиральных соединений в модельных системах 40
2.1. Исследование изотерм сжатия монослоев хиральных фосфолипидов 40
2.1.1. Принципы метода, материалы и постановка эксперимента 45
2.1.2. Результаты экспериментов и обсуждение 47
2.2. Фракционирование энантиомеров лейцина в неравновесном тонком поверхностном слое раствора при образовании пен 55
2.3. Скорость рацемизации аминокислот и ее зависимость от ионного состава среды 62
Глава 3. О функциональной взаимосвязи ионной и хиральной асимметрий
3.1. Изменения ионного и хирального гомеостаза при старении и в некоторых патологических состояниях 66
3.2. Рацемизация аминокислотных остатков (аспартат) в белках 70
3.2.1. Анализ первичной структуры белков с выраженной возрастной рацемизацией 70
3.2.2. Перспективы прогнозирования поиска белков с рацемизующимися аминокислотами 78
3.3. L/D-изомеризация ионных каналов мембран. Модельные расчеты избирательности 81
3.3.1. Теоретическое исследование изменений ионной избирательности калиевого канала при частичной замене L-аминокислотных остатков на D-аналоги 81
3.3.2. Изменение структуры аквапорина при замене всех L-аспарагиновых аминокислотных остатков на соответствующие D-энантиомеры 85
Глава 4. Ионы переменной валентности, хиральные соединения и проблемы экологической безопасности 88
4.1. Ионы металлов с переменной валентностью как хиральные переключатели и как фактор рацемизации 88
4.2 Хиральная безопасность биосферы как биофизическая проблема 96
Заключение 98
Основные результаты и выводы 101
Список литературы 104
Приложения
- О сопряжении ионной и хиральной асимметрий в ион-транспортных- системах мембран
- Принципы метода, материалы и постановка эксперимента
- Рацемизация аминокислотных остатков (аспартат) в белках
- Хиральная безопасность биосферы как биофизическая проблема
Введение к работе
Два направления; биофизики, касающиеся проблемы происхождения жизни на Земле и вопросов долгожительства.организмов,.тесным: образом переплелись, на молекулярном- уровне при; изучении ионной регуляции в, клетках и физико-химических особенностей структуры и функций хиральных соединений [1-3].
Для всех живых клеток характерны неравномерные и неравновесные распределения^ неорганических веществ и энантиомеров; хиральных соединений между внутри- и внеклеточной? средами. Такие асимметричные распределения ионов и энантиомеров хиральных веществ принято называть ионной и хиральнои асимметрией клеток. Эти две асимметрии универсальны для всех клеток, поэтому ' могут быть названы фундаментальными биологическими асимметриями.
Ионная? и хиральная. асимметрии- характеризуются термодинамическим
НераВНОВеСИеМ И, ПО-ВИДИМОМу, общНОСТЬЮ СИСТеМНОГО ПрОИСХОЖДеНИЯг Вї,.-І
процессе: предбиологической эволюции. Ионная асимметрия.: является* первичной термодинамической основой'существования дискретных, клеточных; форм жизни, способных к эволюции и коммуникациям. Хиральная, молекулярная; асимметрия определяет хиральную чистоту биосферы, минимизируя информационные генетические затраты на обеспечение стереоспецифичности биомолекул.
В = цикле работ, выполненных на кафедре биофизики физического факультета МГУ, экспериментально обоснована гипотеза возникновения исходно: . неравновесных натрий/калиевой,- магний/кальциевой^ а также хиральнои для;.';';! аминокислот и углеводов асимметрий в термодинамически неравновесном тонком, поверхностном: слое (ТПС) морской воды [4-8]. Авторами установлено; что обаг типа асимметрий могут формироватьсяїв;ТПС независимо. Вместе с тем, имеется? ряд свидетельств в пользу того, что ионная и хиральная специфичность в клетках функционально связаны. Так, например, в цитируемых работах теоретически показано, что ионная специфичность мембранных каналов однозначно связана с гомохиральностью аминокислотных остатков их полипептидных цепей.
Настоящая работа продолжает данное направление и ориентирована на экспериментальное обоснование гипотезы взаимозависимого фракционирования ионов и энантиомеров хиральных соединений в неравновесных гетерогенных структурах. Другим важным направлением работы является развитие молекулярных аспектов геронтологии, связанных с возрастной рацемизацией аминокислот в белках, зависящей, в свою очередь, от специфического взаимодействия с ионами металлов.
Известно, что ж Жизнь на Земле основана на соединениях углерода, и основные процессы ее протекают в водной среде. Вода - универсальный растворитель, обеспечивающий специфическое протекание многих химических и биохимических реакций. Углерод лучше других элементов подходит для формирования органических молекул, поскольку легко образует связи со многими другими атомами. К настоящему времени экспериментально показано, что практически все простейшие биологически важные органические соединения могли образоваться в естественных условиях на древней Земле в ходе природных физико-химических процессов. Биомакромолекулы - белки и нуклеиновые кислоты, а также углеводы и липиды - составляют основу современной жизни. Все они обладают свойством хиральности. К хиральным веществам относятся соединения, включающие асимметричный атом углерода с четырьмя различными заместителями, имеющими с ним ковалентные связи. Они образуют зеркальные изомеры - энантиомеры, обладающие оптической активностью - способностью вращать плоскость поляризации света (L - влево, D - вправо). В нуклеиновые кислоты включены исключительно D-изомеры остатков Сахаров (дезоксирибозы и рибозы), а пептидные цепи белков построены из L-изомеров аминокислот [8]. Кроме того; биологические мембраны включают в себя только L-фосфолипиды. Данное свойство биомакромолекул определяет зеркальную- асимметрию живой природы. Следует отметить, что, в отличие от Сахаров, аминокислот и фосфолипидов, другие хиральные компоненты клетки могут встречаться как в одной, так и в другой изомерной форме.
