Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
Глава 2. Методы 47
Молекулярная модель 57
Получение статистических характеристик. 58
Глава 3. Термодинамический анализ механизмов влияния иминокислот -пролина и оксипролина на физические характеристики коллагенов 61
Расчет гидратации одно цепочечных спиральных полипептидов 64
Расчет гидратации трехцепочечных спиральных полипептидов 73
CLASS Глава 4. Левая спираль типа поли-1-пролин II в линкерных областях ДНК- CLASS связывающих белков 82
Глава 5. Обсуждение результатов 88
Список литературы 93
- Расчет гидратации одно цепочечных спиральных полипептидов
- Расчет гидратации трехцепочечных спиральных полипептидов
- Левая спираль типа поли-1-пролин II в линкерных областях ДНК- CLASS связывающих белков
Введение к работе
Введение. Актуальность проблемы.
Коллаген считается самым распространенным белком. Его содержание в тканях животных превышает 60%. Долгое время полагали, что фибриллярный коллаген ответственен лишь за опорные и предохранительные функции.
Однако установление коллагеновых участков в Cql-компоненте комплемента, в ацетилхолинэстеразе и, наконец, открытие различных типов коллагена показало, что для коллагенового семейства характерно большое функциональное разнообразие. Но что делает коллагены уникальными белковыми объектами, так это разнообразие тех уровней организации, на которых происходит реальное функционирование коллагеновых полипептидов.
Общепринято, что физико-химические свойства макромолекул определяются последовательностью их химических единиц. Понимание молекулярных основ функционирования макромолекул предполагает знание системы взаимодействий, приводящих к формированию различных уровней организации. А это, в свою очередь, предполагает детализацию роли каждого из элементов структуры в определении физических свойств макромолекул.
Вместе с тем в наших знаниях практически о любом из уровней организации имеются существенные пробелы. Например, количественному изучению до сих пор поддаются лишь две из трех регулярных вторичных структур - а-спираль и /3-структура. Важнейший, как ясно сегодня, третий тип структуры - левая спираль типа поли-1-пролин II - а это основа структурообразования коллагенов - до сих пор недостаточно охарактеризован количественно, прежде всего, в смысле физических характеристик, где наибольшую неясность вносит боковой радикал пролина, ответственный за само название типа структуры. Действительно, гидрофобный боковой радикал пролина - пятичленное пирролидиновое кольцо - не снижает высокую растворимость как пролина, так и пептидов с пролином и поли-1-пролина, которые значительно выше, чем это требовал бы индекс гидрофобности бокового радикала. Эти свойства пролиновых пептидов, несомненно, определили необычные явления, наблюдаемые при денатурации (плавлении) фибриллярных макромолекул коллагенов. С ростом содержания иминокислот растет энтропия денатурационного перехода, что не вяжется с ограничениями на конформационное состояние пролина - пятичленного кольца, замыкающегося СЛМ-связью, в основной цепи полипептида. Вместе с тем именно структуры коллагенового типа являются основой многих новых материалов для промышленности и медицины.
Приведенные доводы делают очевидной большую актуальность исследований левой спирали типа поли-1-пролин II и пролина как регулятора процессов структурообразования коллагенов и других белков, а также структуры и физических свойств материалов, сконструированных на основе фибриллярных коллагеновых систем.
Цель и задачи исследования.
Главной целью проведённой работы было установление молекулярных механизмов влияния иминокислот, пролина и оксипролина, на термодинамические характеристики коллагенов и одноцепочечных полипептидных систем в конформации левой спирали типа поли-1-пролин П. В задачи работы входило: • анализ термодинамических характеристик коллагенов с различным содержанием иминокислот; • расчет параметров переходов, включая оценку размеров кооперативных областей на основании сравнения калориметрической и Вантгоффовской энтальпий; • сравнительный анализ архитектуры гидратации трехспиральных макромолекул коллагенов и амино- и иминокислот; • сравнительный анализ характеристик сеток водородных связей в коллагенах по совокупности данных термодинамического, спектрального анализа и анализа возможных типов гидратации структур; • поиск вытянутых левоспиральных конформаций в линкерньгх пептидах белков, установление роли линкерньгх пептидов в комплексах двуспиральная ДНК-белок.
Научная новизна.
