Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Разделение дальних и ближних взаимодействий в расчетах энергетических профилей ионов 11
1.1. Трансмембранные каналы: классификация и функции 11
1.2. Теоретические методы расчета энергетических профилей ионов и необходимость использования квантовохимического расчёта 13
1.2.1. Традиционные методы расчета энергетического профиля иона в поре канала и его роль в объяснении проницаемости каналов
1.2.2. Артефактность методов силовых полей в расчетах энергетических профилей ионов в поре канала и необходимость использования квантовохимических расчетов
1.3. Физическое обоснование разделения дальних и ближних взаимодействий в расчетах энергетических профилей ионов 36
1.3.1. Представление молекулы канала в системе координат с поворотной осью симметрии
1.3.2. Формальная схема метода
1.3.3. Физическое обоснование метода
Глава 2. Механизмы ионной и водной избирательности природных трансмембранных каналов 46
2.1. Потенциал-независимый калиевый канал KcsA 46
2.1.1. Структура и традиционное объяснение ионной избирательности канала
2.1.2. Энергетические профили ионов и калиевая избирательность канала
2.2. Потенциал-зависимый калиевый канал KvAP 54
2.2.1. Структура и традиционное объяснение ионной избирательности канала
2.2.2. Энергетические профили ионов и калиевая избирательность канала
2.3. Аквапорин АР] 60
2.3.1. Структура и традиционное объяснение водной избирательности порина
2.3.2. Энергетические профили молекул воды и водная избирательность порина
Глава 3. Механизмы ионной и водной избирательности зеркальных изомеров природных транс мембранных каналов 67
3.1. Модельный D-изомер потенциал-независимого калиевого канала Kcs А 67
3.1.1. Структура канала D-KcsА
3.1.2. Энергетические профили ионов и ионная избирательность канала D-KcsA
3.2. Модельный D-изомер потенциал-зависимого калиевого канала KvAP 71
3.2.1. Структура канала D-KvAP
3.2.2. Энергетические профили ионов и функционирование канала D-KvAP
3.3. Аквапорин АР) 75
3.3.1. Структура порина D-APi
3.3.2. Водная избирательность порина D-APt
Выводы 78
Заключение 80
Список использованной литературы 83
- Теоретические методы расчета энергетических профилей ионов и необходимость использования квантовохимического расчёта
- Физическое обоснование разделения дальних и ближних взаимодействий в расчетах энергетических профилей ионов
- Потенциал-зависимый калиевый канал KvAP
- Модельный D-изомер потенциал-зависимого калиевого канала KvAP
Введение к работе
Фундаментальным свойством природной клетки является хиральная чистота ее основных молекулярных компонентов: ферментов и нуклеиновых кислот. На атомно-молекулярном уровне организации природной клетки данное свойство проявляется в том, что в нуклеиновых кислотах содержаться только D-изомеры Сахаров, в ферментах - только L-изомеры аминокислот. Такое нарушение зеркальной симметрии биологических молекул является, по выражению Г. Вейля [1], исключительной привилегией жизни.
В данном случае речь идет о нарушении геометрической зеркальной симметрии - отсутствии точки или плоскости инверсии в атомной модели молекулы. Молекула является зеркально симметричной относительно некоторой плоскости П, если она переходит сама в себя при отражении от плоскости 1, К зеркально-симметричным (хиральным) относятся молекулы, содержащие так называемый асимметрический атом углерода, — аминокислоты, сахара и т.д. Данные молекулы обладают свойством хиральности в том случае, если все четыре заместителя, связанные с центральным атомом углерода С*, различны. Зеркальные изомеры таких молекул обычно называют «левыми» и «правыми» изомерами. В биофизической литературе их обозначают буквами L (от laevo — левый) и D (от dextro - правый).
Если молекула имеет один асимметрический центр, то у нее существуют только два оптических изомера. Если же молекула содержит N асимметрических центров, то всего имеется 2N ее оптических изомеров, которые можно рассортировать на 2N"] различных изомерных пар. Такая ситуация характерна для молекулы сахара - пентозы, которая может содержать 4 асимметрических центра и, следовательно, возможно 24=16 изомеров пентозы или 8 различных пар соответствующих L- и D-изомеров.