Биосфера, со свойственной- ей хиральной асимметрией, закрепившейся на генетическом уровне в ходе биологической эволюции, в> настоящее время сталкивается с мощным потоком хиральных соединений техногенного происхождения. Эффективное использование одних энантиомеров сопровождается токсическим и даже мутагенным действием их зеркальных антиподов [4, 31].
Зеркальные изомеры хиральных соединений — энантиомеры - аминокислот, Сахаров; фосфолипидов несимметричны по их содержанию в биосфере. Вместе с тем, для всех живых клеток характерно неравномерное и неравновесное распределение веществ и ионов между клеткой и окружающей средой. Среди этих распределений особое место занимают несимметричные распределения неорганических катионов - натрия и калия-, магния- и кальция. Ввиду общности характера этих диссимметрий (молекулярной - хиральной, клеточной - ионной), их следует считать двумя фундаментальными асимметриями в живых системах. Их всеобщность порождает вопрос об их возникновении: возникли ли они в ходе биологической эволюции, или их возникновение было предопределено физико-химическими факторами предбиологической.эволюции.
Одной из физических проблем возникновения живых систем является проблема возникновения информации: был ли выбор решений на важнейших стадиях предбиологической эволюции случайным или предопределенным. В первом случае информация создавалась в процессе эволюции, во втором -реализовалась информация, скрытая в неживой системе [9, 10]. Выявление факторов селективного преимущества и механизмов их действия в предбиологических системах на разных стадиях эволюции позволяет ответить на-этот вопрос [11].
Предлагавшиеся' ранее механизмы- возникновения асимметричных распределений ионов и энантиомеров аминокислот и Сахаров были основаны на свойствах равновесных гетерогенных термодинамических систем, в то время как живые клетки - существенно неравновесные системы. При «движении» от геохимических систем к биохимическим необходимо выяснить, какие именно
системы обладали свойствами, достаточными для возникновения предшественников клеток. При движении «сверху» — какие свойства систем были необходимы для реализации того или иного пути эволюции пробионтов. Таким образом, могут быть получены необходимые и достаточные условия. возникновения дискретных предшественников живых клеток и эволюционно затребованного завершения их жизненного цикла.
Проблемы молекулярной асимметрии важны не только в вопросах биогенеза, но непосредственно связаны с жизнью нынешней биосферы. Некоторые вещества, не свойственные природным экосистемам, могут накапливаться в их различных частях и влиять на их устойчивость. Так, например, для антропогенных загрязнений экосистем антиподами естественных стереоизомеров хиральных веществ механизмы биологической деградации обычно отсутствуют, что может приводить к их накоплению w переносу на значительные расстояния. Это - новая проблема, без эффективного решения-которой возможны экологические кризисы с непредсказуемыми последствиями.
Значительным достижением молекулярной биологии и геронтологии последних лет стало обнаружение следующей закономерности: по мере старения организмов и при определенных патологических состояниях происходит частичная рацемизация некоторых аминокислотных остатков в белках. Эволюционно обусловленная хиральная чистота биосферы составляет термодинамическую основу возрастной рацемизации хиральных соединений или развитие рацемизации при наличии патологий, сопровождающихся нарушением репарационных биохимических механизмов. В настоящий момент имеются-основания полагать, что возрастная рацемизация аминокислотных остатков в белках может быть непосредственно связана через окислительно-восстановительные процессы с участием металлов переменной валентности с процессами клеточного старения, вызываемыми активными формами кислорода и азота. Такого рода подходы к проблеме намечаются в настоящей работе.
Актуальность работы впервые в едином рассмотрении выполнено теоретическое и экспериментальное исследование физико-химических факторов,
обусловивших сопряженное возникновение фундаментальных асимметрий в живых системах - хиральной (аминокислоты, углеводы, липиды) и ионной.
Область исследования: биофизические основы возникновения ионной и хиральной асимметрий в предбиологической эволюции, молекулярная геронтология как элемент экологии человека, экологическая безопасность.
Предмет исследования: неравновесные процессы сопряженного фракционирования ионов и хиральных соединений в природных, биологических и модельных системах, механизмы рацемизации биомолекул.
Методы исследования: экспериментальные физико-химические и биофизические методы, развитие теоретических моделей.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление и изучение физико-химических факторов, обусловивших сопряженное возникновение ионной и хиральной асимметрий в ходе предбиологической эволюции, а также их функциональное взаимодействие в живых системах.
В ходе работы были поставлены следующие задачи:
Изучение эффектов сопряженного фракционирования ионов и энантиомеров хиральных соединений на неравновесных границах раствор-воздух
Исследование физико-химических эффектов взаимодействия ионов и энантиамеров фосфолипидов в ленгмюровских плёнках
Исследование зависимости флотации хиральных соединений от ионного состава среды
Исследование эффектов рацемизации на функциональные характеристики ионных каналов и NMDA рецепторов
Исследование возрастной рацемизации аминокислотных остатков в белках.