Впервые установлен молекулярный механизм влияния иминокислот на физические характеристики коллагенов. Показано, что дегидратация пептидных групп в местах расположения пролинов приводит к разделению кооперативных областей на несвязанные части. Далее в несвязанных частях бывшей кооперативной области начинают варьировать параметры NH-валентных колебаний, что выражается в уширении соответствующих полос в ИК-спектрах денатурированных коллагенов по сравнению с нативными. Последующий разрыв Н-связей, казалось, позволил бы произойти гидратации пептидных групп. Однако это не совместимо с кооперативной гидратацией олигопептидов, содержащих аминокислоты. Как следствие, на участках, где одиночная цепь имеет разрывы в кооперативной сетке Н-связей воды, а азот иминокислоты дегидратирован, увеличивается конформационная подвижность иминогруппы.
Таким образом, разрушение кооперативной сетки водородных связей в одиночной после денатурации трехцепной макромолекулы коллагенов приводит к росту энтропии перехода по мере роста содержания иминокислот в коллагенах.
Впервые для интерпретации результатов термодинамических данных по плавлению коллагенов проведен расчет числа кооперативных областей в фибриллярной макромолекуле.
Впервые показано, что характер гидратации одиночной левой спирали типа поли-1-пролин II зависит от последовательности расположения пролинов в полипептидной цепи.
Анализ линкерных пептидов показал, что левая спираль типа поли-1- пролин II часто возникает на линкерных участках белков. При образовании контактов этими участками полипептидньгх цепей левая спираль на них часто сохраняется, при этом средняя длина участков поли-1-пролин II составляет шесть остатков, что означает некооперативность гидратации пептидных групп, то есть поверхность узнавания таких мест определяется скорее боковыми радикалами, чем профилем поверхности кооперативной сетки воды.
Установлены участки контактов НК и пептидов в конформации левой спирали типа поли-1-пролин П. Практическое значение работы. Результаты данной работы могут представлять ценность при создании системы предсказания участков взаимодействия полипептидных цепей в коллагенах разного типа и разного происхождения. Тонкая регуляция таких контактов осуществляется за счет специфики структур гидратной воды в разных последовательностях амино- и иминокислот.
Установление роли иминокислот в коллагенах допускает возможность на новой основе прогнозировать следствия мутационных замен в генах коллагенов, что позволит уже в ближайшее время начать разработку соответствующих терапевтических подходов.
Полученные новые знания о термодинамике коллагенов дадут возможность проектировать коллагеновые материалы с заданной температурной стабильностью и адгезионными свойствами.
Расчет гидратации одно цепочечных спиральных полипептидов
Был проведен расчет ячейки гидратации для одиночной полиаланиновой спирали в конформации, соответствующей антипараллельной /3-структуре, т.е. ф= -139 , \/= 135 , проекция остатка = 0,343 нм, угол поворота на остаток = 179,11.
В качестве асимметричной единицы выбран дипептид (Ala - Ala)n , причем первому остатку аланина присваивается номер 1, а второму - 2. Вводятся цилиндрические периодические граничные условия: проекция = 0,686 нм, поворот = 358,22.
Найдены два пика плотности воды (Wl, W2) на карбонильный кислород, третий пик обнаружен вблизи иминной (NH-) группы (W3). Эта вода также связана в определенной степени с карбонильным кислородом. Координаты пиков плотности даны в цилиндрической системе координат с осью z, совпадающей с осью спирали.
Ось х определяется атомом N первого остатка (его у-коордната равна 0). Координаты пика плотности - координаты прямоугольного параллелпипеда с длиной края около 0,07 нм (точность локализации пика). Координаты были пересчитаны согласно полярным группам первой пептидной группы в ячейке (С=0 первого остатка и N-H второго) чтобы проиллюстрировать цилиндрическую периодичность внутри асимметричной единицы.
