Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Центры организации МТ и регуляция динамики МТ систем в ходе деления клеток растений 10
1.2. Механизмы формирования веретена деления в животных клетках 13
1.3. Динамика цитоскелета и механизмы формирования веретена деления в различных типах растительных клеток 14
1.3.1. Клетки, имеющие клеточную стенку 15
1.3.2. Бесстеночные клетки 16
1.4. Организация полюсов веретена деления в растительной клетке 24
1.5. Динамика микротрубочкового цитоскелета в организации цитокинеза растительной клетки 27
1.5.1. Фрагмопласт в соматических клетках 28
1.5.2. Фрагмопласт в материнских клетках пыльцы 29
1.5.3. Роль МТ цитоскелета в пространственной регуляции цитокинеза 33
1.6. Молекулярные механизмы организации микротрубочкового цитоскелета в ходе клеточного деления 34
1.6.1. Структурные белки 34
1.6.2. Моторные белки 3 7
1.7. Трансгенные растения как модель для изучения динамики цитоскелетного цикла 40
1.8. Роль актинового цитоскелета в делении растительной клетки 42
1.9. Заключение 45
Глава 2. Материалы и методы 47
Глава 3. Результаты и обсуждение 52
3.1. Общая схема цитоскелетного цикла в нормальном мейозе растений табака 52
3.1.1. Цикл реорганизации цитоскелета в первом делении мейоза 55
3.1.2. Цикл реорганизации цитоскелета во втором делении мейоза 57
3.1.3. Системные структуры цитоскелета в материнских клетках пыльцы табака 59
3.1.4. Механизмы реорганизации и взаимодействия микротрубочковых пучков в ходе цитоскелетного цикла в материнских клетках пыльцы табака 62
3.2. Динамика микротрубочкового цитоскелета в материнских клетках пыльцы у трансгенных растений табака при различных аномалиях мейоза 69
3.2.1. Цитомиксис в материнских клетках пыльцы 69
3.2.2. Преждевременный цитокинез 81
3.2.3. Деформация ядер в профазе второго деления мейоза. 87
3.2.4. Аномалии положения веретен второго деления 96
3.2.4.1. Особенности реорганизации микротрубочкового цитоскелета при формировании аномального положения веретен 103
3.2.4.2. Особенности реорганизации цитоскелета при формировании слитных веретен 108
Заключение 111
Выводы 117
Список публикаций по теме диссертации 118
Список цитируемой литературы 120
- Центры организации МТ и регуляция динамики МТ систем в ходе деления клеток растений
- Трансгенные растения как модель для изучения динамики цитоскелетного цикла
- Механизмы реорганизации и взаимодействия микротрубочковых пучков в ходе цитоскелетного цикла в материнских клетках пыльцы табака
- Особенности реорганизации микротрубочкового цитоскелета при формировании аномального положения веретен
Введение к работе
Актуальность проблемы. Микротрубочковый цитоскелет играет исключительно важную роль в таком фундаментальном биологическом процессе, как клеточное деление. В клетках растений цитоскелет представлен различными системами микротрубочек (МТ), поочередно сменяющими друг друга в ходе клеточного деления. К таким системам относятся кортикальные и радиальные пучки, препрофазное кольцо, веретено и фрагмопласт (Mineyuki, 2007). Структура этих основных конфигураций цитоскелета изучена достаточно хорошо, однако их происхождение, механизмы образования и способы перехода из одной конфигурации в другую все еще не вполне понятны и остаются предметом дискуссий (Murata, Hasebe, 2007).
