Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Структурные характеристики белков NAT 10
1.2 Структурные особенности генов NAT 14
1.3 Реакция ацетилирования и субстратная специфичность ариламин N-ацетилтрансфераз 19
1.4 Аллели NA Т2 человека 23
1.5 Аллели NA ТІ человека 29
1.6 Тканевая и органная локализация NAT 36
1.7 Роль негенетических факторов в регуляции активности NAT 39
1.7.1 Влияние препаратов на активность NAT 1 HNAT2 39
1.7.2 Изменение активности NAT при некоторых заболеваниях 40
1.8 Ассоциация полиморфизма NAT и полифакторных заболеваний 41
1.8.1 Полиморфизм NAT и рак легкого 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы 46
2.1 Объект Исследования 46
2.2 Материалы 46
2.3 Методы 48
2.3.1 Подбор эндонуклеаз рестрикции 48
2.3.2 Сравнение нуклеотидных последовательностей генов NAT 48
2.3.3 Выделение ДНК из цельной крови 48
2.3.4 Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 49
2.3.5 Полимеразная цепная реакция 54
2.3.6 Ферментативный гидролиз 54
2.3.7 Анализ продуктов ферментативного гидролиза 55
2.3.8 Статистическая обработка полученных данных 55
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 57
3.1 Оптимизация набора эндонуклеаз рестрикции для выявления полиморфных вариантов генов NAТ 57
3.1.1 Выявление полиморфизма С190Т гена NAT1 57
3.1.2 Выявление полиморфизма А1025 генаNAТІ 58
3.1.3 Выявление полиморфизма А752Т гена NAT1 58
3.1.4 Выявление полиморфизмов С190Т и G191А гена NAT2 61
3.1.5 Выявление полиморфизмов G857A, Т859С и 859Del гена NAT2 62
3.1.6 Выявление полиморфизма С481Т гена NAT2 64
3.2 Поиск новых полиморфизмов в гене NAT2 65
3.3 Полиморфизм генов NAT в контрольной выборке европеоидов г.Новосибирска 74
3.3.1 Распределение частот встречаемости полиморфных вариантов гена NAT1
в контрольной выборке европеоидов г. Новосибирска 74
3.3.2 Распределение частот встречаемости полиморфных вариантов гена NAT2
в контрольной выборке европеоидов г. Новосибирска 75
3.4 Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена NAT2 и их комбинаций с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска 76
3.4.1 Анализ ассоциаций полиморфных вариантов гена NAT2 с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска 76
3.4.2 Анализ ассоциаций комбинаций генотипов гена NAT2 с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска 84
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 88
4.1 Оптимизация набора эндонуклеаз рестрикции для выявления полиморфных вариантов генов NAТ методом ПДРФ-анализа 88
4.2 Поиск новых полиморфизмов в гене NAT2 92
4.3 Распределение частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT
в контрольной выборке европеоидов г. Новосибирска 94
4.4 Исследование ассоциаций полиморфных вариантов гена NAT2 и их комбинаций
с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска 95
Заключение 100
Выводы 103
Список литературы 104
- Реакция ацетилирования и субстратная специфичность ариламин N-ацетилтрансфераз
- Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
- Выявление полиморфизмов G857A, Т859С и 859Del гена NAT2
- Оптимизация набора эндонуклеаз рестрикции для выявления полиморфных вариантов генов NAТ методом ПДРФ-анализа
Введение к работе
В современных молекулярно-эпидемиологических исследованиях многофакторных заболеваний, к которым относятся и онкологические, широко используется подход, основанный на исследовании ассоциаций полиморфных вариантов генов, продукты которых потенциально вовлечены в развитие и регуляцию тех или иных звеньев патогенеза заболевания, так называемый подход кандидатных генов (Пузырев, Степанов, 1997). С этих позиций перспективным объектом исследования представляются ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), которые ответственны за процессы токсификации и детоксификации чужеродных соединений, в том числе и канцерогенных веществ (Galton, Ferns, 1999). Соотношение процессов токсификации и детоксификации сильно варьирует между индивидуумами вследствие высокой популяционной вариабельности генов ФБК (Weber, 1999). Особое значение дисбаланс детоксификации/токсификации ксенобиотиков имеет для онкологической патологии, составляя важную часть процессов стадии инициации. Рак легкого -самое распространенное в мировой популяции злокачественное заболевание. По данным МАИР в мире ежегодно диагностируется около 1 млн новых случаев рака легкого, что составляет более 12% от числа всех выявляемых злокачественных новообразований (Трахтенберг, Чиссов, 2000). Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью заболевания, но и поздней диагностикой, неудовлетворительными результатами лечения и, как следствие, высокой летальностью. Это делает актуальным изучение всех факторов, причастных к начальному этапу канцерогенеза, в том числе и ФБК.