Увеличение г и ф, сопряжено с наталкиванием на Ср i+4 остатка. Все мостики воды между полярными группами спиралей характеризуются очень низкой вероятностью ( р 0,02 ) за исключением мостиков типа С=0; ... W3 ... \1(или W2)... 0=СІ+1 в 3/10-спирали Gly ( р до 0,20 ). Помимо акцента на анализ уникальной структуры мы также хотели бы привлечь внимание к тому обстоятельству, что коллаген является системным белком, определяющим значительное число процессов структурообразования в биологических объектах на разных уровнях их организации, прежде всего - на клеточном и тканевом. Однако, невзирая на значительное количество работ, затрагивающих самые разные стороны структурообразования и функционирования коллагенов, принципиального прорыва в понимании закономерностей образования и стабилизации этих белковых структур до сих пор нет. Достаточно большая неопределенность в наших знаниях о белковых структурах связана с. иминокислотами, которые, как оказалось, не только играют ключевую роль в стабилизации трехцепных макромолекул коллагенов, но и они же определяют необычные физические свойства коллагеновых макромолекул. Пролин входит в список основных, так называемых, кодируемых аминокислот и обладает уникальной химической структурой. Из-за наличия пирролидинового цикла в нем отсутствует N-Н-группа, способная при адсорбции воды служить донором водородной связи. Тот же пирролидиновый цикл фиксирует двугранный угол ф в основной цепи в районе -70, создавая тем самым существенные конформационные ограничения.
Пролин наилучшим способом подходит для третьего типа вторичной структуры белков - левой спирали типа поли-1-пролин II (РР II). Спираль обладает псевдо симметрией Сз и служит основой фибриллярной части коллагена, представляющего собой уникальный комплекс трех спиралей типа поли-1-пролин II, и также достаточно часто встречается в глобулярных белках.
Растворимость пролина в воде доходит до 7 М, в то же время он хорошо растворим в водноспиртовых смесях с большим содержанием спирта. СО-группа пролина более электроотрицательна, чем соответствующие карбонильные группы других аминокислот и является поэтому наиболее сильным акцептором протонов. Расположение водных мостиков вокруг одиночной полипептидной цепи поэтому зависит расположения иминокислот. При включении пролина в полипептидную цепь из-за уменьшения количества и хаотизации распределения доноров протонов в полипептидной цепи сокращаются в размерах области кооперативной гидратации пептидных групп, т.е. растет энтропия одиночной полипептидной цепи.
Мы провели расчет фрагмента полипептидной цепи коллагена третьего типа человека - 1BKV (соответствующий рисунок приведен в главе «Обсуждение результатов») с целью убедиться в эффективности завязывания двух сеток водородных связей на участках с аминокислотой во втором положении триплетов на разных участках коллагеновой макромолекулы. Проведен детальный анализ расположения СО-групп на различных участках макромолекул коллагенов различных типов, для которых Ю.В. Мильчевским и И.В.Филатовым с соавт. рассчитаны полные атомные структуры (см. главу «Обзор литературы.») На Рис.15 приведена структура трехцепной макромолекулы коллагена.
Расчет гидратации трехцепочечных спиральных полипептидов
Было проведено изучение шести вариантов структуры коллагена с помощью Монте- Карло-симуляции их сфер гидратации. Были использованы те же потенциалы, что и в случае одиночных пептидных спиралей (Momany et al., 1974; Momany et al., 1975; Nemethy et al., 1983). Были найдены характеризующиеся достаточно высокой вероятностью (0,02-0,60) внутримолекулярные мостики типа Y3 O..Wl..W2..Gly4 (также GlyL O..Wl..W2..Gly2 О и Y3 O..Wl..W2..Y3 О). ОН-группа оксипролина расположена достаточно далеко от других полярных групп коллагена и мостики воды с ее участием достаточно редки. Энергия молекул воды в мостиках воды мало различается в разных мостиках. Координаты даны в координатной системе С (Y). Величина пика: 0,40-0,96, никаких других пиков в первой сфере гидратации не наблюдалось. Таким образом, проведенный методом Монте-Карло анализ возможного распределения воды вокруг полипептидов в разных конформациях однозначно показал, что в трехцепной макромолекуле вода может связываться только с СО-пептидными группами. Во всех остальных случаях организация гидратной сферы, в частности, связной цепочки молекул воды происходит с участием NH-пептидных групп.
Мы провели термодинамический анализ результатов калориметрии коллагенов, выделенных из животных, далеких в таксономическом отношении, по следующим причинам. Во-первых, коллагены имеют специфическую структуру, термостабильность которой соответствует температурным условиям среды обитания. Во-вторых, эта структура стабилизируется водой, причем упорядоченная гидратная оболочка образуется, повторим еще раз, на основе карбоксильных СО-групп полипептидной цепи, т.е. при образовании водной спирали вокруг трехцепной макромолекулы коллагена не используются NH-группы, т.е. пептидный азот.