Несмотря на огромное разнообразие хиральных соединений в природе, прежде всего, нас будут интересовать аминокислоты и сахара.
Аминокислотные остатки - главные компоненты белков, полипептидов и олигопептидов существуют в виде двух стереоизомеров или энантиомеров, известные под названием L- и D-изоформ. В этом случае существует некоторое отображение, переводящее каждый атом в его зеркальный образ относительно О. (рис. 1). Каждый аминокислотный остаток имеет инвариантную часть и, за исключением двух концевых остатков, связан с другими таким образом, что формируется непрерывная, неразветвленная цепь — основная цепь белковой молекулы. На одном конце цепи находится свободная NH2-группа (N-конец), на другом - СООН-группа (С-конец). К каждому а- или С*-углеродному атому основной цепи присоединены вариабельные части аминокислотных остатков - R-группы*. Стереоизомерия характерна для всех аминокислот, за исключением глицина.
Рис. 1. Зеркальные изомеры (L и D) аминокислот
Другие биомолекулы, в которых также может проявляться свойство стереоизомерии, это нуклеиновые кислоты — дезоксирибонуклеиновые (ДНК) и рибонуклеиновые (РНК) (рис. 2). Они построены из мономерных звеньев -нуклеотидов, которые состоят из трех частей: азотистого основания (N), моносахарида (сахара) и одной или нескольких фосфатных групп (Р). Сахар (пентоза), входящий в состав природного нуклеотида, может присутствовать " В белках, как правило, встречается 20 разных R-групп: фенилаланин - Phe (F), триптофан - Trp (W), тирозин — Туг (Y), метионин - Met (M), цистеин - Cys (С), лейцин - Leu (L), аланин - Ala (А), валин — Val (V), изолейцин -Не (1), пролин - Pro (Р), треонин — Thr (Т), серии - Ser (S), глутамин - Gin (Q), аспарагин - Asn (N), аспарагиновая кислота-Asp (DJ, глутаминовая кислота-Glu(E), гистидин-His (Н), аргинин- Arg(R), лизин-Lys (К), глицин -GIy(G). в одной из двух форм p-D-рибозы и p-D-дезоксирибозы. Первая форма сахара присутствует в мономерных звеньях РНК, вторая - в мономерных звеньях ДНК. Напомним, что L-изомеры Сахаров в мономерах природных РНК и ДНК не встречаются, хотя каждый из них вне биополимерной структуры может существовать и в L- и D-форме. Азотистые основания представляют собой производные одного из двух соединений — пурина или пиримидина**.
3' Рис. 3. Зеркальные изомеры нуклеотидов
Следует отметить, что в отличие от Сахаров (в РНК и ДНК) и аминокислот (в белках-ферментах) другие хиральные компоненты клетки могут встречаться как в одной, так и в другой изомерной форме. Например, в некоторых бактериях среди продуктов различных биохимических превращений обнаружены L-caxapa и D-аминокислоты. Поэтому в целом биологический мир не обнаруживает хиральной чистоты.
Биополимер, построенный из стереоизомеров строго определенного вида (L или D), принято называть гомохиральным; биополимер, построенный из смеси стереоизомеров - рацемическим или гетерохиральным. Физически идентифицировать принадлежность гомохиральной молекулы к тому или '" В нуклеиновых кислотах в основном присутствуют два пуриновых производных (аденин - А, гуанин - G) и три пиримидиновых основания (цитозин - С, тимин - T, урацил - U). В рибонуклеотидах используются основаниия A, G, С, и U, в дезоксирибонуклеотидах - A, G, С и Т.
7 иному изомеру возможно только по направлению вращения плоскости поляризации проходящего через них света: L-изомер вращает плоскость поляризации влево, D-изомер — вправо. Все остальные физические свойства изомеров практически эквивалентны. Одинаковы внутренние энергии, растворимости, температуры плавления, кипения и т.д.