Динамика цитоскелета в ходе деления эукариотической клетки осуществляется центрами организации микротрубочек (ЦОМТ), особыми морфологическими структурами, которые служат затравками для полимеризации микротрубочек. В клетках животных ЦОМТ сконцентрированы в центросомах, специализированных морфологических структурах, регулирующих динамику микротрубочек на субклеточном уровне, что позволяет довольно легко наблюдать перестройки цитоскелета в ходе клеточного цикла (Мамон, 2008). В клетках высших цветковых растений центросома не идентифицирована как самостоятельная морфологическая структура, а ЦОМТ сконцентрированы на поверхности ядерной оболочки, что в значительной степени затрудняет изучение динамики цитоскелета на тех стадиях клеточного цикла, где ядерная оболочка отсутствует. Несмотря на значительный фактический материал, накопленный к настоящему времени по динамике микротрубочкового цитоскелета в ходе клеточного цикла растений, остаются значительные пробелы в понимании этого процесса на всех уровнях его организации (Chan, Cande, 1998; Smirnova, Bajer, 1998; Shamina, 2005; Murata, Hasebe 2007). В частности, это относится к пониманию структурно-морфологических основ реорганизации цитоскелета, изучение которых осложняется его деполимеризацией на некоторых переходных этапах цикла, что в большинстве случаев не позволяет представить динамику МТ систем в виде непрерывного процесса. В результате этого механизмы, регулирующие перестройки цитоскелета в ходе клеточного цикла растений, до сих пор не вполне понятны, а их изучение остается важнейшей задачей клеточной биологии. Одним из подходов к решению этой задачи является анализ возможно большего количества разнообразных аномалий цитоскелетного цикла и выявление детальной картины морфологических преобразований цитоскелета, происходящих во время деления растительной клетки.
В настоящее время для решения целого ряда задач, связанных с изучением процессов клеточного деления, в том числе и для исследования цикла реорганизации микротрубочкового цитоскелета, активно используют мейотическое деление в материнских клетках пыльцы. Использование трансгенных растений в качестве источника аномалий мейоза и модели для изучения процессов клеточного деления, на наш взгляд, имеет ряд преимуществ, по сравнению с традиционными источниками, такими как отдаленная гибридизация, анеу- и полиплоидия, гаплоидия, мейотические мутации. Это связано с возникновением у них мутационной изменчивости различной природы (инсерционной и сомаклональной), а также с потенциальной возможностью поиска и клонирования мутантных генов (Latham et al., 2006).
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования является изучение цикла микротрубочкового цитоскелета в материнских клетках пыльцы табака посредством сравнительного анализа этапов его реорганизации в ходе нормального и аномального мейоза.
Задачи исследования:
Изучить структурную организацию и динамику микротрубочкового цитоскелета в ходе нормального мейоза в МКП растений табака.
Выявить механизм формирования и реорганизации систем микротрубочек, функционирующих в процессе построения веретена деления.
Провести цитологический скрининг аномалий микроспорогенеза у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом.
Установить феноменологическую связь выявленных аномалий мейотического деления с микротрубочковым циклом.
Научная новизна и практическая ценность работы.
Детальный цитологический анализ трансгенных растений табака с мутантным фенотипом позволил выявить сложный комплекс нарушений мейотического деления, такие как цитомиксис, внеплановая активация цитокинеза после первого деления, образование деформированных ядер в профазе 2, изменение ориентации веретен в метафазе второго деления мейоза.
Методом иммунофлюоресцентного анализа детально исследован нормальный и аномальный цикл динамики микротрубочкового цитоскелета в МКП растений табака. Цикл цитоскелета представлен в виде непрерывного процесса реорганизации одной микротрубочковой системы в другую. Установлено, что нарушение процессов цитоскелетного цикла, таких как соединение и разъединение (+)-концов микротрубочек на стадии формирования и разборки неподвижного фрагмопласта, приводит к изменению положения телофазных ядер и, в дальнейшем, к нарушению позиций веретен второго деления. Показано, что для формирования веретена деления необходимым является этап элонгации микротрубочковых пучков на стадии перехода от перинуклеарной системы к веретену деления. На основании структурно-морфологического анализа профазной реорганизации цитоскелетных структур в ходе нормального и аномального мейоза предложена «outside-in» (по направлению к хромосомам) модель формирования фибрилл веретена деления в МКП табака. Это противоречит существующему на сегодняшний день представлению о том, что фибриллы веретена деления в мейоцитах формируются посредством «inside-out» (по направлению от хромосом) механизма. Впервые исследована структура и динамика микротрубочкового цитоскелета в цитомиктичных клетках. Установлено, что микротрубочковый цитоскелет не участвует в процессе межклеточных перемещений ядерного материала. Исследован механизм преждевременного цитокинеза в аспекте динамики микротрубочкового цитоскелета. Показано, что причиной разобщения временной координации между карио- и цитокинезом является не аномальная динамика цитоскелетных структур, а «внеплановая» активация сигнала, обуславливающего запуск процесса образования плазматической мембраны.