Специфическая водная структура вокруг коллагенов - единственный пример образования кооперативной сетки воды вокруг полипептида без NH-группы как донора протонов. Кооперативная сетка воды вокруг денатурированной одиночной цепи коллагена принципиально другая: NH-группы аминокислот являются важными опорами сетки Н-связей вокруг левой спирали типа поли-1-пролин II в аминокислотном полипептиде. Таким образом, в процессе денатурации коллагена должна происходить перестройка спирали гидратной воды, т.е. изменяться геометрия и деформироваться симметрия спирали воды.
Каков же механизм перехода в денатурированное состояние с участием иминокислот? Две группы данных: термодинамические характеристики переходов в коллагенах, во-первых и изменения в спектрах водородных связей в процессах денатурации - во вторых - могут подсказать, какие стадии процесса денатурации определяют этапы изменения стабильной полипептидной трехцепной спирали и как регулируется этот процесс.
Важно отметить еще раз, что коллагены - белки с уникальной фибриллярной структурой: средняя величина проекции остатка на ось спирали в коллагенах с различным аминокислотным составом, в том числе и содержанием иминокислот, определяемая методом рентгеноструктурного анализа, постоянна и составляет 2,86 А. Таким образом, изменение физических свойств коллагенов определяется не изменениями их пространственной структуры, но физико-химическими свойствами пептидных групп и боковых радикалов. В Табл. 12 приведены параметры тепловых переходов для макромолекул коллагенов с разным содержанием иминокислот.
Как известно из калориметрических данных, с ростом количества иминокислот растут и энтальпия и энтропия денатурационных переходов. Долгое время полагали, что объяснение может состоять в дополнительных молекулах воды, адсорбируемых на тройной спирали коллагена в местах концентрации аминокислот. Однако, эксперименты показывают, что гидратация коллагена ткане- но не видоспецифична, т.е. не коррелирует с содержанием иминокислот. В то же время в денатурированном состоянии упорядоченность систем NH-связей (по полуширине полос NH-валентных колебаний) падает с ростом числа иминокислот в макромолекуле, что и объясняет рост энтропии системы белок-вода.
Чтобы объяснить некоторые сложности в восприятии такого рода явлений в коллагене, имея в виду многолетнюю традицию восприятия процессов растворения пептидных систем с точки зрения индекса гидрофобности бокового радикал, проведем оценку нашего представления о растворимости олигопептидов в воде.
Подчеркнем, что для того, чтобы какое-либо вещество растворялось в воде, требуется, чтобы при растворении происходил бы выигрыш в свободной энергии. То есть, чтобы свободная энергия системы «растворяемая молекула в окружении молекул воды» была бы меньше, чем свободная энергия молекул воды и молекул растворяемого вещества по отдельности. Соответственно, если мы производим какую либо замену в растворяемой молекуле, например, заменяем молекулярную группу А на группу В, то, в зависимости от того, увеличится ли при этой замене свободная энергия или уменьшится, будет меняться и растворимость изменённого вещества. В большинстве случаев изменение свободной энергии просто определяется разницей в энергии взаимодействия групп А и В с водой. Именно, если при такой замене имеет место выигрыш в энергии взаимодействия, то растворение улучшается.
Однако, в некоторых случаях возможна и парадоксальная ситуация: имеет место проигрыш в энергии взаимодействия, а растворимость, тем не менее, увеличивается. Из общих соображений следует, что проигрыш в энергии взаимодействия должен в этом случае компенсироваться выигрышем, связанным с энтропией. Но как такое может происходить? Для энтропии Sможно записать: S = kB\n(N) где кв- константа Больцмана, a N- число состояний. Проигрыш в энергии взаимодействия в случае, когда мы осуществляем «замен А на В, может быть представлен как л(Дм), где Аи разница в энергиях на одну замену. Но чтобы выигрыш в энтропии мог бы скомпенсировать этот проигрыш в энергии, N в свою очередь должен иметь вид N а" где а - некоторая величина, которая может, в принципе, зависеть от п, но достаточно слабо (по крайней мере, не экспоненциальным образом). Такая зависимость числа состояний от п возможна только в том случае, если число степеней свободы системы - растворяемая молекула плюс вода — пропорционально п. То есть, каждая замена А на Л приводит к тому, что некая единая структура, характеризуемая фиксированным числом степеней свободы, распадается на две структуры, каждая из которых имеет уже свой набор степеней свободы. Например, подобная ситуация может происходить со связанной водой. До введения замены А яа В, связанная вода составляла единую структуру на растворяемой молекуле, а после замены единая структура оказывается по каким-либо соображениям невозможна, и будут образовываться уже две структуры, каждая из которых обладает своими собственными степенями свободы.
