Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР II
1.1. История развития представлений о механических свойствах глобулярных белков II
1.2. Трудности теоретического и экспериментального исследования механических свойств глобулярных белков 16
1.2.а) Теоретические расчета и исследования в растворе 16
1.2.6) Измерения на твердых образцах. Основной принцип предлагаемого метода 21
1.3. Монокристаллы белков как объект исследования механических свойств глобулярных белков 23
1.3.а) Преимущества монокристаллов как объектов исследования 23
1.3.6) Сравнение структуры и свойств белков-ферментов в растворе и в кристалле 24
1.3.в) Влияние иммобилизации глутаровым альдегидом... 28
1.3.г) Лизоцим - основной объект исследования 31
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2.1. Микрометод измерения механических свойств твердых образцов 36
2,1 .а) Способы описания вязкоупругих свойств 36
2.1.6) Принцип метода измерения 37
2.1.в) Аппаратура и измерение 41
2.1 .г) Проверка микрометода 46
2.1 .д) Точность измерения Е итЭ> 49
2.2. Материалы. Подготовка образцов 51
2.2.а) Выращивание и фиксация глутаровым альдегидом .кристаллов белков 51
2.2.6) Изготовление и фиксация аморфных пленок 54
2.2.в) Подготовка образцов к измерению 55
2.2.г) Условия проведения экспериментов 59
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Механические свойства монокристаллов белков. Влияние неспецифических физико-химических факторов.. . 62
3.1.а) Зависимость Е и $ от частоты 62
3.1.6) Влияние фиксации глутаровым альдегидом 64
3,1.в) Зависимость от влажности 69
3.1 .г) Зависимость от температура 76
3.1.д) Влияние денатурации 80
3.1 .е) Зависимость от рН и ионной силы 85
3.2. Свойства молекулы глобулярного белка как однородного материала 87
3.3. Механические свойства кристаллов лизоцима.
Влияние аналогов субстрата 96
3.3.а) Влияние Л/^ацетил-Д)-глюкозамина на механичес
кие свойства триклинных кристаллов 97
3.3.б) Исследование эффекта аналогов субстрата на
различных твердых образцах лизоцима 104
3.3.в) Концентрационная зависимость эффекта ацетил-3)-глюкозамина 109
3.4. Молекула лизоцима как механическая конструкция 116
Заключительные замечания 123
ВЫВОДЫ 125
СПИСОК ЛИТЕРАТУШ 127
- История развития представлений о механических свойствах глобулярных белков
- Микрометод измерения механических свойств твердых образцов
- Механические свойства монокристаллов белков. Влияние неспецифических физико-химических факторов..
Введение к работе
Актуальность темы. Выяснение роли внутримолекулярной подвижности в функционировании белков является одной из фундаментальных задач современной молекулярной биофизики /6,10,23,71, 124,165,199/. Усилиями многих исследователей разными методами показано, что в молекулах биополимеров могут осуществляться самые разные движения, отличающиеся частотами, амплитудами и массами, вовлекаемыми в это движение /23,35,91,101,116,161/. Наряду с движением отдельных атомов и небольших групп, в белковых молекулах возможны движения, связанные с синхронным перемещением большого числа атомов, - коллективные движения, к которым относятся длинноволновые фононы в фибриллярных структурах, деформационные колебания глобулы как целого ("дыхательные движения") и относительные перемещения отдельных частей глобулы. Такие коллективные движения являются по своей сути механическими и допускают описание в рамках классической механики. Для подобного описания требуется знание механических характеристик глобулярных белков. По величине этих характеристик, можно судить о том/ в каком агрегатном состоянии "твердоподобном" или "жидкоподобном" находится белковая глобула, какова природа ее упругости. Изучая анизотропию и внутреннюю неоднородность вязкоупругих свойств глобулы, изменение этих свойств и формы молекулы при функционировании, при связывании различных специфических лигандов, можно выяснить, есть ли у глобулы четко выраженные жесткие домены, способные двигаться как целое, и гибкие участки, играющие роль сочленений, т.е., можно ли рассматривать глобулу белка как специальным образом устроенный механизм с выделенными степенями свободы, какова кинематика движений такого механизма, какова роль этих движений в процессе превращения субстрата в продукт и т.д.