Впервые нарушение зеркальной симметрии наблюдал Л. Пастер [2]. В 1848 г. он открыл, что виноградная кислота в результате кристаллизации превращается в смесь L- и D-изомеров кристаллов винной кислоты. Кислота, получающаяся из D-кристаллов, совпадает с винной кислотой, образующейся при брожении виноградного сока; кислота, получающаяся из L-кристаллов, не наблюдается в природе. Это явление Пастер объяснил тем, что на рацемический раствор действовали бактерии, содержащиеся в атмосфере и способствующие производству гомохирального раствора.
В настоящее время установлено, что он заблуждался: строгое физическое объяснение состоит в том, что при низкой температуре смесь двух оптически активных форм винной кислоты более устойчива, чем ее неактивная форма. С того времени специалистами самых различных областей науки опубликовано огромное количество работ, посвященных проблеме нарушения зеркальной симметрии (см. обзоры [3, 4, 5]). Тем не менее окончательное решение проблемы далеко до своего завершения.
Последние работы, прежде всего, посвящены поиску физико-химических механизмов и возможных сценариев нарушения зеркальной симметрии (факторы преимущества, спонтанное нарушение зеркальной симметрии), последствиям загрязнения организма «неприродными» изомерами [6] и взаимодействию хиральных лекарств с организмом [7].
Рассматривая общие структурные особенности природной клетки, целесообразно выделить два аспекта.
Первый связан с гомохиральностью биополимеров, участвующих в матричном синтезе белков и нуклеиновых кислот. Данный синтез происходит с участием различных гомохиральных ферментов, ДНК, различных РНК, что обусловлено их взаимной стереоспецифичностьго. Последняя достигается тем, что аминокислоты ферментов и нуклеиновые кислоты ДНК и РНК имеют исключительно разный знак хиральности. Белки-ферменты, рецепторы, переносчики, шапероны также утратят свою уникальную пространственную конфигурацию, необходимую для специфического комплементарного узнавания своих субстратов и лигандов.
Второй аспект связан с тем, что все гомохиральные белки-ферменты построены исключительно из L-изомеров аминокислотных остатков, нуклео-тиды ДНК и РНК построены исключительно из D-изомеров Сахаров.
Физико-химические и биологические предпосылки гомохиральности биополимеров в последнее время изучены достаточно хорошо [3, 4, 5]: гомо- хиральность белков и нуклеиновых кислот обуславливает стабильность их структур, обеспечивающих их функционирование, и, кроме того, для биохи мических преобразований гомохиральных соединений требуется гораздо меньший набор ферментов, чем для таких же преобразований гетерохираль- ньіх соединений. Напротив, физико-химическое и биологическое значение гомохиральных белков-ферментов и нуклеиновых кислот определенного зна ка хиральности остается пока малоизвестным. В этом случае центральным вопросом является вопрос о случайности или определенности выбора белко вых L-аминокислот в процессе биологической или предбиологической эво- Ц люции [5].
Получить частичный ответ на этот вопрос, и является целью нашей работы, для достижения которой были сформулированы следующие задачи: построить модельные D-изомеры белков - трансмембранных каналов; исследовать их атомную геометрию, а также абсолютные значения и изменения полной энергии в сравнении с аналогичными параметрами природных каналов;
3) исследовать их проницаемость для ионов и молекул.