Практическая ценность данной работы заключается в создании схемы, отражающей общие принципы реорганизации микротрубочкового цитоскелета, характерные для мейоза двудольных растений. Впервые предложен механизм взаимной ориентации веретен второго деления мейоза, в основе которого лежит поворот ядер в профазе 2 и корректная динамика микротрубочкового цитоскелета на этапе перехода от радиальной системы в телофазе 1 к перинуклеариой в профазе 2. Отобраны линии трансгенных растений табака с высоким уровнем цитомиксиса, являющиеся удобной моделью для дальнейшего изучения этого явления. В целом, исследованные трансгенные растения табака с аномальным мейозом представляют большой интерес для изучения структуры и динамики актинового цитоскелета в МКП.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах: - международный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», Москва (18-21 ноября) - Минск (22-24 ноября) 2001 г. (доклад удостоен второй премии); - 1-й международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, 14-18 октября 2002 г.; - международный симпозиум по проблеме мейоза, Санкт-Петербург, 17 октября 2003 г.;
Ш-я международная конференция «Проблема вида и видообразования», Томск, 20-22 октября 2004 г.; международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 24-26 ноября 2004 г.; молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, 16-23 сентября 2005 г.; VIII съезд Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, Алушта, 24-28 сентября 2007 г. - V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-27 июня 2009 г.
Материалы диссертационной работы представлялись в устных докладах на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2001, 2004, 2008 гг.
Работа была поддержана отечественными грантами:
РФФИ (№ 00-04-49557) «Молекулярно-генетические механизмы функционирования чужеродных генов в геноме трансгенных растений» (исполнитель);
РФФИ (№ 01-04-06341-мае) Программа поддержки молодых ученых (для проекта 99-
04-49324) (руководитель);
РФФИ (№ 02-04-06598-мас) Программа поддержки молодых ученых (для проекта 02-
04-49295) (руководитель);
РФФИ (№ 02-04-49295-а) «Молекулярно-генетический анализ Т-ДНК индуцированной изменчивости у трансгенных растений табака» (исполнитель);
РФФИ (№ 05-04-48925-а) «Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений: изучение районов интеграции Т-ДНК инсерций в ядерный геном» (исполнитель);
РФФИ (№ 08-04-01046-а) «Изучение особенностей цитомиксиса на примере трансгенных растений табака с мутантным фенотипом» (исполнитель);
Грантом Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (№ 00-15-97968) «Особенности преобразования геномов и функционирование генов в процессе хромосомной и генной инженерии растений» (исполнитель);
Программой РАН (№ 25.8) «Динамика генофондов растений, животных и человека», направление: «Фундаментальные проблемы трансгенеза растений и животных» (исполнитель).
Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 137 страницах, содержит 21 рисунок и 7 таблиц. Список литературы включает 219 источников.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность Дейнеко Елене Викторовне, руководителю диссертационной работы, а также коллегам по работе: Загорской А.А., Филипенко Е.А, Пермяковой Н.В., Маренковой Т.В., за поддержку и понимание. Автор признателен Дороговой Н.В. и Шаминой Н.В. за помощь в освоении метода иммунофлюоресцентного анализа тубулинового цитоскелета растительной клетки и за ценные советы при подготовке диссертационной работы.
Центры организации МТ и регуляция динамики МТ систем в ходе деления клеток растений
Согласно современным представлениям перестройки тубулинового цитоскелета в клетках определяются особыми морфологическими структурами - центрами организации МТ (ЦОМТ). Клетка может формировать новые микротрубочки только в месте расположения ЦОМТ, которые служат структурной матрицей (затравкой), определяющей количество протофиламентов для формирования нормальной микротрубочки, устанавливают полярность формирующейся микротрубочки и отвечают на сигналы клеточного цикла, регулирующие полимеризацию и деполимеризацию микротрубочек (Mark, 1997).
