Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы. основные сенсоры воспалительных реакций и реакций врожденного иммунитета 8
3.1 TOLL-подобные рецепторы. 9
3.1.1 Структура 9
3.1.2 Лиганды TLR 10
3.1.3 Экспрессия TLR и чувствительность к стимуляции лигандами TLR различных субпопуляций мышиных В-клеток . 14
3.1.4 Клеточные мишени стимуляции TLR в человеческих В-клетках 16
3.1.5 TLR-индуцированная секреция цитокинов В-лимфоцитами. 16
3.1.5 Влияние на дифференцировку Т-клеток посредством TLR активации в антиген-презентирующих клетках (APC). 17
3.1.6 Прямая активация TLR в CD4+ T-эффекторных клетках индуцирует констимуляцию 19
3.1.7Влияние направленной TLR-активации на регуляционные T-клетки (Treg). 21
3.1.8 Адъювантная активность 22
3.2 БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА NLR. 24
3.3 БЕЛОК YB-1 35
3.3.1 Структура белка YB-1 35
3.3.2 Участие белка YB-1 в воспалительных заболеваниях 37
3.3.3 Участие белка YB-1 в онкогенезе 39
4. Методическая часть. 41
4.1 Реактивы и реагенты 41
4.2 Среды и растворы 43
4.3 Cтруктура праймеров 43
4.4 Штаммы E. coli и клеточные линии 44
4.5 Методика тестирования адъювантной активности RN-пептида 44
4.6 Выделение мононуклеарных клеток. 45
4.7 Измерение продукции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека 45
4.8 Выделение РНП 46
4.9 Выделение полисом, синтезирующих белки с высоким сродством к RN-пептиду. 46
4.10 Синтез КДНК 47
4.11 Амплификация ДНК 47
4.12 Рестрикция кДНК и лигирование с вектором 48
4.13 Лигирование 48
4.15 Получение электрокомпетентных клеток E. coli 48
4.16 Электропорация 49
4.17 Первичный анализ библиотеки методом скрининга на чашках 49
4.18 Выделение плазмиды 50
4.19 Рестрикция 51
4.20 Получение одноцепочечных Fv фрагментов антител (scFv) против YB-1 51
4.21 Определение Kd 52
4.22 Конкурентный анализ связывания RN-пептида и ГМДП с YB-1 52
4.23 Western блот 53
4.24 Выделение РНК с помощью Тrizol 53
4.25 Измерение уровня экспрессии NF-KB2. 54
4.26 Получение поликлональных антител против NOD2. 54
4.27 Получение мышиных моноклональных антител к белку YB-1. 55
4.28 Подготовка дендритных клеток костного мозга. 56
4.29 Определение внутриклеточной локализации YB-1 и NOD2. 56
5. Результаты и обсуждениe 58
5.1 Определение структур RN-пептида, необходимых для проявления биологической активности с помощью укороченных вариантов RN-пептида 61
5.2 Данные Ala-scan и проверка адъювантной активности 62
5.3 Анализ адъювантной активности RN-пептида 66
5.4 Индукция секреции лимфокинов лимфоцитами периферической крови человека RN-пептидом и ГМДП в разных концентрациях 67
5.5 Поиск белка, взаимодействующего с ГМДП 69
5.6 Данные анализа первичной структуры. 73
5.7 Определение Kd комплекса RN-пептида с белком YB-1 и проведение конкурентного анализа 76
5.8 Изменение уровня экспрессии белков NFkB1, NFkB2 и NOD2 в ответ на добавление RN-пептида, ГМДП и YB-1 в культуральную среду 82
5.9 Анализ внутриклеточной локализации ГМДП, YB-1 и NOD2 84
6. Выводы: 88
7. Список литературы 89
- Экспрессия TLR и чувствительность к стимуляции лигандами TLR различных субпопуляций мышиных В-клеток
- Методика тестирования адъювантной активности RN-пептида
- Первичный анализ библиотеки методом скрининга на чашках
- Определение Kd комплекса RN-пептида с белком YB-1 и проведение конкурентного анализа
Введение к работе
Актуальность проблемы. Поиск новых регуляторов иммунной системы (активаторов) и особенно с адъювантной активностью является предметом исследования как представителей фундаментальной науки, чьи интересы лежат в области изучения процессов, связанных с развитием иммунных реакций, в том числе механизмов дифференцировки клеток иммунной системы, так и практических специалистов по вакцинам и аутоиммунным нарушениям. Это направление стало особенно актуальным в связи с созданием нового поколения вакцин, в которых используются не инактивированные бактериальные клетки или вирусные частицы, а полученные методами химического синтеза или молекулярной биотехнологии фрагменты антигенов, узнавание которых иммунной системой хозяина позволяет защитить организм от инфекции и при этом имеет минимальные побочные реакции. Как правило, такие вакцины слабо иммуногенны и требуются молекулы-помощники способные усилить и направить иммунный ответ. Это относится и к ДНК вакцинам.