Однако до сих пор механические свойства глобулярных белков были изучены крайне мало. Отсутствуют не только достаточно достоверные количественные характеристики, но и единое качественное представление о том, что собой представляет глобулярный белок с точки зрения механики.
Среди многочисленных гипотез об основных принципах работы ферментов существуют как основанные на представлении о молекуле белка как об упругом твердом теле, специальным образом устроенной конструкции, машине /6,9,10,54,57,120,133/, так и предполагающие, что белок - это капля масла, мицелла с гидрофобным жидким ядром /8,95,119,197,199/. Описание внутримолекулярных движений в белках также производится либо по аналогии с движением в жидкостях, либо в представлении о глобуле как о твердом теле /1,55,56,81,96,139,154/. Сделать выбор среди подобных гипотез и моделей можно лишь располагая экспериментальными данными о механических свойствах глобулярных белков.
В связи со сказанным, целью настоящей работы является исследование вязкоупругих характеристик молекул глобулярных белков и зависимости этих характеристик от функционального состояния белка.
Для решения поставленной задачи нельзя применить известные физические методы исследования глобулярных белков в растворе, так как, согласно имеющимся теоретическим оценкам /137,138,161/, коллективные движения в глобуле в такой вязкой среде, как вода, затухают апериодически и имеют характер ограниченной диффузии.
Поэтому возбудить такие коллективные движения на собственных частотах в растворе невозможно. Различными физическими методами можно лишь зарегистрировать наличие такой внутримолекулярной подвижности, но нельзя измерить упругие характеристики исследуемой степени свободы. Более подробно эти вопросы обсуждаются в разделе 1.2.
В.Н.Морозов предложил для исследования механических характеристик глобулярных белков использовать механические методы исследования иммобилизованных твердых ориентированных образцов белков, лучшими из которых являются монокристаллы белков /28/. Такой подход позволяет механически, с помощью внешней силы возбуждать исследуемые степени свободы на частотах, существенно меньших, чем собственные, и тем самым в значительной степени исключить влияние вязкого трения. В сочетании с данными рентгено-структурного анализа о структуре молекул и упаковке их в кристалле, такой подход,в принципе,дает возможность исследовать внутримолекулярную анизотопию механических свойств молекул белков как элементов конструкции кристалла.
Для решения поставленной задачи потребовалось:
Разработать методы изготовления из монокристаллов белков образцов, пригодных для проведения механических измерений микрометодом В.Н.Морозова.
Провести изучение влияния разных факторов на механические свойства кристаллов белков с целью установления связи между макрохарактеристиками кристалла и характеристиками молекул белка.
Определить величину и общий характер упругости белковой глобулы и сравнить их с известными из литературы аналогичными характеристиками других материалов.
4. Исследовать изменения механических свойств белков - ферментов при связывании специфических лигандов в активном центре.
В соответствии с поставленной задачей в качестве основного объекта исследования был выбран лизоцим белка куриных яиц, так как этот белок легко доступен, хорошо кристаллизуется, хорошо изучен различными методами, известна структура и упаковка его молекул в различных кристаллических модификациях. Были исследованы вязкоупругие характеристики 4-х различных кристаллических модификаций лизоцима, фиксированных глутаровым альдегидом (ГА), и одной - без фиксации.Ряд исследований был выполнен на кристаллах миоглобина кашалота, гемоглобина лошади, алкогольдегидроге-назы печени лошади, фиксированных и нефиксированных ГА аморфных пленках лизоцима, яичного альбумина, бычьего сывороточного альбумина, оС-химотрипсина. Исследовано влияние на измеряемые характеристики кристаллов частоты измерения, фиксации глутаровым альдегидом, температуры, степени гидратации, рН, ионной силы, связывания специфических агентов, денатурации. Измерены константы связывания jV^aneTim-D -глюкозамина лизоцимом в 2-х кристаллических модификациях. Значения констант хорошо совпадают с известными для лизоцима в растворе.
Научная новизна.
Впервые измерены вязкоупругие свойства монокристаллов глобулярных белков.
Обнаружено, что механические свойства кристаллов значительно меняются при различного рода изменениях как внутри-, так и межмолекулярных взаимодействий. Показано, что при определенных условиях вклады этих взаимодействий можно разделить и, исследуя характеристики кристаллов, можно получить сведения о вязкоупру- гих свойствах молекул, как элементов конструкции кристалла.