К группе ферментов биотрансформации ксенобиотиков относятся ариламин N-ацетилтрансферазы (Е.С. 2.3.1.5.): NAT1 и NAT2, осуществляющие N- и 0-ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов и гидразинов (Hein et al., 2000). Обширный скрининг субстратов показал, что NAT1 и NAT2 имеют перекрывающиеся, но четко отличающиеся профили специфических активностей (Kawamura et al., 2005). Давно известный полиморфизм NAT2 фенотипически проявляется наличием в популяции «быстрых» и «медленных» ацетиляторов, при этом у представителей европеоидной расы частота «медленных» ацетиляторов составляет 40-60% (Evans, 1989). Долгое время считалось, что для NAT1 не свойственен метаболический полиморфизм, но лишь недавно показано, что около 8% европеоидов являются медленными ацетиляторами по специфическим субстратам NATl (Butcher et al., 1998). Причиной метаболического полиморфизма ацетилирования являются некоторые нуклеотидные замены в белок-кодирующем регионе гена NAT2 (Grant et al., 1990) и кодирующем и некодирующем регионе гена NATl (Weber, Vatsis, 1993). Молекулярные механизмы, ведущие к фенотипу «медленного» ацетилятора до сих пор не совсем понятны. Снижение активности ацетилирования в несколько сотен и даже тысяч раз происходит за счет снижения экспрессии белка (Leff et al., 1999), образования менее стабильного белка (Grant et al., 1997; Delomenie et al., 1997) или усиленной деградации белка (Butcher et al., 2004; Zang et al., 2004). Эти различия в механизмах реализации, а также характерная субстратная специфичность аллозимов (Hickman et al., 1995), свидетельствуют о гетерогенности группы медленных ацетиляторов.
После того, как была показана роль ацетилирования в метаболической активации и детоксификации канцерогенов, присутствующих в табачном дыме, окружающей среде и потребляемой пище (Hein et al., 1993; 1994: Fretland et al., 2001; 2002), стали широко проводиться исследования ассоциаций между полиморфизмом NAT и онкологическими заболеваниями. К настоящему времени показано, что статус ацетилирования вносит изменения в риски возникновения рака мочевого пузыря (Inatomi et al., 1999; Hein, 2006) и толстой кишки (Hein et al., 2000; Tamer et al., 2006). Имеющиеся немногочисленные данные литературы о связи полиморфизма NAT и рака легкого противоречивы (Cascorbi et al., 1996; Bouchardy et al., 1998; Wikman et al., 2001). В этих исследованиях по результатам генотипирования делили аллели на две группы: ведущие к фенотипу медленного или быстрого ацетилятора. Однако в свете последних данных о разнообразии проявлений полиморфизмов, изучение их ассоциации с заболеванием имеет самостоятельное значение. В нашем институте показано, что в группе больных раком легкого частота встречаемости фенотипа медленного ацетилятора выше, чем в контроле (Ляхович и др., 1997). Эти результаты подтолкнули нас к дальнейшему исследованию ассоциаций с раком легкого, используя в качестве маркера полиморфные варианты NAT.
Для обнаружения полиморфных вариантов в нуклеотидной последовательности часто используется метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Этот метод является широко распространенным, доступным, достаточно быстрым, информативным и легко интерпретируемым методом, позволяющим обнаружить мутационную изменчивость в сайтах узнавания различных эндонуклеаз рестрикции. Кроме того, его проведение не требует дорогостоящего оборудования. Несмотря на появление новых высокотехнологичных альтернативных методов обнаружения полиморфизмов, ПДРФ-анализ за счет указанных выше преимуществ и возможности его проведения практически в любой диагностической лаборатории в ближайшие время останется одним из наиболее часто востребованных методов. В связи с открытием все новых полиморфизмов в генах NAT, иногда в непосредственной близости от ранее известных мутаций, например, С559Т и G560A гена NAT1, С190Т и G191A гена NAT2, очень важна более точная локализация выявляемых мутаций при наименьших затратах (Hein et al., 2000). Поэтому оптимизация метода ПДРФ-анализа является актуальной задачей.
Генетический полиморфизм NAT2 у европеоидов Западной Сибири, как и вообще России, остается малоизученным. Генетический полиморфизм NAT! у европеоидов России не изучен вообще. В связи с этим имеет большое значение изучение распределения полиморфизмов генов NAT у европеоидов России, а также поиск возможных специфических полиморфизмов в нашей популяции.
Изложенное выше определило цель исследования: исследование полиморфизма генов NAT1 и NAT2 методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и анализ ассоциации полиморфных вариантов с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска.
Для достижения цели решались следующие задачи:
1. Изучить возможность использования новых эндонуклеаз рестрикции для более надежного и точного обнаружения известных полиморфизмов генов NAT1 и NAT2 и поиска новых полиморфизмов.
2. Изучить частоту встречаемости полиморфных вариантов генов NAT1 и NAT2 у европеоидов г. Новосибирска.
Провести анализ ассоциаций аллелей, генотипов и комбинаций генотипов полиморфных вариантов генов NAТ с раком легкого.