Необходимо отметить, что в современном понимании адъюванты - это не только соединения, активирующие гуморальный - антительный иммунный ответ, но и вещества, регулирующие клеточный иммунитет, способствуя созданию и возможности реализации пролонгированного ответа на антиген. Такой ответ невозможен без участия Т- и В- клеток памяти [Audibert et al., 2003]. Существующие в настоящее время адъюванты имеют значительные ограничения и недостатки, делающие необходимым поиск новых препаратов направленного действия с минимумом побочных реакций. Такими адъювантами, на наш взгляд, могут быть природные соединения - активаторы дендритных клеток, либо их аналоги, получаемые не только методом перебора структур известных соединений, часто и успешно используемого ранее, но и современными методами включающими поиски миметиков с помощью комбинаторной химии. Во многих лабораториях мира в качестве активаторов неспецифического иммунитета, иммунокорректоров и адъювантных препаратов активно исследуются фрагменты пептидогликана клеточной стенки бактерий и синтетические аналоги этих фрагментов [Cipriano et al., 2003, Steiner, 2004]. В лаборатории иммунохимии ИБХ РАН были получены высокоспецифичные и высоко аффинные моноклональные антитела к ГМДП. Было показано, что один из типов рецепторов ГМДП имеет внутриклеточную локализацию [Golovina et al., 1999]. Используя моноклональные антитела против ГМДП и технику
пептидного фагового дисплея, в нашей лаборатории был найден 15-мерный пептид миметик-ГМДП [Ламан и др., 2007]. Пентадекапептид RVPPRYHAKISPMVN (RN-пептид) взаимодействует с моноклональными антителами Е6/1.2 против ГМДП и обладает адъювантной, но не пирогенной активностью, в отличие от ГМДП. Он также увеличивает экспрессию антигенов гистосовместимости II класса на поверхности макрофагов. Весьма часто миметики соединений оказываются более узко специфичными и более активными, чем исходное соединение [Monzavi-Karbashi et al., 2002].
Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлся поиск молекулярной мишени ГМДП с использованием его пептидного миметика RN-пептида. Для того чтобы достичь поставленной цели, необходимо было решить следующие задачи:
-
Проанализировать функционально важные аминокислотные остатки пептидного миметика ГМДП (RN-пептида).
-
Провести анализ адъювантной активности RN-пептида.
-
Исследовать спектр лимфокинов, индуцируемых RN-пептидом по сравнению с ГМДП.
-
Клонировать белок, взаимодействующий с RN-пептидом.
-
Получить антитела против белка, взаимодействующего с RN-пептидом для характеристики связывания.
-
Определить Kd комплекса RN-пептида с данным белком и провести конкурентный анализ с целью исследовать взаимодействие RN-пептида и ГМДП с одним и тем же белком и одним и тем же участком белка.