Очевидно, что при построении модельных изомеров природных белков, практически невозможно исследовать всего их многообразия. Поэтому в нашей работе мы ограничились исследованием 3-х трансмембранных каналов: потенциал-независимого бактериального калиевого канала KcsA, потенциал-зависимого калиевого канала KvAP и аквапорина АР^
Данный выбор является неслучайным по нескольким причинам: трансмембранные каналы играют основополагающую роль в таких важнейших физиологических процессах как преобразование энергии, поддержание постоянного химического состава внутренней среды (гомеостаз), регуляция и рецепция, сокращение мышц, распространение нервного импульса и др. [8]; выше названные каналы являются экспериментально наиболее изученными из природных каналов [9], поэтому все изменения структурно-зависимых свойств канала, при точечной рацемизации всех его аминокислотных остатков, удобно сопоставлять с аналогичными свойствами природного канала; суперсемейство трансмембранных каналов участвует в формировании важных биологических процессов [10], поэтому представляется возможным исследование влияния точечной рацемизации полного набора аминокислотных остатков мембранных каналов на нарушение его биологических функций; ионные каналы, в том числе KcsA или KvAP, участвуют в формировании ионной асимметрии (трансмембранного потенциала) клетки, которая непосредственно связана с хиральной чистотой клеточных структур [11].
За исключением работ, посвященных исследованию взаимодействия различных изомеров биологически активных соединений (см. обзор [7]), практически отсутствуют публикации по структурным аспектам проблемы биологического значения гомохиральности биомолекул определенного знака.
Наша работа является одной из первых попыток исследования структурно-функциональных особенностей зеркальных изомеров трансмембранных каналов.
Перед построением модельных изомеров нами объяснена ионная избирательность калиевых каналов и аквапорина сравнением энергетических профилей ионов в поре канала и молекул воды в поре аквапорина. Подробности предложенного нами метода расчета профилей энергии представлены в главе 1. Механизмы ионной избирательности калиевых каналов и водной проницаемости аквапорина представлены в главе 2. Построенные модели зеркальных изомеров природных каналов, их структура и проницаемость представлены в 3 главе.
Теоретические методы расчета энергетических профилей ионов и необходимость использования квантовохимического расчёта
Все существующие методы описания ионного транспорта в трансмембранных каналах можно свести к двум основным группам методов [13, 14, 15, 16]: макроскопическим и корпускулярно-механическим методам.
В макроскопическом подходе используются электродиффузионные уравнения и химико-термодинамические представления (теория переходного состояния). Основой электродиффузионного метода является приближение непрерывно распределенного заряда канала, мембраны и ионов объемной воды. Движение ионов в полости белковой молекулы формально описывается уравнениями диффузии, например, трехмерным стационарным уравнением Пуассона-Нернста-Планка [17]:
Здесь Di(R) - коэффициент диффузии, fi=l/kT, c R) - концентрация z -x ионов, как функция положения R, Vj(R) - потенциальная энергия, представляемая в виде суммы электростатической и неэлектростатической компоненты, т.е. где U(R) - неэлектростатическая потенциальная энергия, zte — заряд иона, R) - электростатический потенциал. Электростатический потенциал является решением уравнения Пуассона в котором e(R) — диэлектрическая постоянная, p/R) — плотность фиксированных зарядов (белковой молекулы, мембраны, ионов объемной воды). Использование энергии неэлектростатических взаимодействий [18, 19] позволяет избежать "прилипания" разноименно заряженных частиц, например, положительно заряженных ионов и отрицательно заряженной полости белковой молекулы или разноименно заряженных ионов. Решением уравнения (1) является зависимость d=Ci(R) (распределение концентрации), которая дает возможность оценить ионные токи через порообразующие белковые молекулы, а следовательно, и вольтамперные характеристики белков, которые могут сопоставляться с экспериментальными данными. Калибровкой диэлектрической постоянной e(R) добиваются согласия полученных данных с экспериментальными вольтамперными характеристиками каналов. Метод Пуассона-Нернста-Планка применялся для моделирования ионной проводимости и ее сравнения с экспериментальными данными грамицидинового [20, 21], калиевого [22] и кальциевого [23] каналов. Для канала ацетилхолинового рецептора авторами [24] получено аналитическое решение уравнения Пуассона с граничными условиями Дирихле.