Достоверность полученных результатов исследований и обоснованность, положений; выводов и рекомендаций подтверждается адекватностью использованных экспериментальных подходов и методик, соответствием следствий теоретических описаний наблюдаемым в экспериментах и естественных условиях явлениям и процессам.
Научная новизна полученных результатов состоит в следующем:
Впервые в едином рассмотрении выполнено экспериментальное исследование физико-химических факторов, обусловивших сопряженное возникновение двух фундаментальных асимметрий в живых системах — хиральной (аминокислоты, углеводы, липиды) и ионной — в ходе предбиологической эволюции.
В экспериментах, включавших исследование-ленгмюровских пленок, пен,
ТПС методом генерации, второй' оптической гармоники, генерируемой при
отражении лазерного излучения от границ разделов фаз, совместно с коллективом
исследователей впервые установлена непосредственная зависимость
фракционирования энантиомеров, а также физико-химических характеристик
ТПС от содержания определенных ионов металлов. Общность механизмов и
сопряжение процессов перераспределения ионов и энантиомеров хиральных
веществ в тонком поверхностном слое раствора предопределили ионный, состав и
хиральную поляризацию внутренней среды предшественников. . клеток,
образовавшихся на границе раздела океан-атмосфера. v
В численных экспериментах продемонстрировано существенное изменение структуры и ионной специфичности мембранных каналов ,^при замене L-аминокислотных остатков на D-энантиомеры.
С помощью анализа аминокислотных последовательностей в белках, подверженных возрастной- рацемизации, выявлены определенные закономерности, существенные для выяснения механизмов спонтанной рацемизации. Предложена гипотеза относительно связи элементов свободнорадикальной гипотезы старения и процессов возрастной рацемизации-аминокислотных остатков в белках.
Получили дальнейшее-развитие представления о-хиральной безопасности биосферы. Биосфера сталкивается с мощным потоком хиральных соединений, формируемым химической, перерабатывающей, фармацевтической, аграрной, пищевой промышленностью. ТПС морской воды с участием ионов металлов может специфическим образом концентрировать, фракционировать, трансформировать хиральные токсические поллютанты.
Практическая значимость работы. Результаты работы могут найти практическое применение в следующих областях:
прифазработке новых методов диагностики поверхности океана;
при разработкеметодов разделения смесей веществ;:
при? разработке новых методов очистки; окружающей средьк от антропогенных загрязнений;
прш разработке; норм' экологической- безопасности- с учетом перераспределения антропогенных хиральных загрязнений биосферы;
при изучении^ механизмов- воздействия; различных физико-химических факторов на биологические системы, а также в молекулярной геронтологии;
как материалы, в курсах лекций по биофизике; биохимии, молекулярной? биологии, фармакологии, экологии для студентов соответствующих специальностей;
Основные положения; выносимые на защиту::;
В биологических системах ионнаяіи хиральная асимметрии: функционально
связаны.. Сходная взаимосвязь проявляется>в-неравновесных нелинейных .физико-
химических системах. ,-.
Возрастные изменения и некоторые патологические состояния* организма коррелируют с изменениями ионногои хирального гомеостаза;
Апробация; работы. Результаты работы; были доложены-; на; Научной конференции «Ломоносов- 2008», МРУ имени М.В.Ломоносова; физический; факультет, секция биофизики и медицинской;физики (Москва; 2006).
Структура и- объем работы. Диссертация состоит из; введения; 4-х глав; заключения,, выводов; списка цитируемой; литературы. Диссертация изложена;на: 111 страницах, содержит.35 рисунковіи*9таблиці.
Публикации; По теме диссертации; опубликовано 5 печатных работ, из них в рецензируемых журналах по списку ВАК — 2, статьи в других журналах, изданиях и тематических сборниках- 1, в материалах конференций--2. Список работ по теме диссертации:
Твердислов В.А., Яковенко Л.В., Жаворонков А.А. Хиральность как проблема биохимической физики./УРос. хим. журнал (Журнал Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менеделеева), т. LI, №1, 2007. - С. 13-23.
Твердислов В.А., Жаворонков А.А., Яковенко Л.В. Хиральная чистота биосферы и экологическая безопасность.Юкология урбанизированных территорий, №1, 2007. - С. 6-11.
Твердислов В.А., Яковенко Л.В., Дмитриев А.В., Жаворонков А.А., Твердислова И.Л. Происхождение предшественников живой клетки. О двух фундаментальных асимметриях - ионной и хиральной.//В сб.: Проблемы регуляции в биологических системах. Биофизические аспекты./Под ред. А.Б. Рубина. - М.-Ижевск: НИЦ «Регулярная и хаотическая динамика», Институт компьютерных исследований, 2007. - 480 с.
Поволоцкая И.С., Жаворонков А.А., Твердислов В.А. Локальная структура полипептидных цепей и рацемизация аспартата в белках.//В сб. материалов конференции «Ломоносов-2008», секция «Физика», Физический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова - М., 2008. - С. 36-37.
Малык А.П., Жаворонков А.А., Юрова ТВ. Влияние одновалентных катионов на физико-химические свойства хиральных систем пониженной размерности.//В сб. материалов конференции «Ломоносов-2008», секция «Физика», Физический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова - М., 2008. - С. 37-38.