Научная новизна работы. Впервые были проанализированы функционально важные аминокислотные остатки пептидного миметика ГМДП (RN-пептида). Впервые было показано, что спектр лимфокинов, индуцируемых RN-пептидом и ГМДП в целом совпадает, но несколько отличается, как отличаются их адъювантные и пирогенные свойства. Впервые был клонирован белок, взаимодействующий с RN-пептидом. В результате анализа первичной структуры клонированного белка была показана его идентичность белку YB-1 позвоночных. Было также показано, что ГМДП и RN-пептид конкурируют за связывание с одним и тем же участком белка YB-1. Впервые к белку YB-1 получены рекомбинантные антитела с использованием библиотеки scFv человека и мышиные моноклональные антитела. Впервые была показана колокализация ГМДП, NOD2 и YB-1 в одном компартменте клетки, что
позволяет сделать вывод о том, что белок YB-1 является молекулярной мишенью ГМДП и его пептидного миметика RN-пептида.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 2009); VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013 г).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 2 в сборниках тезисов научных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 110 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка литературы. Диссертация содержит 25 рисунков и 3 таблицы
Экспрессия TLR и чувствительность к стимуляции лигандами TLR различных субпопуляций мышиных В-клеток
TLR4 необходим для ответов на LPS, главных компонентов наружной мембраны грамотрицательных бактерий. LPS являются сильнодействующими иммуностимулирующими молекулами и вызывают септический шок. TLR4 прочно ассоциирован с MD-2 на поверхности клетки. Такой комплекс необходим для индукции секреции воспалительных цитокинов [22]. В ответ на LPS вовлечен также и LPS-связывающий белок (LBP) и CD14. LBP представляет собой растворимый белок или белок плазмалеммы, связывающий LPS. СD14 – гликозилфосфатидилинозитол-связывающий белок, содержащий LRR и связывающийся с LBP. Он доставляет комплекс LPS-LBP к TLR4-MD-2 комплексу [22].
TLR2 узнает большое разнообразие PAMP, являющихся составными частями различных патогенов бактерий, грибов, простейших и вирусов [23]. Такими лигандами являются триациллипопептиды бактерий и микобактерий, диациллипопептиды микоплазм, пептидогликаны (PGN) и липотейховая кислота грамоположительных бактерий, порин из Nesseria, липоарабидоманнан микобактерий, зимозан (содержащий -глюкан, маннаны, хитин, жиры и белки) грибов, GPI-муцин Trypanosoma (tGPI-mucin) и гемаглютинин вируса кори. TLR2 обычно образует гетеродимер с TLR1, TLR6, либо не относящимися к TLR молекулами, такими как CD36, CD14 и дектин-1, для распознавания молекулярных структур лигандов. TLR2LR6 распознает диацилированные липопептиды, LTA и зимозан. Комплекс TLR2LR1 узнает бактериальные триацилированные липопептиды.
TLR5 распознает флагеллин (составляющую часть бактериального жгутика)[24]. TLR5 узнает высококонсервативный центральный сайт флагеллина, который необходим для формирования протофиламентов и обеспечения бактериальной подвижности. Было показано, что TLR5 экспрессируется на поверхности кишечных эпителиальных клеток, а не на макрофагах и дендритных клетках селезенки. Это доказывает роль TLR5 в детекции инвазивных жкутиковых бактерий в пищеварительном тракте.
TLR2 и TLR4 вовлечены и в распознавание различных эндогенных молекул, таких как белки теплового шока (HSP60,HSP70, gp96 и HSP22), фибриноген, жирные кислоты и т.д. Эти эндогенные лиганды запускают продукцию макрофагами TNF- и IL-12.
Таким образом, TLR, находящиеся на поверхности клетки, являются сенсорами сигналов опасности. Внутриклеточные TLR. TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9 экспонируются внутриклеточными компартментами, такими как эндосома, лизосома или эдноплазматический ретикулум (ER) [25, 26]. Эти TLR являются сенсорами чужеродных нуклеиновых кислот и включают противовирусный врожденный иммунный ответ. Они же включают продукцию воспалительных цитокинов и интерферонов I типа (таких как IFN-, IFN-).
TLR3 распознает dsRNA и геномные РНК вирусов. TLR7 узнает имидазолхинолиновые производные, такие как имихимод и резихимод (R-848), и гуаниновые аналоги, такие как локсорибин, которые обладают противовирусными и противоопухолевыми свойствами [27].
TLR8 филогенетически наиболее похож на TLR7. Человеческий TLR8 распознает R-848, бактериальные РНК и одноцепочечные РНК, выделенные из HIV, VSV и вируса гриппа А, хотя TLR-дефектные мыши проявляют нормальный ответ на эти молекулы. Это может указывать на видоспецифичность функций TLR8 [28]. TLR8 экспрессируется в различных тканях. Наиболее высокий уровень экспрессии наблюдается в мононоцитах.