Научная новизна исследования
Впервые предложен способ обнаружения полиморфизма А1025 гена NAT1 методом ПДРФ-анализа и предложены способы однозначного определения полиморфизмов А752Т гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2 этим методом. Предложенные способы ПДРФ-анализа позволяют различать полиморфизмы С190Т и G191A;G857A и Т859С, 859Del гена NAT2.
Впервые в России охарактеризована частота встречаемости полиморфных вариантов С97Т, С190Т, 350,351G C, Т402С, А752Т и А1025 гена NAT1 и С190Т, G191A, А434С, С759Т, Т859С, 859Del гена NAT2. Впервые у европеоидов Западной Сибири определены частоты встречаемости полиморфных вариантов С282Т, A803G и G857A гена NAT2.
Установлено, что аллель 803G гена NAT2 у мужчин ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. Генотип 803АА у мужчин, в том числе курящих, ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого. Комбинация генотипов гена NAT2 282TC/590AG/481CC/803GA/857GG ассоциирована с устойчивостью к раку легкого, а комбинация 282CC/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого.
Практическая значимость работы
Предложены новые способы ПДРФ-анализа генов NAT, которые позволяют однозначно определить полиморфизмы А752Т гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2, а также различить полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и Т859С, 859Del гена NAT2. Эти способы применимы в исследованиях, направленных на изучение функциональных проявлений полиморфизмов генов NAT, кинетических характеристик аллозимов NAT и популяционно-генетических исследованиях.
Полученные данные о распределении аллелей и генотипов полиморфных вариантов NAT у жителей г. Новосибирска представляют интерес для геногеографических и генетико-эпидемиологических исследований широко распространенных заболеваний человека. Результаты настоящей работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Предложенные способы ПДРФ-анализа позволяют однозначно определять полиморфизмы С190Т и G857A гена NAT2 и А752Т гена NAT1, а также различать полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и Т859С, 859Del гена №472.
2. Распределение частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT1 и NAT2 у европеоидов г. Новосибирска соответствует таковому в других популяциях европеоидов.
3. В европеоидной популяции г. Новосибирска аллель 803G гена NAT2 у мужчин ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. Генотип 803АА у мужчин, в том числе курящих, ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого.
4. Комбинация генотипов 282TC/590AG/481CC/803GA/857GG гена NAT2 в исследованной популяции ассоциирована с устойчивостью к раку легкого, а комбинация 282CC/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого.
Апробация работы
Материалы исследования были представлены на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004); на Российской научно-практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Современное состояние и перспективы развития клинической онкологии» (Томск, 2004); на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 10 работ (из них 4 в рецензируемой печати).
Реакция ацетилирования и субстратная специфичность ариламин N-ацетилтрансфераз
Наиболее протяженный интрон в гене NAT1 расположен между экзонами 2 и 3 и имеет длину более 39 т.п.н. Наиболее интенсивно транскрибируются экзоны 4 и 8, а экзоны 5-7 наименее представлены в мРНК NAT1 (Boukouvala, Sim, 2005).
Выбор некодирующих экзонов NAT1 может быть случайным процессом, зависящим от относительной доступности сайтов сплайсинга, или же может находиться под контролем специфических регуляторных процессов. Дифференциальное использование некодирующих экзонов с вовлечением более чем одного альтернативного промотора может быть также ассоциировано с тканеспецифичной экспрессией или связано с изменением профиля экспрессии в процессе онтогенеза (Boukouvala, Sim, 2005).
Вероятно, что гены NAT человека являются объектом регуляции тканеспецифичных факторов и факторов, связанных с процессом онтогенеза. При этом различные варианты сплайсинга транскриптов NAT могут быть связаны с контролем экспрессии белка. Boukouvala S., Sim Е. (2005) исследовали экспрессию в тканях печени, легкого, сердца, мозга, скелетной мускулатуры, почки, поджелудочной железы и плаценте. Некодирующий экзон 8 гена NAT1 широко экспрессируется, при этом встречается или с экзоном 4 (такие транскрипты обнаружены во всех исследованных тканях) или с экзоном 5 (обнаружены во всех тканях за исключением мозга и скелетной мускулатуры). Транскрипты, содержащие экзоны 5, 7 и 8, обнаружены в ткани печени, почек и поджелудочной железы. В ткани легкого кроме того были обнаружены транскрипты, содержащие экзон 5, один из двух вариантов экзона 6 (а или Ь) и экзон 8. Транскрипты, содержащие экзоны 1-3 гена NAT1 не обнаружены, возможно, их экспрессия осуществляется в других органах и тканях, не исследованных в данной работе. Транскрипты NAT1, в состав которых не входят некодирующие экзоны были обнаружены во всех исследованных тканях за исключением мозга и скелетной мускулатуры. Более того, транскрипты NAT1, как и NAT2, которые не содержали некодирующие экзоны, превалировали в печени. Таким образом, транскрипты, в состав которых входили экзоны 5-7 NAT1 оказались более тканеспецифичными, чем транскрипты с экзонами 4 или 8.