По результатам исследования 7-ми различных глобулярных белков установлено, что нативная глобула находится в твердом аг-регатном состоянии с модулем Юнга Е = 2-Ю ГН*м и что основной вклад в упругость глобулы вносит потенциальная энергия невалентных взаимодействий атомов в молекуле, а не изменение энтропии, как в случае каучуков /II/.
В результате денатурации химическими реагентами белок испытывает качественное изменение механических свойств, подобное тому, которое сопровождает переход полимеров из стеклообразного в высокоэластическое состояние. Модуль Юнга падает по в 1000 раз и упругость приобретает энтропийный характер, типичный для каучуков.
Экспериментально показано, что молекулу лизоцима следует рассматривать как конструкцию, состоящую из двух жестких доменов, соединенных упругой связью. Сделана оценка жесткости такой конструкции на растяжение tL= 5,5-14 Н»м и на изгиб то р т
ЗС= (0,5-1,5) »10 эрг «рад . моль . (Для сравнения, упругая постоянная водородной связи &= 15-30 Н»м /42,161/).
6. Показано, что механические свойства такой конструкции значительно меняются при функционировании. При связывании ана логов субстратов податливость глобулы лизоцима уменьшается на >40-50%.
Практическая ценность. Обнаруженная способность твердых иммобилизованных образцов глобулярных белков менять свои механические свойства под влиянием различных физико-химических факторов может служить в качестве основы для создания принципиально новых технологических устройств.
История развития представлений о механических свойствах глобулярных белков
Идеология подхода к молекуле белка как к механической системе восходит к 40-м годам, к работам Энгельгардта и Любимовой, которые показали, что сократительный белок мышцы - миозин является АТФ-азой /90/ и что способность актомиозиновых нитей изменять свои механические свойства и длину под воздействием АТФ неразрывно связана с наличием у них такой АТФ-азной активности /59,60/. Так было создано новое направление исследований - ме-ханохимия.
Четкая система взглядов на белковую глобулу как на гетерогенную механическую систему, специальным образом устроенную конструкцию, была впервые изложена около 15 лет назад в статье Чер-навского, Хургина и Шноля /53,54/. В своих расчетах авторы использовали экспериментальные значения модуля Юнга, полученные для ряда белков в растворе Пасынским /33/. Это было первое экспериментальное определение модуля Юнга глобулярных белков, основанное на вискозиметрическом определении степени деформации молекулы за счет электростатического отталкивания зарядов на ее поверхности, число которых изменяли, изменяя рН раствора. Однако, вследствие сложности метода и большого числа приближений и допущений, сделанных при выводе основной расчетной формулы, получен 9 2 ные Пасынским значения модуля Юнга для белков Е=1-4»Ю дн«см (0,1-0,4 ГН»м ) оказались (как показали последующие исследования /29,144/) заниженными по крайней мере на порядок. Тем не менее, Пасынский приходит к правильному выводу о том, что "по 12 лученный результат, очевидно, является несовместимым с какими-либо представлениями о текучем или жидко-эмульсионном состоянии белковых глобул, если иметь в виду деформацию белковых молекул в целом. Этим не исключается, однако, возможность местных пластических деформаций небольших отрезков полипептидных цепей" /33/.
Более точная по порядку величины оценка значения модуля Юнга глобулярных белков была сделана ранее Якобсоном исходя из экспериментально измеренных им значений адиабатической сжимаемости (Ь растворов ряда белков. Приняв коэффициент Цуассона для белков равным Jit = 0,3 и используя найденное им ft = 1 10 См , Якобсон получил из известного соотношения для модуля Юнга Е = 3(I-gJQ Е _ ю ГН м"2 /115/. Однако, поскольку кажущаяся сжимаемость растворов белков включает в себя как сжимаемость собственно глобул, так и сжимаемость гидратной оболочки, вклад которой достаточно велик и, как это было показано Сарвазяном и Харакозом /39/, может составлять 40 -60% для белков с молекулярным весом около 50000, то этот расчет можно рассматривать лишь как оценку. Тем не менее, знание величины модуля Юнга позволило Якобсону впервые рассчитать собственные частоты колебаний глобулы, как упругого однородного тела /114,115/,, и показать, что они должны лежать в микроволновой части радиочастотного диапазона (3-5 см" ). В последующие годы исследование механики глобулярных белков продвинулось очень незначительно вследствие сложности теоретического рассмотрения сколько-нибудь нетривиальных моделей и отсутствия экспериментальных методов исследования. Был неоднократно повторен независимо рядом авторов расчет Якобсона собственных частот колебаний глобулы как упругой изотропной сферы /54,180/. Считается, что собственные частоты глобулы средних размеров 30-40 А должны составлять 20-50 см" . Известен также пока единственный пример существенно более сложного расчета относительного движения доменов в лизоциме, позволивший оценить как частоты таких колебаний, так и жесткость такой выделенной степени свободы - жесткость шарнирного сочленения между доменами /137/. В самое последнее время появилась работа, в которой автор в рамках очень упрощенной модели пружины с распределенной массой попытался оценить низкочастотные колебания С-концевого участка cL -спирали в глобуле об-химотрипсина, делая очень грубые допущения о влиянии внутримолекулярной вязкости на это движение /83/.