Кинетическую теорию переходного состояния Эйринга успешно применяют для анализа работы ионных каналов и других транспортных систем [25, 26, 27, 28, 29]. В основе этого подхода лежит предположение о том, что система может находится только в нескольких дискретных состояниях. При этом взаимные переходы между двумя состояниями сопряжены переходом системы через промежуточные стадии с более высокой свободной энергией, и константы скоростей переходов зависят от высоты соответствующих энергетических барьеров. Минимумы на кривых изменения свободной энергии соответствуют местам связывания ионов. Рассмотрим применение данного метода для случая, когда имеется одно место связывания и трансмембранное напряжение равно нулю. Тогда такую «реакцию» формально можно представить в виде канальный белок в «открытом» состоянии, 5 ,- и So - транспортируемый ион внутри и снаружи, ES- комплекс иона с местом связывания внутри канала. Зная характер изменения свободной энергии (число ям, барьеров и их локализация), можно установить соответствие между этими профилями и вольтамперными характеристиками ионных каналов, т.е. исходным в данном методе является распределение свободной энергии или, при определенных условиях, потенциала в ионном канале. Кинетическая теория переходного состояния Эйринга применялась для исследования механизмов ионной селективности белковых пор [30], механизма функционирования синтетического гидрофобного ионного канала [31], фторированного грамицидинового канала [32], натриевого канала [33] и cNG-канала [34].
В корпускулярно-механическом методе описания ионного транспорта рассматривается траектория движения отдельного иона в поле белковой поры, для которого записывается одно из динамических уравнений: уравнение Ньютона или уравнение Ланжевена. Уравнение Ньютона составляет основу метода молекулярной динамики [35]. Функция потенциальной энергии иона V(=Vi(R) должна быть записана для каждого иона и, по необходимости, должна учитывать взаимодействие иона с атомами белковой молекулы, молекул фосфолипидов и воды, другими ионами. Если необходимо рассматривать динамику атомных групп белковой молекулы [36], то дополнительно учитываются взаимодействия между атомами белковой поры, что приводит к значительному увеличению числа уравнений (4).
Альтернативной схемой молекулярной динамики является ланжевенова динамика [37] или ее модификация [38], в основу которой положено уравнение Ланжевена Здесь yi - коэффициент трения, FR(t) - случайная сила, которая характеризует беспорядочные взаимодействия (столкновения) молекул растворителя с ионом. Добавление данных параметров дает возможность учитывать в неявном виде присутствие растворителя (воды) и тем самым существенно снижать количество уравнений (4). Функция потенциальной энергии Vj=Vj(R) в уравнениях (4) и (5) для ковалентно несвязанных частиц (атомов, ионов) определяется в виде суммы кулоновской и вандерваальсовой составляющих
Использование энергии UVDW(R), также как в электродиффузионном методе, позволяет избежать "прилипания" разноименно заряженных частиц, например, положительно заряженных ионов и отрицательно заряженной полости белковой молекулы или разноименно заряженных ионов. Решениями уравнений (4) и (5) являются зависимости R=R(t) для каждого иона, которые дают возможность оценить ионные токи через пор о образующие белковые молекулы и вольтамперные характеристики белков, которые могут сопоставляться с экспериментальными данными. Корпускулярно-механический метод применялся для модельного исследования ионной проводимости и сравнения с экспериментальными данными для калиевого канала [39, 40], модельного канала [41, 42, 43], натриевого канала [44], аламетицинового канала [45], а также для исследования движения молекул воды в грамицидиновом канале [46].
Физическое обоснование разделения дальних и ближних взаимодействий в расчетах энергетических профилей ионов
Знание атомных моделей мембранных каналов необходимо для деталь ного исследования ионного транспорта через биологические мембраны. Это- го требуют практически все традиционные теоретические методы исследова- ния движения ионов в каналах: молекулярная динамика, электродиффузионная теория, теория переходного состояния Эйринга. Атомная структура канала определяет профиль потенциальной энергии ионов в его поре. При этом, если рассматривать ионные каналы, имеющие поворотную ось симметрии любого порядка Сп [97, 98], наибольший интерес представляет профиль энергии ионов вдоль данной оси. Группой поворотной симметрии обладают практически все представители суперсемейства потенциал-зависимых Na+, К+ и Са2+-каналов [8]. Тем самым, выше сказанное определяет необходимость представления атомной структуры аксиально-симметричных ионных каналов в системе координат с осью поворотной симметрии Сп для последующего расчета энерге- тического профиля и моделирования ионного транспорта в каналах. Учитывая, что большинство мембранных каналов приводимых в Банке белковых структур представлены в произвольной системе координат, особый интерес представляет определение значений атомных координат в системе координат с поворотной осью симметрии. Получить формулы данных преобразований и является целью нашей работы.