Левая спираль типа поли-1-пролин II в линкерных областях ДНК- связывающих белков
В этой главе изложены результаты исследований взаимодействий ДНК-левая спираль типа поли-1-пролин П. По базам данных белков и линкеров, как это описано в Методах, в рамках данной главы проведен поиск участков линкеров в конформации типа поли-1-полин II, в составе комплексов НК-белок. В PDB найдено 268 комплексов РНК-белок и 778 комплексов ДНК-белок. В них найдено 1260 линкерных участков. Среди них найдено 73 комплекса линкер-ДНК. Показано, что средняя длина участков левой спирали типа РРП составляет шесть остатков, причем пролин в них не является доминирующим .
Знание доменной структуры белков, существенное в аспекте структуры и функций этих важнейших макромолекул, предполагает, наряду с информацей о доменах, сведения о междоменных областях или о так называемых линкерах. В отличие от доменных субъединиц (компактных, структурно независимых образований в составе белковой глобулы) линкеры не характеризуются плотной упаковкой, не образуют контактов с доменами белков но, вместе с тем, нередко являются самостоятельными структурными и функциональными единицами белка. Для нас линкеры интересны как пример непосредственных комплексов, образуемых одиночными левыми спиралями типа поли- 1-пролин П.
Мы рассмотрели все лево-спиральные линкеры предполагая, что при определенных условиях возможно образования комплексов белок-нуклеиновая кислота ( Рис., Табл. 14). Показано, что средняя длина левоспирального линкера составляет шесть остатков, аминокислотный состав: Gin, Pro, Arg, Lys, He.
Наибольший интерес представляют левоспиральные линкеры, непосредственно контактирующие с ДНК или РНК (мы проанализировали 23 примера). Рассмотрим комплекс: парный домен человека РАХ-6 - ДНК. Линкер в данном комплексе имеет большое количество контактов с ДНК, мы обращаем внимание на контакты левоспирального участка, из которых удалось выделить два вида контактов - вандервальсовый и через водородную связь.
В Приложении мы приводим ряд рисунков контактов левоспиральных линкеров с ДНК и РНК. Отмечается, что симметрия расположения пролиновых остатков не допускает образования кооперативной сетки воды, длиной, большей одного остатка спирали 30/11. Контакты, как и предполагалось, допускают возможность правильного расположения оси симметрии второго порядка, перпендикулярной оси ДНК, и псевдооси симметрии второго порядка левоспирального участка. Таблица 14. Фрагменты линкеров в конформации левой спирали типа поли-1-пролин II в комплексах с ДНК, содержащие пролин.
Зависимость числа кооперативных единиц в коллагенах различного происхождения от содержания иминокислот. Проведенное сравнение дало нам право проведения полного стереохимического анализа полученной структуры. Показано, что при отсутствии дополнительных начальных условий в любой части коллагеновой молекулы генерируется трехспиральная структура с симметрией, соответствующей симметрии дифракционной картины коллагена. Таким образом, рассчитанная структура удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым рентгенографическими экспериментами. Впервые на политрипептидных фрагментах удалось получить спиральные параметры, близкие к определяемым на целых макромолекулах коллагенов, причем это характерно для фрагментов с аминокислотой во вторых положениях триплетов аминокислот.
Необходимо отметить, что двусвязная и односвязная модели Рича и Крика показывают, что именно СО-группы изо всех пептидных групп находятся на поверхности трехспирального комплекса в эквивалентном для гидратации положении. Анализ вероятностей распределения плотности воды по поверхности коллагенов показал, что вероятность образования мостиков водныз структур отлична от нуля только для СО-групп, для NH-групп она равна нулю (см. главу 3). Таким образом первые этапы денатурации коллагенов, несомненно, связаны с необходимостью разрушить сетку водородных связей молекул воды на .СО-группах трехспирального комплекса.