О сопряжении ионной и хиральной асимметрий в ион-транспортных- системах мембран
В предыдущем разделе мы отметили наличие связи между ионной и хиральной- асимметриями в природных абиогенных, гетерогенных, неравновесных системах, включающих амфифильные молекулы. Вместе с тем; и для липидных искусственных мембран известны примеры избирательного распределения одно- и двухвалентных ионов между гидрофильной и гидрофобной фазами, зависящего от типа фосфолипидов. Более того, от типа образующих бислойные липидные мембраны фосфолипидов существенно зависит и их проницаемость для разных катионов [46]. Явление флотации с использованием ионных ПАВ широко используется для разделения ионов в промышленности [45, 58, 59].
В клетках хиральная асимметрия непосредственным образом связана с ионной асимметрией. Данная связь опосредована через белковые (полипептидные) ион-транспортирующие системы, ионные насосы и каналы мембран.
Все изолированные неравновесные системы стремятся к равновесию и увеличению энтропии. В живых организмах как открытых неравновесных системах конкурируют процессы, свойственные изолированным системам, т.е. приводящие к рацемизации, и процессы, обусловленные открытостью системы, что приводит к возникновению «устойчивого неравновесия». В процессе старения наблюдается увеличение содержания D-аминокислот в различных тканях организма человека и животных. Относительно других соединений надежных данных нет.
Выяснение механизмов» возрастной рацемизации аминокислот стало в последние годы одним из важных направлений молекулярной геронтологии [47, 62, 79]. Установлено, что в тканях с медленным обменом белков с возрастом и при ряде заболеваний заметно (в разы) увеличивается содержание D-аминокислотных остатков (в первую-очередь аспартата, и, в определенной степени, серина). Это касается костной ткани (зубов млекопитающих), роговицы глаз и хрусталика, особенно при развитии катаракты. Наряду с этим, спонтанная» рацемизация аминокислот отмечена в амилоидных белках (в частности, при болезнях Альцгеймера и Паркинсона), в миелине, в клетках легких, в эритроцитах, в эластинах соединительной- ткани и эпителиальных клеток, а также в клетках артерийшри развитии атеросклероза.
Известны патологии, связанные с нарушениями работы ионных каналов. Избирательность каналов заведомо связана с их аминокислотной-гомохиральностью. Можно ожидать, что замена L-аминокислот на- одноименные D-аминокислоты канала приведет к изменению- его пространственной конфигурации и, как следствие, к потере его ионной селективности. Тем более что аспарагин и аспартат в каналах присутствуют.
В работах [48-52] развивается универсальный подход к объяснению ионной избирательности, основанный на сравнительном анализе профилей потенциальной энергии для Li+, Na+, К+ в различных ионных каналах, в частности в поре канала L-KcsA. В рамках такого подхода объяснить калиевую избирательность канала-можно наличием более глубокой потенциальной ямы, в области селективного фильтра для ионов К+, чем для ионов. Li+, Na+, или же совпадением значения энергии дегидратации и глубины потенциальной ямы иона К+. Нами выполнено теоретическое изучение структурных изменений в ионных каналах при L/D-замене, а также сравнение ионной избирательности природной L-формы потенциал-независимого калиевого канала KcsA (L-KcsA) и его гипотетического LD-двойника, в котором половина L-аминокислот была заменена на D-энантиомеры (LD-KcsA). С помощью модельных расчетов показано, что в неприродных LD-изомерах мембранных каналов1 существенным образом нарушается присущее природным каналам свойство ионной избирательности.
В живых клетках в составе полипептидных цепей белков- наиболее подвержены рацемизации остатки аспарагиновой кислоты и аспарагина [47, 60, 61]. В связи с этим важно определить, каковы возможные последствия такой рацемизации, как она влияет на функции белков в зависимости от возраста клетки. Это одна из новых проблем молекулярной геронтологии.
Нами были проведены соответствующие модельные эксперименты на примере потенциал-независимого калиевого канала KcsA. Их результаты и обсуждение приведены в.разделе 3.3.
Существенное увеличение в структуре населения экономически развитых и развивающихся стран доли пожилых, особенно в последней четверти- XX века, вызвало закономерный интерес к геронтологии и, прежде всего, к изучению первичных механизмов старения организмов и популяций и, факторов, определяющих продолжительность жизни.