Назовем систему координат, в которой заданы атомные координаты каналов из Банка белковых структур, лабораторной системой координат (XYZ-система); систему координат, одна из осей которых, например Z-ось, совпадает с осью поворотной симметрии С„ канала, -естественной системой координат (X Y Z -система). При этом ось С„ проходит через две точки с заданными координатами в XYZ-системе: О (х0, уо, z0) и А (Х, уь Z]) (рис. 2). В некоторых случаях это могут быть координаты ионов, локализованных в поре канала. С учетом введенных выше определений, задача состоит в том, чтобы записать координаты атомов канала в естественной системе координат. Фор Матричное равенство (31) с выше определенными коэффициентами матрицы А задает преобразование координат атомов канала из лабораторной в естественную систему координат, ось которой совпадает с осью поворотной симметрии канала. Другим способом расчета энергетического профиля является квантово-химический расчет, который требует для белков значительных затрат расчетного времени. Поэтому представляется целесообразным предложить расчетный метод, не требующий значительных затрат машинного времени и сохраняющий достоинства квантовохимического расчета. Данный метод может быть получен, если учесть, что специфические квантовомеханические эффекты, возникающие при расчете взаимодействия иона и канала существенны лишь на небольших расстояниях (на расстояниях, где значимо перекрывание электронных оболочек иона и атомов канала) [99, 100].
В связи с этим можно предложить представление результирующей потенциальной энергии иона Е в виде суммы квантовомеханической состав- ляющей Еь существенной при небольших расстояниях ион - атомы канала, и классической составляющей Е2, существенной при больших расстояниях ион - атомы канала. Энергию Ei целесообразно рассчитывать одним из квантово-химических методов для системы ион - ближние к нему аминокислоты, энергию Е2 рассчитывать в приближении точечных зарядов на атомах q; дальних N аминокислот по традиционной кулоновской схеме Е2 = ХЧІЛІ Причем в ка- честве зарядов на атомах q; можно использовать параметры электростатических взаимодействий одного из силовых полей или точечные заряды на атомах, рассчитанные квантовохимически.
Потенциал-зависимый калиевый канал KvAP
Все представители семейства потенциал-зависимых ионных каналов содержат шесть гидрофобных а-спиральных сегментов (SI - S6) в каждой субъединице [8, 106, 107]. При этом четыре субъединицы К+-канала окружают центральную пору, проводящую исключительно ионы калия. Сегменты S5 - S6 стабилизируют пору и определяют, согласно традиционным представлениям, калиевую избирательность в селективном фильтре, сегменты S1 - S4 формируют сенсор (см. рис. 1), ответственный за открывание и закрывание канала.
В работах [108, 109, ПО] была определена атомная структура калиевого канала и дан гипотетический ответ на вопрос: каким образом трансмембранный потенциал открывает пору ионного канала. Так потенциал-зависимый калиевый канал, в зависимости от направления трансмембранного потенциала, определяющего положение сенсора в пространстве, может находиться в двух конформациях: открытой - пропускающей ионы, и закрытой -не пропускающей ионы (см. рис. 11). При изменении направления трансмембранного потенциала, достаточно лабильный сенсор канала занимает новое положение, что приводит к переходу канала из открытого состояния в закрытое состояние и наоборот.
