Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 7
2.1 Типы Са2+-каналов и их классификация 7
2.2 Структура потенциалзависимых Са2+-каналов 10
2.3 Электрические и кинетические характеристики кальциевых токов... 14
2.4 Рецепторзависимая регуляция кальциевых токов L-типа 17
2.5 Роль фосфорилирования в регуляции кальциевого тока L-типа 22
2.6 Зимняя спячка — адаптация организма к экстремальным условиям 23
2.7 Метод перфорированного пэтча 27
2.7.1 Свойства перфорирующих соединений 28
2.7.2 Особенности заполнения пипеток 29
2.7.3 Преимущества методики перфорируемого пэтча 29
2.7.4 Ограничения методики перфорированного пэтча 30
3 Материалы и методы исследования 31
3.1 Метод выделения кардиоцитов 31
3.2 Контроль качества кардиомиоцитов 32
3.2.1 Морфологический контроль 32
3.2.2 Толерантность кардиомиоцитов к ионам Са2+ 33
3.2.3 Контроль потенциала покоя и потенциала действия 33
3.3 Метод перфорированного пэтча 34
3.3.1 Растворы 34
3.3.2 Приготовление и заполнение пипеток 35
3.3.3 Регистрация токов 35
3.3.4 Выделение Са2+-компоненты входящего тока у крыс и сусликов 38
3.4 Математическая обработка результатов 38
3.4.1 Статистический анализ 38
3.4.2 Методы аппроксимации данных 39
4 цАМФ-зависимая и цАМФ-независимая регуляция Са2+-токов 40
4.1 Потенциалзависимость действия изопротеренола на Са2+-токи L-типа 40
4.2 Обращение действия изопротеренола ацетилхолином: за и против. 43
4.3 Независимость механизмов регуляции Са2+-токов изопротеренолом и BAY К
4.4 Особенности регуляции кальциевого тока у гибернирующих животных 50
5 Двухцентровая модель фосфорилирования Са2+-канала 54
5.1 Описание модели 54
5.2 Анализ действия изопротеренола с использованием двухцентровой модели Са2+-канала 57
5.3 Попытка анализа двойственного действия BAY К 8644 61
5.4 Кинетические характеристики Са2+-тока L-типа в кардиоцитах крыс. 62
5.5 Анализ изменений, происходящих в кардиоцитах гибернирующих животных во время цикла спячка-бодрствование 68
6 Выводы
- Структура потенциалзависимых Са2+-каналов
- Свойства перфорирующих соединений
- Толерантность кардиомиоцитов к ионам Са2+
- Независимость механизмов регуляции Са2+-токов изопротеренолом и BAY К
Введение к работе
Потенциалзависимые Са -каналы L-типа играют ключевую роль в регуляции частоты и силы сердечных сокращений, генерации потенциалов действия, выбросе неиротрансмиттеров, модуляции нейронной активности (McDonald et al., 1994). В свою очередь, активность этих каналов регулируется большим количеством физико-химических факторов различной природы. К важнейшим из этих факторов можно отнести фосорилирование канала . В частности, эффект многих гормонов и неиротрансмиттеров связан с изменением активности протеинфосфатаз и протеинкиназ, увеличением или уменьшением количества фосфорилированных каналов и, как следствие, ростом или падением кальциевого тока, протекающего через данные каналы, за счет изменения вероятности открывания одиночного канала или числа активных каналов. Например, увеличение токов L-типа агонистами р-адренорецепторов опосредуется ростом активности цАМФ-зависимой протеинкиназы (Hartzell et al., 1991), а подавление тех же токов агонистами М-холинорецепторов — активацией соответствующей протеинфосфатазы (Herzig et al., 1995). Наличие сложной системы регуляции каналов L-типа приводит к тому, что действие даже хорошо изученных соединений оказывается иногда непредсказуемым, зависящим от различных внешних факторов (температура, рН, потенциал на мембране, частота стимуляции и т.п.). Так изменение поддерживаемого на мембране потенциала (Vh) сильно влияет на подавление токов ацетилхолином (McMorn et al., 1996) и их активацию изопротеренолом (Tiaho et al., 1991). Дигидропиридиновый агонист BAY К 8644 при деполяризации мембраны превращается из мощного активатора тока в блокатор (Hadley and Lederer, 1992). Внутриклеточный кальций в низких концентрациях действует как активатор каналов L-типа, но блокирует их при повышении концентрации (Hirano and Hiraoka, 1994). Подобная зависимость направления эффекта от концентрации наблюдается и в случае ингибиторов фосфатаз в гладкомышечных клетках (Obara and Yabu, 1993). Приведенные примеры показывают, что для адекватной интерпретации свойств того или иного регулятора кальциевого тока необходимо учитывать множество факторов, влияющих на активность каналов. В большинстве случаев эта задача решается детальным анализом действия того или иного соединения в различных условиях как самостоятельно, так и совместно с другими регуляторами.