В клетках животных ЦОМТ ассоциированы с центросомами, которые состоят из центриолей, окруженных аморфным перицентриолярным материалом (Murphy, Stearns, 1996; Urbani, Stearns, 1999; Мамон, 2008). В клетках низших растений функции центросом могут выполнять бесцентиролярные структуры, такие как пластиды или полюсные организаторы (Shimamura et al, 2004). Благодаря тому, что эти структуры морфологически хорошо выражены, их функцию в регуляции динамики микротрубочкового цитоскелета сравнительно легко наблюдать. В клетках высших растений центросомы не идентифицированы в качестве морфологических структур. В связи с этим на сегодняшний день существует две взаимоисключающие , гипотезы, касающиеся существования растительной центросомы. Одной из них является гипотеза «гибкой центросомы», в соответствии с которой в растительной клетке предполагается присутствие рассеянных в цитоплазме множественных ЦОМТ, соединенных между собой гипотетической линейной структурой (Mazia, 1987). Изменение конфигурации этой структуры на разных стадиях клеточного цикла, предположительно, обеспечивает формирование различных конфигураций цитоскелета. Несмотря на то, что данные по динамике МТ цитоскелета в некоторых случаях косвенно подтверждают эту гипотезу, прямого экспериментального доказательства существования такой гипотетической структуры, как «гибкая центросома», не было получено (Chan et al., 2003).
Другая гипотеза состоит в том, что растительные клетки не имеют структур, подобных центросомам клеток животных. Динамика цитоскелета в них осуществляется посредством перемещения в цитоплазме стабильных пучков МТ и их самосборки в различные конфигурации (Smirnova, Bajer, 1992). Роль ЦОМТ в данном случае выполняют центры конвергенции микротрубочек (ЦКМТ) (Smirnova, Bajer, 1994, 1998). По своей морфологии ЦКМТ представляют пучки МТ, (-)-концы которых конвергированы, а (+)-концы расходятся в стороны, что придает этим пучкам веерообразную форму (Bajer, Mole-Bajer 1986; Smirnova, Bajer, 1994, 1998). Предполагается, что они могут взаимодействовать друг с другом посредством двух процессов, конвергенции (-)-концов МТ и латерального взаимодействия, что и служит причиной формирования новых конфигураций цитоскелета.
Для понимания принципов функционирования ЦОМТ в клетках растений важно знать, имеют ли они сходный молекулярный состав с ЦОМТ в клетках животных? Эволюционная консервативность этих структур могла бы в значительной степени способствовать их изучению у растений.
Основным компонентом ЦОМТ в клетках животных является специальный класс тубулиновых молекул, у-тубулин, располагающийся на (-)-конце МТ и выполняющий матричную функцию при их полимеризации. Комплекс из 13 (по числу протофиламентов, составляющих микротрубочку) молекул у-тубулина соединен со структурными белками и организован в виде кольца (Schmit, 2002). Эти кольцевые структуры служат затравками для присоединения димеров а- и р-тубулина, самосборки МТ, а также обеспечивают их определенную пространственную ориентацию в клетке. Несмотря на то, что в состав ЦОМТ в клетках животных могут входить до 100 различных белков, минимальной единицей, способной к полимеризации новой МТ, является комплекс, состоящий из у-тубулиновой матрицы и всего двух белков Spc97p и Spc98p (Schmit, 2002).
Отсутствие морфологически детектируемых центросом позволяет предположить, что в клетках высших растений ЦОМТ локализованы на каких-либо других структурах. Крупнейшей системой центров организации микротрубочек в растительной клетке является поверхность ядерной оболочки (Meier, 2001, 2007; Rose et al., 2004). Это утверждение базируется на результатах различного рода исследований, в том числе на результатах иммуно-цитохимического анализа морфологии МТ цитоскелета, с помощью которого было выявлено возрастающее связывание антител к тубулину в перинуклеарной области на определенных стадиях клеточного цикла (De Mey et al., 1982). Эксперименты по микроинъекции меченого тубулина в живые клетки и помещение изолированных ядер в раствор неполимеризованного тубулина подтвердили полимеризацию новых микротрубочек на поверхности ядерной оболочки (Vantard et al., 1990; Stoppin et al., 1994).
Исследование у-тубулина ЦОМТ в делящихся растительных клетках с помощью методов иммуноцитохимии также показало, что в отличие от животных клеток он равномерно распределен вдоль микротрубочек во всех системных структурах цитоскелета: кортикальных спиралях, препрофазном пучке, прометафазном веретене, фрагмопласте, а также на кинетохорах изолированных хромосом высших растений и в кортикальной зоне цитоплазмы. Но ни в одном из проведенных исследований у-тубулин не выявлялся в области полюсов растительного веретена (Canaday et al., 2000; Шамина, Дорогова, 2004). Эти результаты еще более усложнили проблему природы ЦОМТ и регуляции динамики цитоскелета в растительной клетке (Mark, 1997). Следует отметить, что в клетках растений было показано наличие и других белков, гомологичных центросомальным белкам клеток животных. Однако эти белки, также как и у-тубулин, не выявлялись в области полюсов веретена деления, и их роль в организации микротрубочек цитоскелета здесь не вполне понятна (Шамина, Дорогова, 2004).