Предложенная модель, объясняющая переход канала из одного состояния в другое, не дает ответа на вопрос о механизмах исключительно калиевой избирательности открытого канала и отсутствия таковой для закрытого ионного канала. Координаты атомов потенциал-зависимого калиевого канала из Аегору-rum ретїх в открытом состоянии брали из Банка белковых структур (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, USA). Для получения закрытого состояния данного канала изменяли положение сенсора согласно данным работы [108].
Объяснение ионной избирательности проводили по результатам сравнительного анализа профилей потенциальной энергии взаимодействия ионов Li+, Na+, К+ со всеми атомными группами канала в открытом и закрытом состоянии. Очевидно, что в рамках такого подхода объяснить калиевую избирательность можно совпадением значения энергии дегидратации и глубины потенциальной ямы иона К+ (энергии взаимодействия иона с каналом достаточно для дегидратации иона), локализованной в области селективного фильтра канала, а также отсутствием непроницаемого энергетического барьера на пути движения иона.
Для получения профилей энергии ионов в канале, нами проведено разделение и независимый расчет энергий дальних и ближних взаимодействий иона с атомными группами канала. Физическое обоснование такого разделения представлено в работе [111]. В рамках такого подхода, можно разделить результирующую энергию взаимодействия иона с атомными группами канала на две аддитивные составляющие: Ei - энергия при малых расстояниях ион - атомы канала и Е2 — энергия при больших расстояниях ион — атомы канала.
Энергию Е] рассчитывали расширенным квантовохимическим методом Хюккеля в параметризации Вольфсберга-Гельмгольца, Е2 - методом силового поля AMBER, заряды на атомах аминокислот которого совпадают с зарядами, рассчитанными неэмпирическим квантовохимическим методом. Несмотря на формальную простоту метода Хюккеля, он является вполне обоснованным для молекулярных систем, разность электроотрицательностей атомов Дх которых не превышает 1.5 по шкале Полинга. Максимальное значение Д% для атомов исследуемого канала составляет 1.5, для несвязанных ковалентными связями катионов и карбонильных кислородов, формирующих пору канала, это значение 1.5 (для Li+). Следовательно, применение расширенного метода Хюккеля для решения поставленных задач является вполне обоснованным.
Результирующий профиль энергии иона в канале Е = E(Z) представлялся в виде суммы Ei(Z) + E2(Z), где Z - координата оси аксиальной симметрии канала. Учитывая, что внутри поры канала эффективную диэлектрическую проницаемость ее в настоящее время экспериментально установить практически невозможно, все предварительные расчеты проводили для e f- 1 с последующим уточнением данного параметра.
Результирующие профили Е = E(Z) для открытого и закрытого канала представлены на рисунках 12 и 13 соответственно. Различаются они в области селективного фильтра — наиболее узкой области поры канала. Наиболее глубокая потенциальная яма в области селективного фильтра и наиболее низкий потенциальный барьер в области нижней поры соответствуют иону калия, что может быть основой для объяснения ионной избирательности канала. Совпадение профилей наблюдается в области центральной полости -наиболее широкой области поры канала.
Модельный D-изомер потенциал-зависимого калиевого канала KvAP
Проблема построения стабильной конфигурации модельного D-изомера канала в данном случае сводится к проблеме «снятия стерического напряжения» в атомной структуре канала, обусловленного точечной рацемизацией всех его аминокислот. Снятие стерического напряжения в модельном канале проводили путем оптимизации его геометрии - минимизацией функции потенциальной энергии молекулы. При построении функции потенциальной энергии молекулы использовали силовое поле AMBER. Структура модельного D-изомера канала KvAP в открытом (D-KvAP0) и закрытом (D-KvAPc) состоянии представлены на рисунке 19. Абсолютное значение разности полных энергий двух конформаций канала D-KvAP составляет 2086 ккал/моль.
Результирующие профили E=E(Z) для открытого (D-KvAP0) и закрытого (D-KvAPc) канала представлены на рисунках 20 и 21 соответственно. Раз- личаются они в области селективного фильтра — наиболее узкой области поры канала. Наиболее глубокая потенциальная яма в области селективного фильтра и наиболее низкий потенциальный барьер в области нижней поры соответствуют иону калия. Совпадение профилей наблюдается в области центральной полости - наиболее широкой области поры канала.