TLR9 способен распознавать неметилированные последовательности ДНК 2 -дезоксирибоцитидин-фосфогуанозин (CpG), распространенные в бактрериях, но редкие у позвоночных [29].
В В-клетках TLR отвечает за положительную регуляцию маркеров активации, запуск пролиферации, секрецию цитокинов, дифференцировку и, наконец, секрецию иммуноглобулинов.
Уровень экспрессии TLR и чувствительность к их лигандам варьируют в зависимости от субпопуляции В-клеток. Большинство экспериментальных данных были получены при изучении мышиных субпопуляций В-клеток. Три разных детальных исследования показали, что экспрессия мРНК TLR4 и TLR1 происходит во всех субпопуляциях В-клеток с некоторыми вариациями [33-35]. TLR7 и TLR9 присутствуют также во всех субпопуляциях, хотя уровень экспрессии сильно варьирует в зависимости от субпопуляций В-клеток. В двух других исследованиях было выяснено, что экспрессия мРНК TLR3 наблюдалась только в MZ B-клетках [33, 34]. Наиболее высокий уровень экспрессии TLR2 наблюдается в В-1-клетках. То же самое наблюдается и при исследовании уровня экспрессии мРНК TLR8 [36].
Наблюдается видоспецифичность уровня экспрессии TLR в популяциях В-клеток. Основные отличия лежат в экспрессии TLR4. Мышиные В-клетки постоянно экспрессируют TLR4. Их лиганд, LPS, стимулирует пролиферацию В-клеток, секрецию цитокинов и CSR (Ig переключение) [37]. В отличие от мышиных клеток, человеческие В-клетки менее чувствительны к LPS, об этом свидетельствует низкий уровень экспрессии TLR4 [38]. Мышиные клетки проявляют высокий уровень ответа на стимуляцию с помощью липопептидов, активирующих TLR2 [39]. Но человеческим В-клеткам необходима сенсибилизация TLR2-лигандами с помощью олигомеризации В-клеточных рецепторов (BCR) или с помощью иммуноглобулинов [40]. Как в мышиной, так и в человеческой иммунной системах TLR2 экспрессируется совместно с его ко-рецепторами TLR1 и TLR6, тогда как совместная экспрессия с CD36 наблюдалась лишь в мышиных В-клетках, а экспрессия предполагаемого ко-рецептора TLR10 ограничена человеческими В-клетками. Как мышиные, так и человеческие В-клетки экспрессируют TLR7 и TLR9 и могут быть активированы специфическими последовательностями ДНК (TLR9) и РНК (TLR7).
Методика тестирования адъювантной активности RN-пептида
TLR могут быть экспрессированы как в APC, таких как дендритные клетки (DC) и макрофаги [46], так и в Т-клетках [47, 48], и могут служить в качестве костимулирующих сигналов в активации Т-клеток [49].
Традиционно, активация TLR в APC приводит к продуцированию IFN-, провоспалительных цитокинов, таких как TNF-, IL-1 и IL-6, а также цитокинов IL-12 и IL-18, которые приводят к дифференцировке Th1. В то же время наблюдается увеличение количества Th2 ответа в MyD88-дефицитных мышах с ослабленным TLR-сигналом [50-52]. Секреция IL-12 и IL-23 дендритными клетками, индуцированных активацией TLR, усиливается с помощью хемокина CCL17. Продукция этих цитокинов значительно сокращается в CCL17-дефицитных DC [53]. Было показано, что доза антигена играет важную роль в контролеTh1/Th2-дифференциации, которую запускают DC. Более низкое содержание овальбумина (OVA) (1 и 10 нг/мл) вызывает Th2 детерминацию, в то время как при более высокой концентрации (1 мкг/мл и 100 нг/мл) развитие Th2 не выявлено. Стимуляция CD4+ Т-клеток с помощью DC в сочетании с агонистами TLR2 и TLR9 в присутствии 10 нг/мл OVA пептида (оптимальной концентрации антигена для развития Th2) привела к подавлению продуцирования IL-4 и развития Th2. [54]. Активация TLR4 приводит к MyD88 Th17-зависимому ответу в CD4+ Т-клетках памяти при отсутствии молекулы TRIF (TIR-domain containing adapter-inducing interferon-, адаптер, содержащий TIR-домен, индуцирующий интерферон-) [54]. Активация DC через TLR2-MyD88 зависимый путь также вызывает Th1 и Th17 дифференциацию клеток [55].