Присутствие тандемно расположенных, дифференциально используемых сигналов полиаденилирования также является распространенной особенностью генов эукариот. Boukouvala et al. (2005) показали присутствие в тканях помимо обычных транскриптов NAT1, более протяженных на З -конце транскриптов, за исключением ткани скелетной мускулатуры. Таким образом, в гене NAT1 было обнаружено наличие двух сигналов полиаденилирования, расположенных на расстоянии 212 и 330 п.н. после стоп-кодона. Для NAT2 также обнаружено наличие двух альтернативных сигналов полиаденилирования, расположенных на расстоянии 198 и 320 п.н. после стоп-кодона. Однако остается неясным является ли выбор этих сигналов тканерегулируемым процессом или случайным событием, зависящим от доступности двух этих последовательностей. Другие гены NAT млекопитающих, включая крысу (Ebisawa et al., 1995), хомяка (Land et al., 1994) и кролика (Blum et al., 1989; Sasaki et al., 1991), также имеют несколько альтернативных сигналов полиаденилирования. Напротив, ген Nat2 мыши имеет только один функциональный сигнал полиаденилирования (Boukouvala et al., 2003).
Основываясь на первоначальных данных Ohsako S. и Deguchi Т. (1990) и предположении о том, что промоторный регион транскрипта NAT1 располагается на расстоянии около 250-300 п.н. от сайта инициации транскрипции (Blum et al., 1990), исследователи в поисках промоторного региона сосредоточились на области, находящейся непосредственно выше кодирующего экзона (Butcher et al., 2003; Mitchell, Warshawsky, 2003). Так Butcher N.J. et al. (2003) идентифицировали последовательность длиной 20 п.н., расположенную на расстоянии 245 п.н. и обладающую слабой промоторной активностью. Однако, как позднее было выяснено, большинство транскриптов инициируются в регионе длиной 49 п.н., расположенной на расстоянии 11.8 т.п.н. от кодирующего экзона (Husain et al., 2004). Промоторная активность этого фрагмента оказалась самой высокой из исследованных и была в 30-80 раз выше, чем фрагмента расположенного непосредственно выше кодирующего экзона. Кроме этих последовательностей, возможно промоторными являются регионы, расположенные на расстоянии 9.3 и 51.5 т.п.н. от кодирующего экзона (Husain et al., 2004; Butcher et al., 2005).
Ген NAT2 человека транскрибируется с промотора, расположенного на расстоянии 8.6 т.п.н. от кодирующего экзона (Ohsako, Deguchi, 1990; Deguchi, 1992). Сравнение последовательностей, предположительно соответствующих главным промоторным регионам генов NAT1 и NAT2, обнаружило, что идентичность нуклеотидной последовательности в регионе размером 200 п.н. в непосредственной близости от сайта инициации составляет 77%, а на протяженности 1000 п.н. от этого региона идентичность составляет 49% (Butcher et al., 2005). Это сходство предполагает, что некоторые основные черты функционирования промоторов могут быть схожи для генов NAT1 и NAT2 даже несмотря на то, что они различаются в тканеспецифичном включении некодирующих экзонов в мРНК.
В результате недавних исследований структуры генов NAT стало ясно, что кроме полиморфизмов в кодирующих регионах и регионах, расположенных в непосредственной близости к ним, на синтез и активность NAT также могут влиять другие генетические факторы, такие как альтернативный сплайсинг и дифференциальное включение более чем одного промотора.
Ариламин N-ацетилтрансферазы отличаются от многих других ацетил-СоА-зависимых трансфераз, присутствующих в клетках, классическим «ping-pong» механизмом реакции (Weber, Cohen, 1967). Реакция проходит в два отдельных последовательных этапа. На первой стадии ацетил-СоА связывается с ферментом и ацетильная группа переносится от кофактора на цистеин активного центра (Cys для изоформ человека) фермента с образованием тиолового эфира, при этом происходит высвобождение кофермента А. Вторая стадия включает связывание субстрата с ацетилированным ферментом и последующий перенос ацетильной группы на аминогруппу субстрата с последующим высвобождением ацетилированного продукта. Первая стадия реакции может протекать независимо от присутствия субстрата (Riddle, Jencks, 1971). Обновление ацетилированного фермента в отсутствие субстрата протекает относительно медленно. Однако обновление фермента повышается в присутствии специфичного субстрата, тем самым, возможно, происходит изменение в равновесии от ацетилированнои к неацетилированной форме (Sinclair et al., 2000).
Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов
К настоящему времени для обнаружения полиморфных вариантов генов предложено много методов, в частности для обнаружения полиморфных вариантов генов NAT разные исследователи использовали аллель-специфичную ПЦР (Cascorbi et al., 2001), анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов (SSCP) (Lo-Guidice et al., 2000), аллель-специфичную гибридизацию на микрочипе (Глотов и др., 2005), ПЦР с детекцией в реальном времени (Fronhoffs et al., 2001) и даже прямое секвенирование ДНК (Lee et al., 2002). Однако в большинстве исследований используется метод ПДРФ-анализа (Deitz et al., 1997; Zheng et al., 1999; Borlak, Reamon-Buettner, 2006), поскольку он является доступным, достаточно быстрым и информативным методом, не требующим дорогостоящего оборудования. В литературе предложены способы выявления методом ПДРФ-анализа большинства описанных полиморфных вариантов генов M47/(Hickman, Sim, 1991; Bell et al., 1993; Cascorbi et al., 1995; Deitz et al., 1997; Lin et al., 1998; Leff et al., 1999), однако для некоторых вариантов, в том числе А1025 гена NAT1, не разработано способов их обнаружения. Нами предложено использовать эндонуклеазу Sse9I для обнаружения полиморфизма А1025, при наличии которого наблюдается исчезновение сайта узнавания (рис. 5). Как будет показано ниже, более предпочтительно обнаружение полиморфизма по появлению нового сайта узнавания при его наличии, но в данном случае анализ сайтов узнавания известных эндонуклеаз рестрикции показал отсутствие такой возможности.
Особенностью ПДРФ-анализа является то, что в случае детекции полиморфного варианта по исчезновению сайта узнавания метод позволяет определить мутационную изменчивость не в определенном положении, а в нескольких нуклеотидах, образующих сайт узнавания эндонуклеазы, без возможности определенно локализовать полиморфизм. Учитывая то, что полиморфизмы могут располагаться близко в первичной последовательности гена, более информативен случай, когда для их обнаружения подбирается эндонуклеаза рестрикции, для которой при наличии полиморфизма наблюдается не исчезновение, а появление нового сайта узнавания. Необходимость такого подхода в обнаружении полиморфных вариантов генов NAT стала очевидна после открытия новых полиморфизмов в непосредственной близости от ранее известных, например, С559Т, G560A гена NAT1, С190Т, G191A и G857A, Т859С, 859Del гена NAT2 (Ohsako, Deguchi, 1990; Bell et al., 1993; Hubbard et al, 1998; Shishikura et al, 2000; Anitha, Banerjee, 2003).
С тех пор, как было предложено использовать эндонуклеазу Mspl для обнаружения полиморфного варианта G191A гена NAT2 (Bell et al, 1993), во многих молекулярно-эпидемиологических исследованиях выявление полиморфизма G191A осуществляли именно этим способом (Meisel et al, 1997; Woolhouse et al, 1997; Gross et al, 1999). Обнаружение полиморфного варианта осуществляется по исчезновению сайта узнавания эндонуклеазы Mspl, который в интересующем регионе аллеля «дикого» типа затрагивает нуклеотиды 189-192. Недавно был открыт полиморфизм С190Т гена NAT2 в японской популяции в результате проведения прямого секвенирования единственного обнаруженного образца с Mspl-полиморфизмом, нехарактерным для этой популяции (Shishikura et al, 2000). Таким образом, часть образцов с выявленным Mspl-полиморфизмом могла содержать полиморфизм С190Т, что в свою очередь могло приводить к ошибочным результатам генотипирования. Полиморфизмы С190Т (Arg64Trp) и G191A (Arg64Gln) приводят к разным аминокислотным заменам, что выражается в разных функциональных проявлениях (Fretland et al, 2001; Zhu et al, 2002). Так как изменение картины образующихся фрагментов при гидролизе Mspl происходит при наличии полиморфизма как в положении 190, так ив 191, то эту эндонуклеазу рестрикции выгодно использовать в целях скрининга полиморфизмов для сокращения временных и материальных затрат. При наличии Mspl-полиморфизма предложенные нами способы с использованием эндонуклеаз рестрикции Bsell и Bst2UI позволят различить эти два полиморфизма (рис. 9). Если целью исследователя является выявление определенного полиморфизма, то оптимально будет использовать эндонуклеазу Bsell для выявления аллеля 190Т или Bst2UI для выявления аллеля 191 А. В исследованной нами выборке не обнаружено индивидуумов с Mspl-полиморфизмом, однако при исследовании популяций с высокой частотой Mspl-полиморфизма, например афро-американской (Bell et al., 1993), предложенный нами комплексный подход может иметь большое прикладное значение.