В рамках развиваемого нами подхода необходимо отметить, что существующие гипотезы старения организмов, которые мы кратко рассмотрим, принципиальным образом игнорируют факты возрастной рацемизации аминокислотных остатков в белках. В последние десятилетия обнаружены отступления от декларировавшейся ранее хиральной чистоты биосферы. Так, D-аминокислоты играют заметную роль в жизнедеятельности, как прокариот, так и эукариот. Появились данные, о том, что в процессе старения; а также при развитии некоторых патологий, процентное содержание D-аминокислот в белках различных тканей организма человека и животных увеличивается. Накопление D аминокислот в белках, характеризующихся большими временами жизни, стало основой-определения возраста в судебной практике и археологии. К приоритетным направлениям фундаментальных исследований причин старения в настоящее время относят следующие направления [62]. 1. Роль генетических факторов старения (популяционная генетика старения). Известно, что различия видовой продолжительности жизни, животных колеблются от 10 до 50 раз внутри групп с одинаковым уровнем организации до 1000 раз для всех земных видов. Так, лабораторные грызуны-живут не более 2-3 лет, а многие дикие грызуны такого же размера - до 5-Ю лет и более. 2. Идентификация генетических различий, причинно связанных с видовыми различиями продолжительности жизни. В настоящее время не известны гены, ответственные за значительные различия в продолжительности жизни между животными разных видов, даже весьма близких. 3. Создание, экспериментальных моделей с существенно замедленным старением и идентификация генов, ответственных за долголетие.1 Ряд .таких моделей создан, однако недостаточно охарактеризован и систематизирован. 4. Идентификация взаимосвязи между полиморфизмом ДНК и долголетием и (или) возрастной патологией. Продолжительность жизни существенно различается даже у представителей одного вида и может быть обусловлена как различиями генома, так и случайными событиями в течение развития и старения организма. 5. Исследование продолжительности жизни (ПЖ) близнецов. Продолжительность их жизни ограничивается специфическими генами, которые, например, определяют предрасположенность к ожирению или атеросклерозу, а наследуемость ПЖ у человека не превышает 50%. Так потомки столетних имеют по крайней мере в 4 раза больше шансов прожить более 85 лет, чем дети тех,, кто умер до 73 лет. Результаты исследования большой группы шведских близнецов, воспитывавшихся в разных семьях, показали, что максимум одна треть вариабельности в ПЖ может быть обусловлена генетическими факторами, тогда как почти все остальные различия связаны с факторами окружающей среды. 6. Роль окислительного стресса: в процессе старения; Многие формы= возрастной патологии обусловлены окислительными повреждениями. Однако остается неясным, какая их часть и в каких клетках и. тканях реально вызвана, именно окислительными повреждениями, какие конкретно- белки, будучи окисленными, изменяют функцию клеток и тканей.
Принципы метода, материалы и постановка эксперимента
В работе были использованы 1,2-дипальмитоил-зп-глицеро-3-фосфохолин и 1,2-дипальмитоил-гас-глицеро-З-фосфохолин (молекулярная формула C HgoNOsP, молекулярный вес 734.1) производства "Sigma", чистота 99%; 1,2-дипальмитоил sn-глицеро-З-фосфоэтаноламин и 1,2-дипальмитоил-гас-глицеро-З фосфоэтаноламин (молекулярная формула C37H74NO8P, молекулярный вес 692.0) производства "Sigma", чистота 99%; КС1 и NaCl производства «Ди аэм» категории ОСЧ; особо чистая вода, деионизированная системой4 очистки воды фирмы "Millipore" (электропроводность воды 20 мОм, рН 6,3, поверхностное натяжение 72,88 мН/м при 21С);. хлороформ стабилизированный (СНС13) производства «Химмед» категории ХЧі
В экспериментах использовались растворы L-фосфатидилхолина и гас-фосфатидилхолина в хлороформе концентрацией 1 мМ, приготовленные при комнатной температуре. Для приготовления растворов L-фосфатидилэтаноламина и rac-фосфатидилэтаноламина в хлороформе концентрацией 1 мМ необходимо поддерживать температуру не ниже 40Є, для чего растворы помещались на водяную баню соответствующей температуры до полного растворения липидов. В экспериментах использовались растворы солей NaCl и КС1 в воде концентрацией 0,01 М, 0,1 Ми 1,0М.
Для получения монослоев была использована установка, состоящая из тефлоновой ванны Ленгмюра с размером 200x140x5 мм, датчика поверхностного давления - весов Вильгельми, неподвижного и сжимающего барьера (рис. 2.3). Управление установкой осуществляется через персональный компьютер с помощью специальной программы. Для измерения поверхностного давления используются весы Вильгельми.
Общая блок-схема Ленгмюровской установки: 1 - ленгмюровская ванна; 2 -прозрачный герметичный бокс; 3 - массивная металлическая плита-основание; 4 -амортизаторы; 5 - подвижный барьер; 6 - весы Вильгельми; 7 - пластинка весов Вильгельми; 8 - подложка; 9 - электропривод барьера (5); 10 - электропривод подложки (8); 11 -перистальтический насос; 12 - АЦП/ЦАП интерфейс.
Действие весов Вильгельми основано на принципе измерения усилия необходимого для компенсации воздействия на пластинку Вильгельми силы поверхностного давления в монослое на границе раздела "субфаза - газ". Для получения монослоя на чистую поверхность водной фазы наносили раствор исследуемого вещества в хлороформе. Объем наносимого на поверхность раствора составлял 70 мкл. Через 10 мин, необходимых для испарения растворителя монослой поджимался с помощью подвижного барьер со скоростью 7,2 А2/мин-молекула. В ходе сжатия монослоя происходила запись я-А изотермы. Для каждой комбинации величины концентрации соли, её вида и типа фосфолипида было проведено по 2 серии экспериментов. Изотермы записывались в одинаковых условиях, а затем вычислялись среднестатистические значения основных параметров полученных кривых. Эксперименты проводили при температуре 21 С. 2.1.2. Результаты экспериментов и обсуждение
На рис. 2.4 представлены изотермы сжатия монослоев L- и гас-фосфатидилхолина на поверхности чистой воды. Изотерма сжатия L-энантиомера демонстрирует плавный рост давления от нуля между 40 и 35 А2/мол, указывая область сосуществования газообразной и жидкой фаз. Наблюдаемая величина площади на молекулу А0, при которой начинается резкий рост давления, составляет 34.6 ± 0.5 А2/мол, что свидетельствует о переходе в жидкоконденсированное состоянии, характеризующееся низкой сжимаемостью. В области 26 А2/мол наблюдается фазовый переход в жидкокристаллическое состояние, которому соответствует давление 40 мН/м. Максимальное значение давления монослоя до начала коллапса Ртах - 72.4 ± 0.2 мН/м.