Тем не менее, сигнал TLR2 может ингибировать способность дендритных клеток продуцировать IL-12p70. Этот же сигнал приводит к иммунному ответу, вызываемому синергичным сочетанием TLR4 и TLR7/8 агонистов (оба являются индукторами Th1-ответа) по отношению к Th2 и Th17 ответам в наивных Т-клеточных субпопуляциях и субпопуляциях Т-клеток памяти [56]. Мышиные DC, активированные посредством LPC или CpG олигодезоксинуклеотида (ОДН) преодолевают Treg-опосредованное подавления при помощи индуцирования IL-6 сигналов [57]. Таким образом, Т-клеточные субполяции активируются TLR сигналами от АРС, изменяясь в зависимости от типа и статуса участвующих в процессе APC, состава цитокинов, а также от количество присутствующего антигена [58].
С другой стороны, недавние исследования показали, что сигналы от Th-клеток могут приводить к образованию и функционированию специализированных субполяций дендритных клеток. Например, Th1 и Th17 клетки вызывают дифференциацию моноцитов в Th1h17-стимулирующих субполяциях дендритных клеток в участках кожи, пораженных псориазом, а Th2 клетки вызывают продуцирование Th2-стимулирующих субполяций дендритных клеток при остром атопическом дерматите [59]. Фенотип этих поляризованных субпопуляций дендритных клеток не может быть изменен даже после последующей стимуляцией TLR лигандов. При стимуляции лигандами TLR1LR9, изменяется количество цитокинов, секретируемых специализированными субполяциями дендритных клеток, но общий уровень секретируемых цитокинов остается прежними [59]. TLR сигналы в дендритных клетках обратно регулируются при помощи адаптеров, содержащих последовательности иммунорецепторного тирозин-содержащего активирующего мотива (ITAM), подавляющих активацию дендритных клеток [60]. Таким образом, получается, что существующий направленный иммунитет предписывает, что последующий иммунный ответ и заданная направленность не будет изменяться, даже если будет происходить стимуляция с помощью PRR.
Прямая активация TLR в CD4+ T-эффекторных клетках индуцирует констимуляцию Уровень экспрессии и активность TLR в Т-клетках связаны с функциональным состоянием Т-клеток, к примеру, эффекторные Т-клетки или клетки памяти, а также с активационным статусом Т-клеток по отношению к сигналам TCR (Т-клеточный рецептор) [61, 62]. Мышиные наивные Т-клетки могут экспрессировать TLR1LR9 хотя есть значительные различия в уровнях экспрессии [63]. TLR1, TLR4 и TLR6 максимально выражены в CD4+ и CD8+ Т-клетках [61]. Хотя наивные человеческие CD4+ T-клетки экспрессируют значительные количества внутриклеточных белков TLR2 и TLR4, наличие белков TLR2 и TLR4 на клеточной поверхности было обнаружено только в активированных CD4+ T-клетках [49]. Тем не менее, уровень экспрессии TLR2 в наивных Т-клетках может значительно увеличиться за счет анти-CD3-активации TCR. Было обнаружено, что маркер активации, HLA-DR антиген, экспрессируется совместно с TLR2, что подтвержадет тот факт, что экспрессия TLR2 связана с активацией Т-клеток [49]. Аналогичные результаты были получены для CD8+ T-клеток с содержанием транскриптных копий мРНК TLR2 в цитотоксических Т-лимфоцитах (CTL) в 7–10 раз выше чем в наивных CD8+ T-клетках [63]. Активированные мышиные CD4+CD25- эффекторные T-клетки могут функционально экспрессировать TLR2 [64]. Различия могут быть отчасти связаны с разными условиями, применяемыми для очистки Т-клеток, и разными лигандами, используемыми для активации TLR. Кроме того, было показано, что при использовании липополисахаридов, полученных из Salmonella enteritidis, Salmonella minnesota и Salmonella typhimurium, только LPS из Salmonella typhimurium может вызвать пролиферацию и секрецию IFN- в мышиных CD4+ T-клетках [64].