Аналогичная ситуация характерна для полиморфизмов G857A и Т859С, 859Del гена NAT2. В литературе для обнаружения полиморфизма G857A было предложено использовать эндонуклеазу рестрикции BamHI (Hickman, Sim, 1991). Для BamHI в последовательности аллеля «дикого» типа гена NAT2 имеется единственный сайт узнавания, который затрагивает нуклеотиды 856-861. После открытия полиморфизмов Т859С и 859Del (Anitha, Banerjee, 2003) стало ясно, что выявляемый при помощи эндонуклеазы BamHI аллель 857А (Meisel et ah, 1997; Woolhouse et ah, 1997; Gross et ah, 1999; Викторова и др., 2003), на самом деле может оказаться 859С или 859Deh Способ, позволяющий различать эти полиморфизмы с помощью ПДРФ-анализа, до настоящего времени не был разработан. Нами предложено проводить гидролиз исходных амплифицированных образцов с выявленным BamHI-полиморфизмом последовательно эндонуклеазами Hinfl и AspS9I (рис. 11). Последовательное использование эндонуклеаз рестрикции BamHI, Hinfl и AspS9I позволяет различить полиморфизмы G857A и Т859С, 859Del гена NAT2, однако различить полиморфизмы Т859С и 859Del при помощи известных эндонуклеаз рестрикции не представляется возможным. Если целью исследователя является выявление именно аллелей 857А, то оптимально будет использовать только эндонуклеазу Hinfl. В исследованной нами выборке обнаружен только полиморфизм G857A, что доказано последовательным гидролизом эндонуклеазами BamHI и Hinfl.
Таким образом, для точного типирования аллелей важно однозначное определение полиморфизма. В процессе работы разработаны способы однозначного определения полиморфизмов А752Т гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2 по появлению новых сайтов узнавания для эндонуклеаз рестрикции Bst4CI, Bsell и Hinfl, соответственно (рис. 6, 9 и 11).
Выявление полиморфизмов G857A, Т859С и 859Del гена NAT2
Открытие феномена индивидуальной чувствительности к канцерогенным воздействиям, обусловленной наследственными особенностями организма, способствовало пониманию процесса канцерогенеза как результата взаимодействия эндогенных и экзогенных факторов (Nature and Nurture) (Канцерогенез, 2004). Исследования в области эпидемиологии рака показали, что взаимодействие факторов образа жизни и окружающей среды с генетическими факторами является основной причиной развития 90-95% злокачественных опухолей человека (Регега, 1997; Brennan, 2002). Значение ФБК в онкологической патологии обусловлено их участием в процессах детоксификации и активации поступающих в организм (про )канцерогенов (Nebert, 1999; Williams, 2001; Cascorbi et al., 2002). Полиморфизм генов ФБК может приводить к дисбалансу процессов детоксификации/токсификации ксенобиотиков вследствие изменения активности ферментов. Переход от исследования связи между изучаемым фактором и населением к связи между изучаемым фактором и конкретным человеком, который заболеет или заболел раком, возможен с помощью методов аналитической эпидемиологии, к которым относят исследование методом «случай-контроль» (Флетчер и др., 1998). Результаты такого исследования обычно выражаются в показателях отношения шансов (ОШ), что является математическим выражением степени вероятности развития заболевания в результате воздействия определенного фактора.
В нашем исследовании, построенному по типу «случай-контроль», мы проводили поиск ассоциаций полиморфных вариантов С282Т, С481Т, G590A, A803G и G857A гена NAT2, для которых частота встречаемости полиморфного аллеля была более 1%, с самым распространенным злокачественным заболеванием - раком легкого. К настоящему времени в доступной литературе опубликовано шестнадцать работ, посвященных исследованию ассоциаций полиморфизма NAT2 с риском развития рака легкого (Borlak, Reamon-Buettner, 2006). Опубликованные результаты противоречат друг другу, при этом для европеоидной популяции в большей части исследований не обнаружено достоверных ассоциаций с раком легкого (Martinez et al., 1995; Bouchardy et al., 1998; Nyberg et al., 1998; Hou et al., 2000). В большинстве работ по исследованию ассоциаций полиморфизма гена NAT2 с раком легкого аллели, ведущие к фенотипу медленного ацетилятора, объединяли в одну группу, при этом анализ по отдельным полиморфным вариантам не проводился (Hou et al., 2000; Нои et al., 2001; Wikman et al., 2001; Borlak, Reamon-Buettner, 2006). В работе Cascorbi I. et al. (1996) при анализе ассоциаций отдельных полиморфных вариантов гена NAT2 с раком легкого, как и в нашем исследовании (табл. 13), не обнаружено достоверных ассоциаций.
Опыт молекулярно-эпидемиологических исследований показывает, что сила ассоциации признака с заболеванием в объединенных группах может быть слабой и не достигать уровня достоверности вследствие разнонаправленных эффектов многих неучтенных факторов (Garte, 2001). Поэтому нами был выполнен анализ распределения частот аллелей и генотипов гена NAT2 с учетом фактора курения и пола. В результате проведенного анализа было выявлено, что аллель 803 G ассоциирован с устойчивостью к раку легкого, а «дикий» генотип 803АА ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого у мужчин, в том числе курящих (табл. 15 и 16). Связь с полом была показана в двух исследованих: в одном фенотип медленного ацетилятора был ассоциирован с повышенным риском у некурящих китайских женщин (Seow et al., 1999), в другом исследовании (Chiou et al., 2005) было показано, что фенотип быстрого ацетилятора ассоциирован с повышенным риском развития рака легкого у некурящих китайских женщин, при этом для мужчин не было обнаружено достоверных ассоциаций.