В ходе деления растительной клетки цитоскелет проходит через серию резко отличающихся друг от друга конфигураций. Учитывая отсутствие морфологически оформленных центросомальных структур, особое значение с точки зрения перестроек цитоскелета в различные конфигурации в данном случае приобретает мобильность ЦОМТ. При использовании белка ЕВ1 в качестве маркера (-)-конца МТ была установлена способность совершать линейные и циклические движения ЦОМТ, локализованными на поверхности ядерной оболочки (Chan et al, 2003, 2005).
Исследование распределения у-тубулина, как основного компонента ЦОМТ в клетках, позволило выявить его специфическую миграцию в зависимости от фаз клеточного деления, являющуюся уникальной для растений и не встречающуюся в клетках животных, имеющих центросому (Brown, Lemmon, 2007). Выделяют несколько волн миграции у-тубулина в митозе. Так, было показано, что при переходе клетки от интерфазы к профазе распределенный вокруг ядра у-тубулин концентрируется в виде диффузных образований на противоположных полярных районах ядерной оболочки. Однако к метафазе он исчезает из полюсных районов и распределяется вдоль фибрилл веретена. Следующая волна миграции у-тубулина наблюдается в анафазе при его движении в направлении полюсов, где он образует концентрированные группы. В телофазе у-тубулин перемещается из анафазной позиции в интерзону между двумя группами хромосом, где ассоциируется с МТ фрагмопласта (Brown, Lemmon, 2007).
Трансгенные растения как модель для изучения динамики цитоскелетного цикла
Мутации являются традиционным инструментом для комплексного изучения внутриклеточных процессов на уровне молекулярных механизмов и генетического контроля. В настоящее время коллекции, использующиеся для этих целей, постоянно пополняются, в том числе и за счет привлечения различных методов трансгенеза.
В основе создания трансгенных растений лежат технологии переноса и интеграции в геном растения фрагментов экзогенной ДНК в виде искусственно созданных генетических конструкций, которые включают в себя, как правило, целевой ген, а также ген селективного доминантного маркера или репортерный ген. Последние служат для отбора трансформантов в процессе получения трансгенных растений. Использование специфических генетических конструкций наряду с особенностями процесса трансформации делают возможным индукцию мутаций у трансгенных растений различной генетической природы.
Попадание инсерций экзогенной ДНК в функционально значимые районы растительного генома может приводить к изменению функционирования генов, локализованных в области инсерций, то есть к появлению Т-ДНК индуцированных или инсерционных мутаций. Возможность образования мутаций таким путем подтверждена в целом ряде экспериментальных работ (Дейнеко и др., 2007; Latham et al., 2006). Мутации, выделенные среди трансгенных растений, имеют огромное преимущество перед мутациями, полученными методами классической генетики. Нарушая, подобно мобильным генетическим элементам, экспрессию генов, локализованных в месте инсерций, экзогенная ДНК маркирует область расположения гена и, тем самым, открывает возможность поиска с помощью инсерций уникальных генов растений и их клонирования (Azpiroz-Leehan, Feldmann 1997; Bai et al., 1999; Ежова и др., 2003).
Спектр инсерционных мутаций, выявленных у трансгенных растений, чрезвычайно широк (Дейнеко и др., 2007). Среди огромного числа этих мутаций выявлено не так много тех, которые специфически влияют на процессы клеточного деления, и в том числе на динамику МТ цитоскелета (таблица 2).
Это свидетельствует о том, что, хотя возможности использования Т-ДНК индуцированных мутаций в исследовании процессов реорганизации цитоскелета достаточно велики, этот потенциал не всегда используется рационально. В большей части случаев (таблица 2) этот аспект вообще не рассматривается, а если такой цитологический анализ и проводится, то он ограничивается лишь констатацией факта нарушений основных цитоскелетных структур, таких, например, как веретено деления, не вскрывая конкретных причин их появления. Так, при анализе мутации synl А. thaliana, первичным цитологическим эффектом которой было нарушение структуры хромосом, были обнаружены также и аномалии в конвергенции полюсов веретена в первом делении мейоза и нарушение их взаимной ориентации во втором делении (Peirson et al., 1996; Bai et al., 1999). С использованием метода фиксации по Навашину в фенотипе res91 трансгенных растений N. tabacum был выявлен ряд аномалий мейоза, на основании которых сделаны выводы о нарушении функций и динамики микротрубочкового цитоскелета (Шамина и др., 2000). Однако детализации динамики МТ цитоскелета в описанных выше фенотипах проведено не было, и первичный морфологический эффект этих нарушений неизвестен.