Многообразие путей регуляции Са2+-токов L-типа определяется, в основном, двумя свойствами канала. Прежде всего, канал может находиться в одной из нескольких стабильных (с временами жизни порядка секунд) конформаций с различной быстрой (миллисекундной) кинетикой открываний и закрываний (т.н. моды канала) (Hess et al., 1984). Обычно рассматривают одну неактивную моду (0) и две активных (1 и 2). Некоторые авторы вводят в рассмотрение дополнительную активную моду la (Yue et al., 1990). Скорости перехода канала между различными модами зависят от различных внешних факторов, таких как потенциал, внутриклеточная концентрация кальция, влияние регуляторных соединений и т.п. Наличие нескольких активных мод означает, что популяция каналов в мембране неоднородна и может быть разделена на несколько групп, включающих каналы, находящиеся в одном состоянии. При этом токи, протекающие через различные группы каналов, обладают разными амплитудными и кинетическими характеристиками. Следует учитывать, что измеряемый экспериментально суммарный Са2+-ток L-типа является суммой токов, протекающих через каналы каждой группы, что часто затрудняет интерпретацию результатов экспериментов.
Второе важное свойство каналов L-типа— наличие нескольких центров фосфорилирования (McDonald et al., 1994). Для каналов в кардиоцитах известно, по крайней мере, два различных центра, фосфорилирование которых влияет на характеристики тока. Принято считать, что фосфорилирование одного из этих центров переводит канал из неактивного состояния в активное (чувствительное к изменениям потенциала), а фосфорилирование второго центра увеличивает вероятность нахождения канала в открытом состоянии.
Целью данной работы стали исследование системы фосфорилирования канала L-типа и влияния на нее мембранного потенциала, разработка и анализ модели, объясняющей ряд парадоксальных свойств канала, а также выявление и анализ изменений в системе фосфорилирования канала, происходящих при входе в состояние гибернации.
Структура потенциалзависимых Са2+-каналов
В настоящее время достаточно подробно исследована структура потенциалзависимых кальциевых каналов. Эти каналы являются комплексами, образованными центральной каналформирующей ai-субъединицей и различными регуляторными (вспомогательными) субъединицами, которые включают Р-субъединицу и дисульфидносвязанные агб-субъединицы; в зависимости от вида ткани в формировании канала может участвовать пятая субъединица (у — в скелетной мышце, нейрональная р95). Вполне вероятно обнаружение новых субъединиц. Методы молекулярного клонирования значительно расширили понимание структурных отличий потенциалзависимых кальциевых каналов. Однако в настоящее время не вполне устоялась терминология для ряда генов, кодирующих ai и Р-субъединицы потенциалзависимого кальциевого канала.
Birnbaumer с соавторами в 1994 году (Birnbaumer et al., 1994) предложили унифицированную номенклатуру для потенциалзависимых кальциевых каналов, базирующуюся на достижениях молекулярного клонирования и электрофизиологических экспериментов. Согласно этой номенклатуре описание полного кальциевого канала представлено в понятиях комплекса: ОахРпУгАгбп, где х — указатель гена (S, А, В, С, D, Е и др.) для субъединицы а\, п — номер (1, 2, ...) гена для других субъединиц кальциевого канала.
Таким образом, ais означает ai -субъединицу кальциевого канала скелетной мышцы, а под субъединицами от осід до OCIE подразумевают а і-субъединицы для кальциевого канала из мозга, клонированные последовательно.