Изотерма сжатия монослоя рацемической смеси не отличается по форме от изотермы сжатия монослоя чистого L-энантиомера, но характеризуется существенно большими значениями А0 и Ртах. Это соответствует уменьшению плотности упаковки молекул в монослое - изменение площади, приходящееся на одну молекулу, составляет более 10 А2/мол, а также увеличению давления монослоя до наступления коллапса на 10 мН/м. Значения А0 и Ртах с учетом погрешности представлены в таблице 2.3 (см. Приложения).
На рис. 2.5А представлены изотермы сжатия монослоев L- и rac-фосфатидилхолина на поверхности 0,01 М раствора NaCl. По форме они аналогичны изотермам сжатия монослоёв на чистой воде. В области между 45 и 80 А2/мол монослой L-энантиомера находится в газообразном состоянии, между 45 и 38 А2/мол - в области сосуществования газообразное и жидкой фаз. Наблюдаемая величина площади на молекулу А0, при которой начинается резкий рост давления 38,8±0,8 А2/мол. При площади меньше, чем 38 А2/мол, монослой переходит в жидкоконденсированное состояние, характеризующееся низкой сжимаемостью, а при 30 А2/мол - в жидкокристаллическое, с давлением в области фазового перехода 35 мН/м. Максимальное значение давления монослоя до начала коллапса Ртах — 69,0±0,7 мН/м.
Изотерма сжатия рацемической смеси подобна изотерме сжатия L-энантиомера, но отличается значением А0 и Ртах - они больше на 8 А2/мол и на 8 мН/м, что говорит об уменьшении плотности упаковки молекул и увеличении пластичности монослоя. На рис. 2.5Б представлены изотермы сжатия монослоев L- и гас-фосфатидилхолина на 0,01 М растворе КС1. Изотерма сжатия L-энантиомера демонстрирует плавный рост давления между 50 и 43 А2/мол, сохраняя форму, характерную для изотермы фосфолипида на поверхности чистой водной фазы. Наблюдаемая величина площади на молекулу, с которой начинается рост давления при переходе монослоя в жидкую фазу составляет 42,7 ± 0,3 А2/мол. В области между 50 и 80 А2/мол монослой находится в гомогенном газообразном состоянии. При площади меньше,чем 42 А2/мол, монослой находится в гомогенном жидком состоянии, характеризующемся низкой сжимаемостью.
Изотермы сжатия монослоев L- и rac-фосфатидилхолина на ОД М растворе КСЬ (рис. 2.6Б) практически не отличаются по форме и, так же, как и в случае использования в качестве водной фазы 0,1 М раствора NaCl, не выявляют различий в плотности упаковки молекул использованных липидов. По-прежнему сохраняются различия в значениях Ртах. Наблюдаемые величины площади А0 представлены в таблице. Большая погрешность в определении площади, как и в экспериментах с 0,1 М раствором NaCl, обусловлена широким разбросом значений Ао среди данной серии изотерм, полученных при одних и тех же условиях.
Рацемизация аминокислотных остатков (аспартат) в белках
Наиболее подверженными рацемизации аминокислотами в белках являются аспарагин и аспартат (Asx). Так, в дентине аспартат рацемизуется со скоростью до 0,1 % в год [60, 79-81]. Скорость рацемизации Asx в искусственно синтезированных пептидах зависит от того, какие аминокислоты находятся в соседних с ним позициях первичной структуры [94, 95]. Кроме того, недавно появились данные о том, что скорость рацемизации Asx в искусственно синтезированных пептидах зависит от положения во вторичной структуре. Так, для аспартата расположенного в а-спирали скорость этого процесса на порядок выше, чем для входящего в р-слой [95]. На сегодняшний день остаются открытыми вопросы о химико-физических особенностях аспартата и аспарагина, ведущих к относительно высокой скорости рацемизации этих аминокислот; а также о степени влияния первичной, вторичной и третичной структур природных белков на скорость рацемизации аспартата и аспарагина.
Для того чтобы попытаться ответить на эти вопросы, в настоящей работе мы провели качественный и статистический анализы первичной, вторичной и третичной структур некоторых белков вюбласти расположения Asx.
Долгое время- декларировалось, что все природные биологические соединения, содержащие хиральный центр, встречаются только в одной стерической форме. Однако последние исследования показывают, что из этого г правила есть исключения, и, в частности, D-аминокислоты играют существенную роль в жизнедеятельности всех организмов - от бактерий до млекопитающих. Так, D-глютаминовая кислота и D-аланин входят в состав пептидогликана муреина, создающего жестких каркас бактериальных клеток; D-серин обнаружен в составе ломбрицина земляного червя Lumbricus terrestris. D-изомер цистеина входит в состав люцефирина, который при воздействии люцеферазы вызывает биолюминесценцию светлячков Photinus. D-аминокислоты обнаруживаются в составе некоторых пептидных антибиотиков. В, организмах млекопитающих и человека, свободные D-аминокислоты обнаруживаются в плазме крови и других жидкостях. В нервных клетках высших организмов находят D-аланин, D-аспартат и D-серин, иногда в значительных концентрациях. D-серищ в частности, является-агонистом NMDA-рецепторов. в центральной нервной системе [96]. Присутствие D-аминокислот в составе пептидов обусловлено посттрансляционной изомеризацией, обеспечивающейся специальными ферментами - рацемазами [60, 97]. В составе пептидов, синтезируемых рибосомами, D-аминокислоты пока обнаружены не были.