Из представленных в таблице 3 списка мутаций только для одной установлен первичный морфологический эффект, связанный непосредственно с нарушением динамики МТ цитоскелета, и выявлен продукт мутантного гена. Так, у инсерционного мутанта tes (tetraspore) A. thaliana наблюдалось частичное или полное отсутствие радиальной системы МТ после второго деления мейоза, в результате чего клеточные стенки не строились, и все четыре гаплоидных ядра по завершении делений оставались в общей цитоплазме (Spielman et al., 1997). Установлено, что tes-ren кодирует один из растительных белков - кинезинов, участвующих в транспорте вдоль микротрубочек и необходимых для их полимеризации/деполимеризации (Yang et al., 2003). Данная мутация A. thaliana наследовалась как рецессивная, а экспрессия гена tes детектировалась во всех тканях пыльника еще до начала мейоза. Данный факт свидетельствует о том, что цитокинез в мейозе находится под контролем спорофита. Интересно отметить, что аналог данного инсерционного мутанта, с точно таким же нарушением цитокинеза был получен у A. thaliana с помощью у-облучения (Hulskamp et al., 1997).
В клетках растений цитоскелет представляет собой интегрированную систему, в состав которой входят не только тубулиновые микротрубочки, но и актиновые микрофиламенты (МФ). В цитоплазме клеток молекулы актина формируют полярные фибриллы толщиной около 6 нм, которые, подобно микротрубочкам организуются в системы различной конфигурации в зависимости от типа клеток и фазы клеточного цикла. Так, в интерфазе соматических клеток актиновые нити занимают пространство между ядром и плазматической мембраной и образуют три различных, но взаимосвязанных системы: тонкую периферическую сеть, прилегающую к плазматической мембране; крупные тяжи в субкортикальном слое цитоплазмы, вытянутые вдоль длинной оси клетки; и перинуклеарную систему филаментов (Seagull, Falconer 1987; Staiger, Schliwa, 1987). Все эти интерфазные системы актинового цитоскелета полностью исчезают с началом клеточного деления и восстанавливаются после реформации ядерной оболочки дочерних клеток. В клетках эндосперма и МКП в интерфазе МФ представляют собой густую сеть свободных пучков, располагающуюся между ядром и плазматической мембраной, и концентрирующуюся вокруг ядра в течение профазы (Staiger, Schliwa, 1987; Traas et al., 1989; Staiger, Cande, 1991). Особенностью МКП является то, что в них интерфазная ретикулярная система F-актина, особенно в кортикальном слое цитоплазмы, частично сохраняется в ходе всего мейотического деления (Traas et al., 1989; Staiger, Cande, 1991; Dinis, Mesquita, 1993).
Показано, что актиновые МФ формируются в тесной ассоциации с микротрубочковыми пучками основных цитоскелетных структур, таких как ППК, профазная система МТ, веретено деления, фрагмопласт, и, практически, повторяют их конфигурацию. То есть, локализация и ориентация МФ зависит от расположения МТ. Именно поэтому при разрушения МТ в результате воздействия каких-либо внешних факторов (холод, химические вещества) распадается и актиновая составляющая цитоскелета (Palevitz, 1987; Traas et al., 1989; Staiger, Cande, 1991; Yasuda et al., 2005; Yu et al., 2006).