Гены, кодирующие регуляторные (вспомогательные) субъединицы Р, агЬ, у и др. нумеруются соответственно с приблизительным порядком их открытия. Для у-субъединицы неизвестны структурные различия по типам потенциалзависимых кальциевых каналов, поэтому знаки для этой субъединицы опускают. В таблицах 2 и 3, представленных ниже, показаны различные типы ai- и Р-субъединиц потенциалзависимых кальциевых каналов в соответствии с данными Birnbaumer с соавторами (Birnbaumer et al., 1994).
Согласно представленной номенклатуре кальциевый канал L-типа скелетной мышцы имеет следующий состав субъединиц: aisPiAYO A. aj-субъединица имеет молекулярную массу 155-200 кДа, является ион-проводящим и потенциал-чувствительным компонентом канального комплекса. Показано, что чувствительность к дигидропиридинам является функциональной характеристикой L-типа кальциевого канала, которая отличает его от Т-, N- и Р-типов кальциевых каналов, причем с дигидропиридинами взаимодействует именно ai-субъединица. ДТП-антагонисты и агонисты связываются с определенными участками ai-субъединицы Са2+-канала L-типа (Tang et al., 1993). Кроме того, данная субъединица является мишенью для цАМФ- и Са -кальмодулин-зависимых киназ (Alkon and Naito, 1987), протеинкиназы С (Campbell et al., 1988). Интересно то, что ai-субъединица Са2+-канала L-типа обладает большой степенью гомологии с а-субъединицей №+-канала (Tanabe et al., 1987; Noda et al., 1984). Р-субъединица является мишенью для цАМФ-зависимой протеинкиназы и протеинкиназы С (Takahashi et al., 1987; Obejero-Paz et al., 1998), её молекулярный вес составляет 52-65 кДа. осгб-субъединица представляет собой дисульфидно сшитый комплекс из двух субъединиц с молекулярными весами 140 и 32 кДа. Она не содержит центров для фосфорилирования или связывания дигидропиридинов и фенилалкиламинов. Помимо физического взаимодействия с а.]-субъединицей, имеются доказательства того, что oti-и агб-субъединицы взаимодействуют функционально. Например, величина Са2+-тока ai-субъединицы сердечной мышцы, экспрессированной в ооцитах Xenopus, изменялась при коэкспрессии агб-субъединицы скелетной мышцы (Mikami et al., 1989). Коэкспрессия а2б-субъединицы изменяла также кинетические свойства Са2+-токов (Catterall, 1991; Singer et al., 1991). у-субъединица имеет молекулярный вес 30-32 кДа. Вероятно, )3- и у-субъединицы являются регуляторными.
Электрические и кинетические характеристики кальциевых токов Быстрая деполяризация клеточной мембраны от поддерживаемого потенциала (как правило, от -80 до -40 мВ) приводит к открыванию потенциалзависимых кальциевых каналов. При этом ионы кальция получают возможность поступать в клетку по градиенту концентрации. Большинство каналов отвечают на длительный деполяризующий стимул быстрой активацией тока, а затем относительно медленным его уменьшением за счет перехода каналов в инактивированное состояние. Для восстановления способности каналов к открыванию необходим возврат к поддерживаемому потенциалу.
Активационная кривая кальциевого тока описывается уравнением Больцмана: где V — тестовый потенциал, Vo.5 — потенциал, соответствующий полумаксимальной активации тока, к — крутизна активационной кривой. Для кальциевых токов L-типа do(V) увеличивается от 0 до 1 в диапазоне потенциалов от -40 до +10 мВ (Vo.s -15 мВ), с крутизной к 7мВ (Osaka and Joyner, 1991; Trautwein et al., 1975). Эти характеристики, однако, зависят от типа каналов и клеток. Например, в гладких мышцах подъем кривой активации лежит в диапазоне от -55 до -20 мВ (Friedman et al., 1986; Ganitkevich and Isenberg, 1990). Характерный вид активационной кривой показан на рис. 1 (сплошная линия).