Сравнительный анализ Е = E(Z) для различных ионов канала D-KvAP0 и D-KvAPc позволяет объяснить отсутствие калиевой избирательности каналов. Минимум потенциальной энергии иона калия в области селективного фильтра равен -85 ккал/моль. С учетом эффективной константы диэлектрической проницаемости среды, моделирующей область селективного фильтра и принимающей значение равное 2.5, значение данного минимума равно -35 ккал/моль. Последнее значение значительно меньше, чем значение (с противоположным знаком) экспериментальной энергии дегидратации данного иона. Тем самым энергии взаимодействия иона калия с каналом не достаточно для компенсации энергии его дегидратации при входе в канал. Для ионов лития и натрия данные условия не выполняется, что отражено в таблице 7. Данные результаты указывают на отсутствие проницаемости для всех исследуемых ионов.
Существуют и другие данные, свидетельствующие о нарушении нормального механизма работы калиевого канала. Это разность энергий между открытой и закрытой конформацией канала, которая составляет значительную величину - 87 ккал/моль.
Рассмотрим некоторые биологические следствия точечной рацемизации полного набора аминокислот калиевых каналов. Потенциал действия в большинстве клеток возникает за счет кратковременного возрастания натриевой проводимости, которое стремится привести мембранный потенциал к уровню натриевого равновесного потенциала и за которым следует увеличение калиевой проводимости, возвращающее мембрану в состояние покоя. Возрастание проводимостей возникает благодаря потенциал-зависимости натриевых и калиевых каналов: вероятность их открытия возрастает при деполяризации. При деполяризации мембраны натриевая проводимость сначала быстро активируется, а затем инактивируется. Калиевая проводимость активируется с задержкой и остается на высоком уровне до тех пор, пока не кончится деполяризация.
На сегодняшний день все установленные калиевые каналы формируют единое суперсемейство. Например, потенциал-зависимый калиевый канал KvAP структурно отличается от канала KcsA лишь наличием сенсоров — особых а-спиралей канала, конформационная подвижность которых, определяет открытое и закрытое состояние канала. Поэтому дальнейшие рассуждения относительно канала KcsA не теряют своей общности.
В нейронах существует целый ряд различных типов калиевых каналов, некоторые из которых принимают участие в реполяризации мембраны. Один из таких каналов — А-канал, быстро активируемый в результате деполяризации. Два других типа потенциал-зависимых каналов - М-канал и S-канал -открываются в ответ на деполяризацию. Кальций-активируемые калиевые каналы также могут вносить вклад в реполяризацию. Существует также тип калиевых каналов, активируемых внутриклеточным натрием. В некоторых клетках активация таких каналов может вносить вклад в реполяризацию в ходе потенциала действия.
Обобщая вышесказанное можно утверждать, что калий-избирательные ионные каналы вносят существенный вклад в реполяризацию мембран — необходимый этап распространения нервного импульса. Поэтому при прочих равных условиях нервные клетки с инкрустированными D-KcsA и D-KvAP каналами не способны принимать участие в генерации и распространении нервного импульса. Кроме того, данные модельные каналы являются термодинамически менее стабильными, чем природный калиевый канал. Следует отметить, что данный результат согласуется с ранними теоретическими расчетами [3, 4, 5], в которых было показано, что энергия основного состояния L-аминокислот и D-сахаров оказалась ниже, чем энергия их зеркальных изомеров.
Вероятно это две причины, так называемые биологическая и структурная, по которым данные модельные конфигурации природного калиевого канала не присутствуют в живых клетках. Следует отметить и другой аспект, связанный с нарушением работы D-KcsA и D-KvAP каналов. Это «каналопатологии» - заболевания, связанные с нарушением функционирования ионных каналов. Например, некоторые иммунные заболевания, такие как злокачественная миастения, возникают в результате выработке специфических антител против канальных белков.