Следует отметить, что при переходе клетки к делению динамика МФ как в митозе, так и в мейозе оказывается весьма схожей. Так, в прометафазе - метафазе МФ перераспределяются параллельно МТ фибриллам веретена деления и интегрируются в него. В результате этого система МФ приобретает форму веретена, а в соматических клетках даже образует вокруг митотического аппарата своеобразный эластичный «чехол» (Yasuda et al., 2005; Yu et al., 2006). В метафазе и ранней анафазе обнаружено два различных типа МФ. Один из них представлен в виде нитей, совпадающих по направлению с МТ веретена деления, а другой сконцентрирован на его полюсах (Traas et al., 1989; Staiger, Cande, 1991; Dinis, Mesquita, 1993; Yasuda et al., 2005). После сегрегации хромосом в анафазе F-актин заполняет всю экваториальную зону веретена в виде двух слоев противоположно направленных МФ, перекрывающихся в кортикальном слое цитоплазмы. Установлено, что эти МФ полимеризуются de novo непосредственно на экваторе, а не перераспределяются из других регионов (Kakimota, Shibaoka, 1987; Palevitz, 1987; Traas et al., 1989). Позднее, в телофазе, во время роста клеточной пластинки, они вместе с МТ фрагмопласта удаляются из центра клеточной пластинки и локализуются на его растущем краю. После образования клеточной пластинки и завершения деления клетки МФ восстанавливают свою интерфазную конфигурацию, начиная с формирования перинуклеарной системы вокруг дочерних ядер (Kakimota, Shibaoka, 1987; Palevitz, 1987; Schmit, Lambert, 1990; Yasuda et al., 2005; Yuetal., 2006).
Механизмы реорганизации и взаимодействия микротрубочковых пучков в ходе цитоскелетного цикла в материнских клетках пыльцы табака
У двудольных растений цикл реорганизации МТ цитоскелета в ходе мейотического деления изучен на примере всего нескольких видов, таких как томат, баклажан, картофель (Hogan, 1987; Traas et al., 1989; Genualdo et al., 1998; Conicella et al., 2003). Несмотря на то, что табак является весьма удобным объектом для цитологических исследований, его наиболее часто используют для изучения динамики цитоскелета в делении соматических клеток, таких например как BY-2 (Hoshino et al., 2003; Sano et al., 2005). Данные же по динамике микротрубочкового цитоскелета в МКП табака в литературе не представлены.
Предварительно мы проанализировали динамику цитоскелета в процессе мейотического деления табака классическим цитологическим методом с использованием модифицированного фиксатора Навашина, выявляющего не только МТ пучки, но также и ядерную оболочку (Wada, Kusunoki, 1964). На рисунке 7 представлены результаты этого анализа.
Как видно из представленных данных использование данного типа фиксации не позволяет визуализировать МТ цитоскелет в МКП табака на стадиях профазы 1 мейоза (рис. 7а). Тем не менее, методами иммуноокрашивания на других двудольных растениях показано, что в профазе 1 мейоза цитоскелет не только присутствует в виде радиальной системы МТ пучков, но и имеет определенную динамику в ходе профазы (Traas et al., 1989; Genualdo et al., 1998; Conicella et al., 2003; Shamina, 2005). Тубулиновый цитоскелет в МКП табака становится видимым только после распада ядерной оболочки на стадии прометафазы 1, когда он уже представлен системой коротких МТ пучков, хаотично пронизывающих массу бивалентов и контактирующих с кинетохорами хромосом (рис. 7 б). В дальнейшем, в течение прометафазы можно наблюдать несколько последовательных процессов динамики цитоскелета, таких как удлинение фибрилл МТ, их биполярную коориентацию (рис. 7 в) и конвергенцию на полюсах (рис. 7 г). Завершающим этапом всех этих процессов является построение биполярного конвергированного на полюсах веретена первого деления мейоза (рис. 7д). Анафазное расхождение хромосом сопровождается укорочением кинетохорных фибрилл МТ (рис. 7 е), в результате чего в ранней телофазе цитоскелет представлен узким пучком центральных фибрилл веретена, объединяющих полюсные группы хромосом (рис. 7 ж). После восстановления ядерной оболочки в телофазе происходит увеличение массы цитоскелета за счет активной полимеризации новых МТ пучков (рис. 7 з), которые заполняют все пространство клетки, формируя интерзональную систему цитоскелета (рис. 7 и), что обозначает завершение первого деления мейоза и переход клетки к интеркинезу.
У двудольных растений цитокинез после первого деления мейоза блокирован, поэтому переход к профазе второго деления мейоза сопровождается деполимеризацией интерзональной системы МТ пучков. Однако выявить детали этого процесса при использовании фиксации по Навашину нам не удалось. Следует отметить, что не удалось нам детализировать и профазную динамику цитоскелета в МКП табака во втором делении мейоза, хотя в редких случаях можно было наблюдать завершающие этапы формирования перинуклеарной системы МТ (рис. 7 к). В целом, динамика цитоскелета во втором делении мейоза, включая прометафазу (рис. 7 л), построение веретен (рис. 7 м), расхождение хромосом (рис. 7 н), а также формирование радиальной интерзональной системы цитоскелета (рис. 7 о,п), была аналогична первому делению мейоза, но заканчивалась цитокинезом и образованием тетрады микроспор (рис. 7 р).