Свойства перфорирующих соединений
В настоящее время для достижения электрического доступа (контакта) с внутренним содержимым клетки используют нистатин или амфотерицин В. Эти полиеновые антибиотики образуют селективные поры в холестерол- или эргостерол-содержащей мембране с радиусом Стокса-Энштейна порядка 0.4 нм (Holz and Finkelstein, 1970), которые в силу своих размеров оказываются проницаемы для воды, одновалентных катионов, некоторых анионов и небольших нейтральных молекул, например, глюкозы, но не проницаемы для таких мультивалентных ионов как Са2+ или Mg2+ (Korn et al., 1991). Измеренная в молярных солевых концентрациях, проводимость одиночного амфотерицинового канала вдвое выше чем нистатинового (Rae et al., 1991).
После образования контакта между пипеткой и мембраной антибиотик медленно диффундирует к кончику пипетки, где, соприкасаясь с мембраной, начинает встраиваться и формировать каналы.
Согласно модели, выдвинутой Финкельштейном и Хольцем в 1973 г., амфотерицин В образует канал, состоящий из двух стыкующихся внутри мембраны полупор, каждая из которых представляет собой агрегат из чередующихся молекул антибиотика и стерина (обычно эргостерина), ориентированных длинными осями своих молекул перпендикулярно поверхности мембраны; размеры этих молекул и обычного мембранного фосфолипида — лецитина — практически совпадают (Овчинников, 1987). В образовании полупоры принимают участие от 8 до 16 молекул антибиотика, располагающихся так, что гидрофильные части (гидроксилы) ориентированы внутрь поры, а гидрофобные (полиеновые) части— в сторону мембраны; полупоры собираются на противоположных сторонах мембраны и стабилизируются на ее поверхности полярными головками антибиотика, состоящими из заряженных
Обзор литературы группировок карбоксилат-иона и протонированного по аминогруппе остатка сахара (микозамина), а внутри мембраны— водородными связями между гидроксильными группами (Овчинников, 1987).
Есть основания полагать, что амфотерицин и нистатин препятствуют образованию контакта с мембраной (Horn, 1991), поэтому некоторые исследователи заполняют кончик пипетки не содержащим антибиотика раствором, а затем дозаполняют ее раствором с антибиотиком (Falke et al., 1989). Процесс заполнения кончика стеклянной пипетки может быть осуществлен простым опусканием в камерный раствор, возможно приложение всасывающего давления. Важно, чтобы раствор без антибиотика не заполнял пипетку более чем на 500 микрон от кончика; в противном случае время, необходимое для диффузии антибиотика до кончика будет чрезмерным.
Суммируя имеющиеся литературные данные можно сформулировать как ряд преимуществ, так и недостатков описываемого метода.
2.7.3 Преимущества методики перфорируемого пэтча
1) Каналы, сформированные нистатином или амфотерицином, непроницаемы для молекул больших чем глюкоза. Следовательно, регистрация от целой клетки может проводиться без диализа внутриклеточных компонентов из цитоплазмы. Самопроизвольное падение токов (run-down) или не наблюдается, или, по крайней мере, задержано. Физиологически необходимые каскады вторичных мессенжеров и механизмы важные для клеточной сигнализации и канальной регуляции остаются функционирующими.
2) Внутриклеточные многовалентные ионы не диффундируют в пипетку, так как каналы, образованные антибиотиками непроницаемы для этих ионов. Поэтому, например, внутриклеточный Са + может быть измерен при помощи оптических методов параллельно с регистрацией токов от целой клетки.
3) При использовании тщательно изготовленных пипеток и соответствующих соединений для заполняющего раствора методика перфорирования является менее разрушительной для клетки, чем внутриклеточные микроэлектроды или стандартное клямпирование от целой клетки. Проводить регистрацию от одиночной клетки данным методом можно в течение нескольких часов.
Обзор литературы 4) Сопротивление доступа перфорированного пэтча обычно значительно более стабильно, чем полученное при помощи стандартных методик (Korn et al., 1991).
5) Во многих случаях при использовании перфорированного пэтча можно легче скомпенсировать емкость клетки. Эквивалентная схема перфорированного пэтча лучше апроксимируется простой RC цепочкой, чем сопротивление доступа и емкость при стандартной регистрации от целой клетки (Rae et al., 1991).
2.7.4 Ограничения методики перфорированного пэтча
1) Метод перфорированного пэтча не позволяет диализировать клеточную цитоплазму и изменять ее состав, как это возможно при использовании других методов. По этой причине невозможно изучать действие некоторых соединений непосредственно на внутриклеточные механизмы.