В литературе имеются данные, что существуют различия в значении и спектре предрасполагающих факторов для рака легкого разных гистологических типов (Трахтенберг, Чиссов, 2000), однако в нашем исследовании не было обнаружено достоверных ассоциаций с риском развития рака легкого при учете гистологического типа опухоли (табл. 17). Возможно, отсутствие достоверных ассоциаций обусловлено тем, что лишь у 44 больных раком легкого был установлен гистологический тип опухоли. Поэтому дальнейший поиск ассоциаций с раком легкого в зависимости от гистологического типа опухоли должен быть направлен на увеличение исследуемых подгрупп.
К сожалению, изменения в процессах биотрансформации различных ксенобиотиков, вызванные отдельными полиморфизмами соответствующих генов остаются малоизученными, поэтому далеко не всегда можно предложить метаболические механизмы, объясняющие наблюдаемые ассоциации полиморфного варианта с предрасположенностью к заболеванию. Так для NAT2 изучены кинетические параметры реакции ацетилирования в отношении лишь нескольких субстратов для некоторых аллозимов (Hickman et al., 1995), но уже эти результаты показывают, что активность может меняться противоположным образом в отношении разных субстратов.
В нашем исследовании выявлены достоверные ассоциации полиморфного варианта A803G с раком легкого в подгруппе мужчин, в том числе курящих (табл. 15 и 16). Полиморфизм A803G приводит к замене Lys268Arg в аминокислотной последовательности белка, но в дрожжевой экспрессионной системе не выявлено отличий для соответствующего аллозима от белка «дикого» типа в отношении двух субстратов (сульфадимезина и 2-аминофлуорена) (Fretland et al., 2001). Однако на примере исследований функциональных проявлений других полиморфизмов гена NAT2 можно предположить изменение активности в отношении еще неисследованных субстратов, в том числе (про-)канцерогенов. Кроме того, исследования аллозимов, проведенные в экспрессионных системах бактерий или дрожжей, лишь в некоторой степени отражают реальные процессы созревания и функционирования белков, имеющие место в клетках млекопитающих. Нельзя также исключить вероятность того, что полиморфизм A803G находится в сцеплении с другим функциональным признаком, который ассоциирован с раком легкого.
Известно, что различные сочетания полиморфизмов имеют результатом разнообразие функциональных проявлений (Butcher et al., 2002). Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований показывают изменение силы ассоциаций комбинаций генотипов со многими заболеваниями в сравнении с индивидуальными генотипами. Частота встречаемости комбинаций генотипов гена NAT2 варьирует в широких пределах (Brockmoller et al., 1996; Barrett et al., 2003), поэтому в нашем исследовании был проведен анализ ассоциаций комбинаций генотипов полиморфных вариантов гена NAT2 с раком легкого.
Оптимизация набора эндонуклеаз рестрикции для выявления полиморфных вариантов генов NAТ методом ПДРФ-анализа
В работе Wikman S. et al. (2001) при анализе комбинаций генотипов NAT2 по четырем исследованным полиморфизмам (Т481С, G590A, A803G и G857A) не обнаружено достоверных ассоциаций с раком легкого. Также в работе Borlak J., Reamon-Buettner S.M. (2006) не обнаружено ассоциаций для комбинаций генотипов трех исследованных полиморфизмов (Т481С, G590A и G857A). Однако Cascorbi I. et al. (1996) выявили достоверную ассоциацию комбинаций «диких» гомозигот по семи исследованным полиморфным вариантам гена NAT2 (G191A, С282Т, Т341С, Т481С, G590A, A803G и G857A) с предрасположенностью к раку легкого (ОШ = 2.36; р = 0.018), при этом для других комбинаций генотипов достоверных ассоциаций обнаружено не было.
Результаты собственных и приведенных выше исследований свидетельствуют о том, что на определенных территориях, под воздействием присущего им спектра (про-)канцерогенных веществ, на предрасположенность к раку легкого будут влиять определенные комбинации генотипов. У европеоидов г. Новосибирска комбинации генотипов 282CC/590GG/481 ТС/803 AA/857GG, 282TC/590AG/481CC/803GA/857GG, 481 ТС/803АА, 282CC/590AG и 481CC/803GA, а также индивидуальный полиморфизм (A803G) могут оказать влияние на предрасположенность к раку легкого. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности дальнейшего изучения полиморфизма генов, вовлеченных в патогенез заболевания.