Первичный анализ библиотеки методом скрининга на чашках
Белок YB-1 (Y-box-связывающий белок 1) принадлежит к доменному семейству белков холодового шока. Белки холодового шока обладают высокой степенью филогенетической консервативности. В самом деле, Y бокс связывающие белки являются одними из наиболее эволюционно консервативных белками, связывающими нуклеиновые кислоты. В целом гомология аминокислотных последовательностей центрального домена холодового шока (CSD) у прокариот и эукариот составляет более 44% [104, 105]. Белок может быть разделен на три области: аланин/пролин-богатый N концевой участок; центральный CSD , и С-концевой области, состоящей из чередующихся областей положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков (где преобладают основные или кислые аминокислотные остатки). Каждый заряженный участок домена составляет около 20-30 аминокислот в длину (рис. 8) [106]. Карбоксильная область YB-1 представляет собой "заряженную молнию» с мотивами, которые распознают специфические шпильки РНК. Это вносит свой вклад в ДНК-/РНК-специфичное связывание. Этот домен функционирует в качестве дока для партнерских белков.
Белок YB-1 непосредственно участвует в активации и подавлении транскрипции и трансляции многих генов, участвующих в клеточном делении, дифференцировке и кодирующих различные защитные белки. [108]
YB-1 непосредственно взаимодействует с другими факторами транскрипции и коактиваторами, такие как р53 [109] , YY1 [110] , CBP/p300 [111] , Smad3 [112] и АР-1 [112] в процессе регуляции экспрессии генов. Кроме того, помимо С-концевой области существуют еще области в N-концевой части белка YB-1, которые обеспечивают белок-белковые взаимодействий, например, с гетерогенными рибонуклеопротеидами (hnRNP) [113] и белком сплайсинга SRp30c [114]. Эти данные указывают на важность трехмерной структуры YB-1 в физическом взаимодействии.
В ответ на клеточные стрессовые сигналы, в том числе на низкую температуру, ДНК-модифицирующие препараты, активные формы кислорода и УФ-облучение [107, 115], YB-1 изменяет свою внутриклеточную локализацию: из цитоплазмы он перемещается в ядро, где он может участвовать в регуляции генов. В этом отношении YB-1 опосредует про-митогенную реакцию, положительно воздействуя на развитие эмбриона [116] или же отрицательно воздействуя в процессе онкогенеза [117]. Таким образом белок YB-1 играет важную роль в канцерогенезе [118, 119], опухолевой прогрессии [120, 121], а также в воспалении. 3.3.2 Участие белка YB-1 в воспалительных заболеваниях Благодаря способности связывать РНК и ДНК, YB-1 контролирует клеточную содержание нескольких белков. Белок YB-1 участвует в транскрипции генов, связанных с онкогенезом и клеточной пролиферацией, дифференцировкой и апоптозом [122]. Кроме того, было показано, что YB-1 взаимодействует с двухцепочечной ДНК промотора гена HLA (человеческого лейкоцитарного антигена), тем самым предотвращая связывание других белков с данным сайтом. Дальнейшие исследования показали участие белка YB-1 в воспалительных заболеваниях и заболеваниях, связанных с регуляцией генов, в том числе аллергической астмой и мезангиопролиферативным гломерулонефритом [123-125]. Экспрессия самого YB-1 активно регулируется во время воспалительных заболеваний и инфекций, например, в головном мозге плода во время материнской инфекции [126]. В экспериментальной модели эндотоксина в мышах, увеличивается уровень экспрессии белка YB-1 в активированных лейкоцитов, которые рекруитируются в место воспаления, а в активированных эозинофилах после воздействия аллергена [123].
Frye и соавторы отметили, что YB-1 также выделяется через неклассической путь секреции [127]. Аналогичный путь секреции был описан и для других воспалительных медиаторов, таких как IL-1, тиоредоксин-1 и фактор роста фибробластов 2 [128].