2) Заполняющий пипетку раствор и клеточная цитоплазма находятся в Доннановском равновесии. Таким образом, пипетка должна содержать непроникающие анионы и концентрацию ионов хлора, соответствующую цитоплазматической. Нарушение может привести к потоку ионов хлора по градиенту концентрации. Последует выравнивание заряда катионов и воды, что приведет к изменениям клеточного объема. Вследствие низкой проницаемости по хлору антибиотических каналов по сравнению с их катионной проницаемостью, может потребоваться приблизительно 30 минут для достижения этого равновесия.
3) Процесс перфорирования требует значительно больше времени для достижения электрического контакта с клеткой.
Толерантность кардиомиоцитов к ионам Са2+
Статистический анализ полученных результатов сталкивается с определенными трудностями, поскольку как амплитудные, так и кинетические характеристики Са2+-токов сильно зависят от размеров и формы клетки, условий выделения и проведения эксперимента (время года, температура окружающей среды, атмосферное давление) и т.п. Одним из стандартных приемов, используемых в подобных случаях, является нормировка на амплитуду тока в контроле или на емкость клетки. Это позволяет исключить влияние таких параметров, как число каналов в клеточной мембране и размер клетки. Однако, часто этого оказывается недостаточно. Известно, например, что кардиоциты теплокровных могут сильно отличаться не только размерами, но и количеством Р-адренорецепторов, поэтому изменение амплитуды тока под действием изопротеренола, даже после упомянутой нормировки колеблется от 1.5 до 3 раз. Усреднение подобных данных, во-первых, может привести к "маскировке" реальной картины за счет больших значений стандартных ошибок, и во-вторых, все равно не дает достоверной количественной оценки полученных экспериментальных результатов, поскольку не учитывает их зависимости от всех существенных параметров. В связи с этим в данной работе приводятся, в основном, наиболее характерные результаты с указанием общего числа проведенных экспериментов (например, N = 8). При этом во всех экспериментах направления наблюдаемых эффектов совпадают. Таким образом, достоверность приводимых результатов определяется, в первую очередь, повторяемостью наблюдаемого эффекта, а сами результаты носят характер качественных или грубых количественных оценок.
Для определения кинетических и вольт-амперных характеристик токов использовалась аппроксимация экспериментальных данных известными функциями. Вольт-амперные характеристики приближались уравнением (2); при определении параметров активации и инактивации токов использовалась математическая модель, предложенная Алексеевым с соавторами (Alekseev et al., 1996). Более подробно данная модель описана в разделах 2.3 и 5.4. Одним из отличий алгоритма аппроксимации, использовавшегося в данной работе, от предложенного Алексеевым является то, что значения переменных активации и инактивации в начальный момент времени считались не предельными (0 или 1), а определялись уравнением Больцмана 1 для стационарных значений этих переменных при подстановке в него величины поддерживаемого потенциала (Маркевич et al., 2000; Кокоз et al., 2000). Кроме того, производилась аппроксимация не отдельных токовых трасс с последующим поиском параметров уравнения 1, а группы из 4-6 трасс, соответствующих одной вольт-амперной характеристике. Этот метод, в частности, позволяет более точное определение параметров Vo.5 и к за счет установления более жесткой зависимости между ними. Расчеты производились на ЭВМ класса 486 или Pentium при помощи программы DBSolve, разработанной Горяниным.
Изопротеренол (Iso) является одним из самых известных агонистов (3-адренорецепторов, активатором цАМФ-зависимого фосфорилирования и, соответственно, Са +-тока L-типа. Типичный пример увеличения тока в кардиоцитах крыс изопротеренолом показан на рис. 7а (поддерживаемый потенциал Vh = -50 мВ, тестовый потенциал V = 0 мВ). До сих пор считалось, что увеличение амплитуды тока является единственно возможным ответом Са2+-каналов на цАМФ-зависимое фосфорилирование. Однако, оказалось, что сдвиг поддерживаемого потенциала в сторону деполяризации приводит к смене знака эффекта на противоположный: при Vh = -30 мВ изопротеренол не увеличивает, а уменьшает амплитуду тока (рис. 76) (Kokoz et al., 1999). Реверсия эффекта изопротеренола при изменении поддерживаемого потенциала наблюдается во всем диапазоне использовавшихся тестовых потенциалов, что показано на вольт-амперных характеристиках, снятых при Vh = -50 и -30 мВ (рис. 7в и г соответственно).