В настоящее время не вызывает сомнений, что рацемизация аминокислот это неизбежный процесс, сопровождающий старение организма, спонтанно происходящий во многих тканях различных организмов, и, в частности, в организме человека (табл. 3.1). Процентное содержание D-аминокислот может служить для определения возраста белков. Кроме того, хотя рацемизация и наиболее заметна в долгоживущих структурных белках, некоторые опосредованные ею эффекты, такие, как изменение пространственной структуры, могут иметь существенное значение для ферментов и других короткоживущих белков [96].
Существует сходная точка зрения, согласно которой рацемизация хиральных соединений в клетках в процессе старения носит не случайный характер, а формирует положительную обратную связь в системе регуляции процессов метаболизма, приводящую к развитию патологических состояний и ускорению старения: деградация белка — увеличение конформационной свободы — увеличение скорости рацемизации —» конформационные и пространственные изменения — ускорение деградации [79, 105].
Аспарагин и аспартат являются структурно нестабильными и наиболее-подверженными рацемизации аминокислотами. Основными причиной появления в белках D-аспартата в процессе старения являются как потеря L-аспарагином аминной группы, так и рацемизация L-аспартата, приводящая к образованию L-изоаспартата, D-аспартата и D-изоаспартата.
Долгое время механизм рацемизации аспартата не был ясен. Недавние исследования [95], показали, что в белках хрусталика, а-В-кристаллине и ос-А-кристаллине, формирование Ь-(3-аспартата, D-a-аспартата и D-P-аспартата происходит одновременное Это указывает на-то, что формирование D-аспартата в белках происходит через сукцинимид-посредника. Этот процесс реализуется в 4 стадии: 1) карбонильная группа остатка L-a-аспартата атакуется азотным.остатком аминокислоты, следующей за аспартатом, и, посредством интрамолекулярной, циклизации, формируется Ь-сукцинимид; 2) L-сукцинимид может быть изменён в D-сукцинимид через 1-посредника, имеющего прохиральный ос-углерод в плоскости кольца; 3) протонация 1-посредника происходит с равной вероятностью в верхней или нижней части пептида; 4) D- и L-энантиомеры сукцинимида гидролизуются с любой стороны их карбонильных групп. Формирование сукцинимид-посредника может происходить также при потере аспарагином аминогруппы. Скорость рацемизации аспартата in vivo зависит от физико-химических характеристик окружающей среды. Так как концентрации солей, рН, температура флуктуируют весьма незначительно, скорость рацемизации аспартата зависит, от соседних аминокислотных остатков, от положения аспартата во вторичной структуре, от пространственного окружения, опосредованного третичной структурой. Во многих случаях образование сукцинимида происходит в терминальных концах белков, в открытых регионах на поверхности белков, а также на изгибах белковых цепей [94-96].
Механизм контроля рацемизации аспартата в организме осуществляется ферментом Ь-изоаспартат(0-аспартат)-0-метилтрансферазой (рис. 3.1). Это широко распространенный фермент, что свидетельствует и о повсеместно происходящей рацемизации. Фермент селективно метилирует L-изоаспартат и D аспартат, после чего происходит формирование сукцинимида, который после, повторного метилирования, переключается в L-аспартат. Однако, субстратная специфичность D-аспартата к ферменту достаточно низкая. Механизмов, контролирующих деаминирование в организме пока не выявлено [96, 97]. Скорость рацемизации аспартата в белках и его процентное содержание может служить для определения времени жизни белков in vivo. Так, D-аспартата в короткоживущих белках практически не наблюдается, то есть скорость рацемизации значительно меньше, чем скорость обновления белка. В белках с большим временем жизни уровень D-аспартата постоянный, что является следствием равновесия между скоростью рацемизации и скоростью обновления белка. В структурных белках, обновления которых не происходит совсем, уровень содержания D-аспартата линейно увеличивается с возрастом [60, 96] (рис. 3.2, см. Приложения). В связи с тем, что рацемизация наблюдается в некоторых белках, характеризующихся большими временами жизни и влечет за собой патологические изменения в организмах при различных заболеваниях, представляется важным вопрос о том, в какой степени рацемизации подвержены другие белки (глобулярные, мембранные), а также в чем заключается отличие белков, подверженных рацемизации от белков, в которых рацемизация не наблюдается.
Хиральная безопасность биосферы как биофизическая проблема
Биосфера со свойственной ей хиральной асимметрией, закрепившейся в ходе биологической эволюцию наг уровне L-аминокислот и D-сахаров, фосфолипидов, а также некоторых биологически активных веществ биогенного происхождения, сталкивается с мощным потоком хиральных соединений, формируемым нефтяной, оптической, химической, перерабатывающей, фармацевтической, агрохимической, пищевой промышленностью и т.д.