Микрометод измерения механических свойств твердых образцов
Для характеристики упругих свойств различных материалов, в зависимости от типа деформации, обычно используются такие величины, как модуль сдвига ы , модуль одноосного растяжения (сжатия) -модуль Юнга Е, модуль всестороннего сжатия К или соответствующие им обратные величины - податливость о j?T сжимаемость (Ъ="]? " и т.п. Модули упругости по закону Г ка прямо пропорциональны на-пряжению, приложенному к образцу 0=-%г и обратно пропорциональны относительной деформации образца. Так, например, в случае модуля
Юнга -В" -p. kf гДе сила -Р площадь поперечного сечения образца, &/, - относительное удлинение образца длиной {,. Поэтому наиболее прямой метод определения этих величин заключается в непосредственном снятии диаграммы напряжение-деформация и в расчете этих величин согласно закону Гука. Если приложенное к телу напряжение будет меняться периодически, например, по синусоидальному закону, то и деформация также будет меняться по этому закону, но с некоторым сдвигом по фазе на угол У . Для идеально упругого тела сдвиг фазы должен быть равен 0, для ньютоновской жидкости - -g- , для всех реальных твердых тел за счет потерь энергии на внутреннее трение мы имеем некоторое промежуточное значение. Б этом и проявляется отличие вязкоупругих тел от идеально упругих. Важная особенность вязкоупругих тел - зависимость их механических свойств, измеренных динамическими методами, от
Метод разработан В.Н.Морозовым частоты, на которой это измерение произведено /3,47/. В качестве меры потерь энергии на внутреннее трение для характеристики вязкоупругих свойств материалов обычно используют тангенс угла механических потерь jjcif , динамическую вязкость, логарифмический декремент затухания $ и др. /47/. Б случае однородного изотропного тела модули упругости являются скалярными величинами. Однако, для анизотропных тел значения механических свойств будут существенно зависеть от направления, поэтому необходимо применять все эти величины в тензорном виде /15,38,41/. Так, например, для полного описания механических свойств триклинных кристаллов необходимо измерить 21 независимую упругую постоянную. С повышением симметрии кристалла число независимых переменных падает и, следовательно, уменьшаются возможности детального исследования анизотропии молекул, его составляющих. Поэтому кристаллы низкой симметрии являются более подходящим объектом исследования для решения наших задач.
Механические свойства монокристаллов белков. Влияние неспецифических физико-химических факторов
Исследование влияния неспецифических воздействий (частоты, температуры, влажности, состава внутрикристаллической жидкости и т.п.) на величину измеряемых характеристик кристаллов необходимо по двум причинам: во-первых, такое исследование позволяет выявить и устранить возможные причины артефактов, более полно охарактеризовать новый метод измерения; во-вторых, оно позволяет исследовать природу упругих сил, действующих в кристалле; природу и величину упругости молекул его составляющих.
Ранее, в разделе 2.1.г мы показали экспериментально, что предлагаемый микрометод измерения вязкоупругих свойств дает результаты, хорошо согласующиеся с результатами измерений другтли методами. Точность метода и факторы, влияющие на эту точность, обсуждены в разделе 2.1.д. Чтобы полностью закончить обсуждение самого метода измерения, необходимо еще обсудить влияние иммобилизации ГА и частоты измерения на величину измеряемых характеристик .