Полученные данные позволяют предположить, что цАМФ-зависимое фосфорилирование делает каналы более активными (то есть, способными отвечать на деполяризующий стимул током большей амплитуды) при нормальном поддерживаемом потенциале и менее активными при потенциалах выше -30 мВ. Поскольку известно, что Iso сдвигает кривые активации и инактивации Са2+-тока в сторону отрицательных потенциалов (McDonald et al., 1994), логично предположить, что смена знака его действия связана именно с усилением инактивации при деполяризующих поддерживаемых потенциалах — увеличение активационной переменной при заданном потенциале могло бы привести только к росту амплитуды тока. Для проверки этого предположения была проведена серия экспериментов с использованием двухимпульсной стимуляции. При этом величина первого из двух деполяризующих стимулов изменялась от -50 мВ до +10 мВ, а его длительность составляла 2 секунды — время, за которое как активационная, так и инактивационная компоненты тока успевают выйти на стационарный уровень. Пауза между первым и вторым импульсами выбиралась таким образом, чтобы переменные активации и быстрой инактивации восстановились до значений, характерных для поддерживаемого потенциала. В то же время переменная медленной инактивации, постоянная времени которой на порядок больше, не успевает существенно измениться. Таким образом, зависимость амплитуды ответа клетки на второй деполяризующий стимул от величины первого должна повторять форму кривой медленной инактивации. Результаты одного из экспериментов показаны на рис. 8. При величине первого стимула до -30 мВ влияние инактивации сказывается слабо (значение переменной инактивации близко к 1, см. рис. 1) и происходит увеличение амплитуды тока. Это область классического эффекта Iso, объясняемого, в первую очередь, повышением максимальной проводимости канала и сдвигом активационной кривой. По мере увеличения первого стимула начинает проявляться влияние переменной медленной инактивации и рост тока выражен слабее. При величине стимула от -30 до -20 мВ наблюдается пересечение кривых— точка смены знака действия Iso. При потенциалах выше этой точки основной вклад в изменение амплитуды тока дает сдвиг инактивационнои кривой, что приводит к ее уменьшению (рис. 8а, врезка).
Независимость механизмов регуляции Са2+-токов изопротеренолом и BAY К
Анализ неравенств 12 совместно с полученными выше аналогичными выражениями для изопротеренола (10) показал, что (1) одновременное выполнение всех этих условий накладывает слишком жесткие ограничения на область допустимых значений параметров системы и (2) равновесие, по крайней мере, на одной из ветвей схемы 18 должно быть смещено в сторону фосфорилирования, то есть доля дефосфорилированных каналов Со 0.25, в то время как из приводимых в литературе данных следует, что число функционально неактивных каналов в контроле превышает 50% (Yue et al., 1990). Приходится допустить, что BAY, помимо сдвига равновесия реакции фосфорилирования центра X, способен непосредственно влиять на конформационный переход канала в активное состояние. На возможность прямого действия BAY указывают также данные о наличии быстрой фазы (сотни миллисекунд) в активации им Са +-тока, что не согласуется с медленным (порядка секунд) действием фосфорилирования (Hartzell et al., 1991). Кроме того, эксперименты на реконструированных каналах в липидном бислое показывают, что эффект BAY может проявляться и в отсутствие АТФ (Affolter and Coronado, 1985; Ehrlich et al., 1986). Тем не менее, гипотезу о связи BAY с фосфорилированием центра X отвергать нельзя, поскольку анализ спонтанного падения Са -токов (rundown) показывает, что данное соединение оказывает стабилизирующее воздействие на активность Са2+-каналов, наблюдаемое только в присутствии фосфорилирующих ферментов (Armstrong and Eckert, 1987). По мнению авторов, это является доказательством ингибирования фосфатаз Са2+-каналов.
Таким образом, объединяя приведенные факты можно предположить, что существует, по крайней мере, два пути действия BAY на активность Са -каналов L-типа: быстрый, связанный с прямым влиянием на конформационные переходы канала, и медленный, осуществляемый через ингибирование РР1. Возможно, именно изменение конформации канала делает центр X более или менее доступным для протеинкиназ и протеинфосфатаз. Следует отметить, что двухфазность действия характерна и для дигидропиридиновых антагонистов (нифедипин), механизм угнетения тока которыми пока также остается неясным (Hadley and Lederer, 1995).