Первичные и иммортализованные моноциты, стимулированные с помощью LPS, демонстрируют зависимое от времени высвобождение белка YB-1 из микровезикул. Внеклеточный белок YB-1 обладает хемотаксическими и митогенными свойствами. Таким образом, внеклеточный белок YB- 1 участвует в воспалительных заболеваниях почек, где экспрессия PDGF- (platelet-derived growth factor , тромбоцитарный фактор роста ) является ключевым фактором. [127].
Большое количество генов, вовлеченных в протекание воспалительных реакций, негативно регулируется с помощью белка YB-1. К примеру, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) является ключевым регулятором ангиогенеза и фактором с про-воспалительными функции, так как нарушение регуляции ангиогенеза наблюдается при воспалительных процессах, которые могут приводить к хроническиому развитию заболеваний. YB-1 может играть роль репрессора промотора VEGF [129].
Белок YB-1 связывается с одноцепочечными мотивами нуклеиновых кислот, причем это связывание усиливается с помощью фосфорилирования N-концевой части белка посредством вовлечения различных киназ [130]. Кроме того, YB-1 связывается с инвертированной CCAAT последовательностью гена главного комплекса гистосовместимости класса II (MHC II) человека, и было показано, что происходит подавление экспрессии генов HLA-DR (поверхностного клеточного рецептора MHC II) в клетках глиобластомы человека [131]. Кроме того, YB- 1 осуществляет негативную регуляцию промотора гена рецептора тиреотропного гормона [132].
Экспрессия CCL5 в атеросклеротических бляшках и корреляция концентрации CCL5 в сыворотке крови с активностью процесса при прогрессировании атеросклероза [133, 134] указывают на патофизиологическую роль этого хемокина в формировании неоинтимы [135]. CCL5 экспрессируется во всех типах клеток, участвующих в развитии атеросклероза, таких как моноциты/макрофаги, Т-лимфоциты, клетки гладкой мускулатуры, а также в тромбоцитарных гранулах [136, 137].
С помощью картирования было показано, что YB-1 способен связываться с проксимальным участком промотора CCL5 в моноцитах и клетках гладкой мускулатуры [138, 139]. В дополнение к прямой активации, YB-1 посредством взаимодействия с другими факторами транскрипции (такими как АР-1, АР-2, NF-kB) может участвовать в регуляции экспрессии CCL5, такие как АР-1 , АР-2 , NF-kB [140–142]. Кроме того, тромботические события, вызванные эндотелиальной эрозией, могут активировать YB-1 с последующей сверхрегуляцией экспрессии PDGF- [124]. Такой механизм действия, совместно с регуляцией экспрессии CCL5 способствует образованию неоинтимы после повреждения сосуда [1138].
Определение Kd комплекса RN-пептида с белком YB-1 и проведение конкурентного анализа
Последовательность RN-пептида PRYH, необходима для связывания пептида с антителами против ГМДП, однако эта последовательность не обеспечивает адъювантную активность пептида [156]. Варианты, укороченные с N-конца, не проявляют адъювантной активности. Некоторые варианты RN-пептида, укороченные с С-конца, могут проявлять адъювантную активность. Например, варианты RN-пептида, укороченные с С-конца на 1 и 5 аминокислотных остатков проявляют адъювантную активность. Минимальной биологически активной составляющей RN-пептида является гептапептид RVPPRYH (рис.10) [156].
Для подробного выяснения роли отдельных аминокислотных остатков в проявлении адъювантного эффекта и связывания с антителами были синтезированы аналоги RN-пептида с заменами аминокислотных остатков на остаток аланина (Ala-scan) (Рис.11). Для измерения адъювантной активности аланиновых вариантов RN-пептида использовали мышей линии BALB/С. В качестве иммуногена использовался овальбумин. Индекс адъювантности определяли как отношение титра антител против овальбумина после иммунизации животных в присутствии адъюванта к титру антител после иммунизации белком без адъюванта.