Из десятков тысяч синтезируемых в мире органических соединений менее 30% соединений, используемых в фармацевтической промышленности, около 25% веществ, используемых в агрохимической промышленности (многие биоциды, созданы на основе хиральных нейропептидов, полу синтетических соединений стереоизомера традиционного пестицида) можно считать гомохиральными. Положительное или отрицательное действие лекарственных веществ, инсектицидов, органолептических проявлений принципиальным образом связано с их хиральной5 чистотой. В противном случае эффект их воздействия может быть губительным для живых организмов. Как правило, лекарства имеют положительный эффект в «левой» форме, что связано со стереоспецифической организацией клеточных рецепторов, транспортных систем, комплементарностью взаимодействия белков и нуклеиновых кислот с лигандами. Вместе с тем восприимчивость организмов к L-изомерам заведомо не является» исключительно- положительным свойством, т.к. и L-изомеры могут вызывать нежелательные эффекты. В качестве примера можно привести историю использования препарата талидамид, его L-изомер обладал положительным действием, а «правый» — выраженным тератогенным эффектом. Примеров .такого рода имеется множество: антиопухолевый препарат сарколизин активен лишь в «левой» форме, антикоагулянт варфавин и ряд противовоспалительных средств замедляют метаболические процессы только в L-форме, инсулин, допамин, многие синтетические гормоны также должны быть хирально чистыми «левыми» изомерами. Существенным представляется учет эффективного влияния «сверхмалых доз» хиральных соединений на биологические системы.
Масштаб опасности «хирального загрязнения» переоценить трудно. Изомерные соединения могут вызывать мутации у растений, у сельскохозяйственных животных, у "полезных" насекомых и- у вредителей, стимулировать рост заболеваемости в различных регионах, не только в зонах эмиссии. В составе аэрозолей хиральные поллютанты переносятся барическими водными и ветровыми потоками из зон эмиссии на расстояния межконтинентального масштаба.
Скорость рацемизации аминокислот в почвах существенно зависит от типа почв и их использования. В почвах пастбищ, например, рацемизация аминокислот происходит скорее, чем в почвах пшеничных полей [113]. Поскольку аминокислоты, как свободные, так и в составе белков, являются» одним из основных источников азота в почвенных трофических цепях, скорость рацемизации аминокислот влияет на содержание доступного азота в почве. Сама . же скорость рацемизации существенно зависит от физико-химических условий в среде, в частности, от температуры (увеличение температуры на 4 С увеличивает скорость рацемизации аминокислот в среднем вдвое), от наличия ионов переходных металлов, от рН и редокс-потенциала и т.п., которые одновременно и складываются в зависимости от видового состава почвенных биоценозов, и определяют этот видовой состав.
Термодинамически неравновесный поверхностный микрослот мирового океана; изучению физико-химических СВОЙСТВ которого в значительной степени посвящена1 настоящая? работа;. является уникальным синергетическим объектом. Фракционирование ионовшзнантиомеровїВгТПСцелесообразнофассматривать с точки зрения сопряжения потоков растворенных веществ характеризующихся; разной симметрией;
В результате: фазовых переходов , как; правило происходит изменение симметрии; системы; характеризующееся, параметром порядка; однако? ві системах жидкость - жидкость и;жидкость - пар симметрияше:изменяется. BSпринципе,.и переході молекул какого-либо вещества1 из жидкош фазы в. газовую не: изменяет симметрии; их;окружения: Вместе с: тем; когда- МЬІІимеем» дело?с: границей раздела фаз;.появляется ось, симметрии. Речь здесь идет о сравнении? двух равновесных. фаз;, тогда, как; водная- и воздушная, фаза при испарении не; находятся вч термодинамическом равновесии — происходит тепломассообмен, появляется; направление, вектор. Принципиальный, вопрос: линейна ли эта система или нелинейна; линейны ли сопрягающиеся ВьТПС процессы или нелинейны.
Ларе нсагер; сформулировал общие соотношения в; неравновесной-термодинамике в; линейной . области .вблизи- состояния равновесия.. В" неравновесных термодинамических: системах,- в; которых имеются; градиенты-температуры, концентраций; компонентов; химических потенциалов и т.д., возникают необратимые: процессы теплопроводности, диффузии,, химических реакций и т.д. При малых отклонениях системы от термодинамического равновесия потоки линейно зависят от обобщенных термодинамических сил. Матрица кинетических коэффициентов в линейных законах симметрична: перекрестные влияния обобщенных термодинамических сил на потоки одинаковы.
Известен принцип симметрии Кюри - Пригожина: неравновесные процессы подразделяются на скалярные (химические реакции, структурная релаксация, объемная вязкость), векторные (диффузия, теплопроводность, электрический ток), тензорные (вязкие сдвиговые течения, тепло- и электропроводность неоднородных сред). Тензор нулевого ранга - скаляр, тензор первого ранга -вектор, тензор второго ранга (тензор) - квадратная матрица, содержащая девять элементов при трехмерном описании анизотропных сред.
В линейной области необратимые процессы не обязательно сопрягаются, но при наличии сопряжения скалярный (изотропный) процесс сопрягается со скалярным, векторный - с векторным. Изотропные системы обладают высшей степенью симметрии. Внешние воздействия, вызывающие различные явления в макроскопической системе, не могут обладать более высокой симметрией, чем порождаемый ими процесс. При сопряжении не может понижаться степень симметрии.