Молекулярно-биологические исследования мультифакторных заболеваний являются самостоятельным направлением в геномике человека и на сегодняшний день составляют часть фундаментальной науки, от успехов которой зависит клиническая практика. В современных исследованиях мультифакторных заболеваний, к которым относятся и онкологические заболевания, широко используется подход кандидатных генов, основанный на исследовании ассоциаций полиморфных вариантов генов, продукты которых потенциально вовлечены в развитие и регуляцию тех или иных звеньев патогенеза заболевания.
Для выявления подобных ассоциаций используют методы аналитической эпидемиологии, наиболее распространенными из которых являются когортные исследования и менее трудоемкие, но достаточно надежные исследования «случай-контроль». В настоящей работе было проведено исследование, построенное по типу «случай-контроль», направленное на поиск возможных ассоциаций распространенных полиморфных вариантов генов ариламин N-ацетилтрансфераз, принадлежащих системе ферментов биотрансформации ксенобиотиков, с раком легкого. В основу поиска связи легли данные о роли ацетилирования в метаболической активации и детоксикации (про-)канцерогенов, принадлежащих к гетероциклическим и ароматическим аминам, а также данные об изменении кинетических параметров реакции ацетилирования вследствие наличия полиморфизмов в транслируемой последовательности генов NAT, что приводит к изменению баланса процессов активации/детоксификации. Изменение баланса процессов активации/детоксификации (про-)канцерогенов в свою очередь играет важную роль на стадии инициации процесса канцерогенеза.
Полиморфные варианты исследованных генов выявлялись при помощи широко использующегося в молекулярно-эпидемиологических исследованиях метода ПДРФ-анализа. В ходе выполнения работы было проведено усовершенствование методической стороны выявления полиморфных вариантов генов NAT, направленное на безошибочную и точную локализацию выявляемых полиморфизмов, а также различение полиморфизмов, расположенных в непосредственной близости друг от друга. В результате были предложены способ выявления полиморфизма А1025 гена NATI, а также способы однозначного определения полиморфизмов А752Т гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2 методом ПДРФ-анализа. Также разработаны способы, позволяющие различать полиморфизмы С190Т и С191А; G857A и Т859С, 859Del гена NAT2 методом ПДРФ-анализа, что важно в свете уже имеющихся данных о разных функциональных проявлениях этих полиомрфизмов.
Полученное распределение частот встречаемости исследованных шести полиморфизмов гена NAT1 и двенадцати полиморфизмов NAT2 у европеоидов г. Новосибирска оказалось близко таковому в других популяциях европеоидов.
Выявляемые в ходе молекулярно-эпидемиологических исследований ассоциации между полиморфными вариантами генов ФБК и онкологическими заболеваниями, скорее всего, имеют небольшое значение для отдельного индивидуума в плане риска возникновения рака, но могут иметь большое значение в популяции в силу широкой распространенности некоторых полиморфизмов. Поэтому нами было проведено исследование ассоциаций с раком легкого только для пяти полиморфизмов NAT2, для которых характерна высокая частота встречаемости у европеоидов. Высокая частота встречаемости этих полиморфизмов свидетельствует о целесообразности их исследования и, скорее всего, об отсутствии связанного с ними высокого риска с заболеваниями. Однако в определенных условиях окружающей среды и/или в определенных подгруппах такие полиморфные варианты могут быть факторами риска или устойчивости. К настоящему времени показано, что полиморфизм ацетилирования вносит вклад ь риск возникновения таких онкологических заболеваний, как рак мочевого пузыря и рак толстой кищки. В отношении других онкологических заболеваний, в том числе рака легкого, результаты исследований противоречат друг другу. В нашем исследовании было обнаружено, что аллель 803G гена NAT2 у мужчин ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. При существующем уровне знаний функциональных проявлений отдельных полиморфных вариантов генов ФБК, и в частности гена NAT2, а также понимания механизмов канцерогенеза, сложно предположить определенный метаболический механизм, лежащий в основе полученных ассоциаций.
В результате проведенного анализа ассоциаций комбинаций генотипов гена NAT2 с раком легкого были выявлены комбинации, ассоциированные с устойчивостью к раку легкого (282TC/590AG/481CC/803GA/857GG, 282CC/590AG и 481CC/803GA), а также комбинации генотипов, ассоциированные с предрасположенностью к раку легкого (282CC/590GG/481 ТС/803AA/857GG и 481 ТС/803АА). В мировой популяции превалируют гаплотипы «СА» и «TG» полиморфных вариантов С481Т и A803G и гаплотипы «CG» и «ТА» полиморфных вариантов С282Т и G590A гена NAT2. Ассоциации с раком легкого обнаружены для редких комбинаций, в которых присутствуют гаплотип «CG» и «ТА» полиморфных вариантов С481Т и A803G и гаплотип «СА» полиморфных вариантов С282Т и G590A гена NAT2. Выявленные нами ассоциации являются отправной точкой дальнейших углубленных исследований метаболических проявлений полиморфизмов. Кроме того, они являются стимулом для дальнейших расширенных исследований роли NAT в механизмах канцерогенеза.