Введение остатка Ala в положения 1, 3, 4, 5, 6, 9, 10 и 11 RN-пептида приводит к значительному снижению или потере адъювантной активности в диапазоне 1-10 мкг/животное. А5-модифицированый пептид проявляет адъювантную активность в дозе 100 мкг/животное, а А6-производное 10 и 100 мкг/животное. При замене остатка гистидина (H7) на аланин (A) адъювантная активность сохранялась в дозе 1 мкг/животное, но отсутствовала в больших дозах. Замена остатка валина на аланин (V2 A) приводила к сдвигу максимума адъювантности до 10 мкг/животное, а V14 A и N15 A не влияли существенно на биологический эффект (рис. 11). Белки и пептиды могут быть нестабильными в клетке ввиду быстрого гидролиза, карбоксипептидазами. Исходя из полученных данных, очевидно, что С-концевые аминокислотные остатки RN-пептида можно модифицировать во избежание гидролиза карбоксипептидазами. Когда большая ароматическая группа (FITC) присоединилась к карбоксильному концу RN-пептида через остаток лизина, образовалось высокоактивное соединение проявляющая адъювантный индекс равный 17.7 при дозе 10 мкг/животное. Адъювантной активностью обладает и амидированный по С-концу RN-пептид.
Адъювантная активность аналогов RN-пептида, полученных в результате Ala-scan. За 1 принимали титр сыворотки против овальбумина после иммунизации без адъюванта.
Гораздо более драматично влияние замены остатков аргинина на аланин (R1 A и R5 A). При замене R1 A наблюдалось ингибирование образование антител против овальбумина в диапазоне 1 – 100 мкг/животное. Это может свидетельствовать о том, что он взаимодействует с мишенью in vivo, но каким-то образом передача сигнала блокируется. Подобный эффект наблюдается для пептидов A5 и A9. Таким образом, можно предположить, что для формирования функционально-активной формы RN-пептида важны взаимодействия R1, R5 и K9 (положительно заряженные), а также I10 и M13. Таким образом, для проявления адъювантной активности RN-пептида необходимым является область RVPPRYH, а также K9, I10, S11 и M13.
В ходе проверки связывания с моноклональными антителами Е6/1.2 вариантов RN-пептида с заменами аминокислотных остатков на аланин были получены следующие данные (Таб. 2). Существенно снижают уровень связывания замены аминокислотных остатков аргинина и тирозина (R1, R5 и
Остальные замены несущественно влияют на связывание вариантов RN-пептида с антителами против ГМДП (E6/1.2).
При замене остатка аргинина на аланин (R1 A) может сильно изменяется конформация пептида, а N-конец становиться недоступным для связывания. Замены остатков валина или пролинов (V2, P3 или P4) существенно не мешают связыванию с антителами против ГМДП.
Замены остатков аргинина и тирозина (R5 A и Y6 A) существенно снижают связывание с антителами. Для связывания с антителами существенна последовательность RVPPRYH. Данные ala-scan дают возможность предположить, что в этой последовательности основную роль играют остатки аргинина и тирозина (R5 и Y6).
Замена остатка гистидина не снижает связывания с антителами. Замена же остатка лизина на аланин (K9 A) снижает уровень связывания с антителами на 40%. Мы предполагаем, что изменяется конформация N-концевой части пептида и, вследствие этого, снижается уровень связывания с антителами. Последующие замены аминокислотных остатков существенно не снижают уровень связывания с антителами, по сравнению с RN-пептидом. Исходя из этих данных и данных об уровне связывания пептидов с антителами, видна общая тенденция. Связываться с антителами против ГМДП способны лишь те пептиды с замененными аминокислотными остатками, у которых N-концевая аминокислотная последовательность не претерпела серьезных конформационных изменений.
Отсутствие полной корреляции между наличием адъювантной активности и способности связываться с антителами приводят к выводу о том, что взаимодействие RN-пептида с клеткой-мишенью in vivo носит более сложный характер по сравнению с взаимодействием с антителами и в большей степени зависит от аминокислотного окружения «коровой» последовательности и конформации пептида в целом. 5.3 Анализ адъювантной активности RN-пептида
Адъювантная активность RN-пептида. Мы проверили адъювантную активность пептида-миметика ГМДП в диапазоне концентраций от 1 нг до 100 мкг/животное. Полученные результаты продемонстрированы на рис. 12. Оказалось, что пептид обладает двумя пиками колоколообразной зависимости в дозах от 2 нг до 5 нг на животное (мышь весом 20 г) и в дозах от 100 нг до 100 мкг на животное. Наличие двух пиков адъювантной активности позволяет нам предположить, что RN-пептид в разных концентрациях связывается с разными типами рецепторов.