Кинетические характеристики Са2+-тока L-типа в кардиоцитах крыс
Кинетические характеристики Са2+-токов L-типа часто несут существенно больше информации об изменениях, происходящих в клетке под действием тех или иных факторов, чем простое сравнение амплитуд токов в различных условиях. По этой причине особый интерес представляет анализ переменных активации и инактивации токов под действием изопротеренола, BAY К 8644 и других регуляторов.
При анализе использовалась математическая модель, предложенная Алексеевым с соавторами (Alekseev et al., 1996). Согласно этой модели, зависимость интегрального тока от времени описывается функцией: Ica=gCa(V-VCa)d2fs2fF, (13а) где gca— максимальная проводимость мембраны по кальцию; V— мембранный потенциал; Vca — потенциал реверсии; d — переменная активации Са -тока; fp и fs — переменные быстрой и медленной инактиваций соответственно. Зависимость d, fF и fs от времени определяется дифференциальными уравнениями: d = (d.-d)/Td (136) fs =( - )/ (13в) F = (fF. - fF)/% («Г) где индекс oo относится к стационарным значениям соответствующих переменных, а х — постоянные времени активации и инактиваций.
Решая уравнения 13б-г можно получить зависимость суммарного тока от времени в явном виде: Iea=8ca(V-vJ.{dм+(d0-dJ.e )} п{flЮ+(fi0-fJ.e(--.)}Г i=S,F (їзд) Здесь индекс 0 у переменных d, fF, fs относится к их значениям при поддерживаемом потенциале. Согласно модели Алексеева, суммарный ток нелинеен относительно d, fp, fs, что приводит к появлению параметров m = 2, IIF = 1 и ns = 2.
Приведенное выражение описывает Са -ток, усредненный по всем активным конформациям каналов в клеточной мембране. При рассмотрении двухцентровой модели канала более точным было бы описание, учитывающее наличие трех популяций каналов Сд, Сх и С АХ, то есть содержащее три слагаемых вида 13д, но имеющих различные параметры (проводимость, потенциал реверсии, стационарные значения переменных и постоянные времени). Однако, такой подход связан с определенными трудностями: большое количество параметров сильно затрудняет аппроксимацию экспериментальных данных и получение достоверных результатов. Поэтому в данной работе рассматриваются только усредненные характеристики тока и анализируются изменения параметров при воздействии различных факторов, сдвигающих равновесие реакций фосфорилирования. Это позволяет, по крайней мере, качественно оценить вклад каждого из состояний канала в интегральный Са +-ток.
Поиск кинетических характеристик Са +-тока L-типа производился минимизацией функции х = (Iexp - Itheor) на временном отрезке от 0 до 300 мс методом Нелдера-Мида. При этом учитывалось, что зависимость стационарных значений переменных d, fp, fs от потенциала описывается уравнением Болыдмана: = d, fF, fs Этой же зависимостью определялись значения параметров do, fFo, fso, входящих в выражение 13 д.
На рис. 20 показаны кривые активации и быстрой и медленной инактиваций, полученные в контроле и при последовательной аппликации Iso и BAY. Прежде всего, обращает на себя внимание поведение переменной медленной инактивации (рис. 20, fs). Iso и BAY резко уменьшают ее значения по сравнению с контролем при потенциалах выше -35 мВ. При этом как проводимость gca (значения приведены в подписях к рисункам), так и активационная составляющая увеличиваются во всем диапазоне тестовых потенциалов. Следовательно, уменьшение амплитуды тока под действием Iso и BAY при поддерживаемых потенциалах выше -30 мВ может происходить только за счет более сильной инактивации каналов в этих условиях. Этот важный вывод можно сформулировать иначе: деполяризация мембраны до Vh -30 мВ приводит к тому, что часть каналов инактивируется, теряя способность открываться в ответ на стимул. Под действием Iso и BAY доля инактивированных деполяризацией каналов оказывается существенно больше, чем в контроле, благодаря чему и наблюдается уменьшение амплитуды тока.