Несмотря на очевидные достоинства классических методов визуализации МТ цитоскелета, такие как простота и возможность анализировать большие выборки клеток, их явным недостатком является низкая разрешающая способность. Это не позволяет анализировать динамику цитоскелета на тех стадиях цикла, когда МТ пучки слишком тонкие, например, на стадиях профазы мейотического деления. Этот недостаток отмечался и в литературе (Шамина, Дорогова, 2000). Согласно нашим наблюдениям при использовании в качестве объекта исследований мейоцитов табака, наиболее сложными для анализа при визуализации цитоскелета с помощью фиксации по Навашину (Wada, Kusunoki, 1964) являются не только стадии профазы мейоза, но также и переходные этапы, например, от профазы к прометафазе, когда МТ пучки, вероятно, слишком тонкие и короткие. При использовании данного метода фиксации также довольно трудно судить о деталях динамики цитоскелета на стадиях поздней анафазы - ранней телофазы. Визуализация цитоскелета с помощью антител на а-тубулин позволила нам не только более детально изучить цикл цитоскелета в делении МКП табака, но также и представить его в виде непрерывного процесса реорганизации одной МТ системы в другую.
Цикл реорганизации цитоскелета в первом делении мейоза. На рисунке 8 представлены этапы реорганизации цитоскелета в первом делении мейоза. Согласно полученным нами данным, в интерфазе - ранней профазе цитоскелет в МКП представлен ретикулярной системой МТ пучков, расходящихся от всей поверхности ядерной оболочки к кортикальному слою цитоплазмы (рис. 8 а). В средней — поздней профазе интерфазный ретикулярный цитоскелет преобразуется в систему прямых радиальных пучков (рис. 8 б), после чего происходит их реориентация из радиального положения в тангенциальное и приближение к поверхности ядерной оболочки (рис. 8 в). Затем пучки МТ изгибаются, опоясывая ядро, и формируют перинуклеарную профазную систему - околоядерное кольцо микротрубочек (рис. 8 г). После распада ядерной оболочки или одновременно с этим перинуклеарное кольцо распадается на отдельные короткие пучки МТ, которые выпрямляются, удлиняются и входят в зону бывшего ядра (рис. 8 д, е). На этом этапе (ранняя прометафаза 1) завершается профазная реориентация пучков МТ. Начинается хаотическая стадия (средняя прометафаза 1), во время которой МТ продолжают удлиняться, происходит соединение (+)-концов МТ пучков с кинетохорами хромосом и друг с другом, то есть формирование кинетохорных и центральных биполярных фибрилл веретена (рис. 8 е).
Далее в процессе латеральной ассоциации, сформированные фибриллы веретена в поздней прометафазе 1 поворачиваются и ориентируются биполярно вдоль оси будущего деления (рис. 8 ж). Затем они коориентируются параллельно, конвергируют (-)-концами (рис. 8 з) и, в итоге, формируют конвергированное на полюсах метафазное веретено деления (рис. 8 и). В анафазе при расхождении хромосом кинетохорные пучки деполимеризуются, в результате чего веретено в ранней телофазе состоит из полюсных районов с телофазными группами хромосом и центральных фибрилл, идущих от полюса к полюсу (рис. 8 к-м).
Особенности реорганизации микротрубочкового цитоскелета при формировании аномального положения веретен
Следует отметить, что наличие мембранного «тоннеля», сформировавшегося в МКП в конце первого деления мейоза, никак не влияло на прохождение второго деления. Построение метафазных пластинок, анафазное движение хромосом и формирование телофазных ядер происходило обычным образом без отклонений от нормы (рис. 16 е-з).
Как правило, «тоннель» формировался по центру клетки, разделяя ее на условные компартменты, в которых располагались дочерние ядра. В редких случаях формирование дочерних мембран происходило не по центру МКП, а со значительным смещением к ее периферии (рис. 16 и). Результатом такого смещения было образование не «тоннеля», а «надсечки» с одной из сторон клетки (рис. 16 к, л).
Таким образом, образованные в результате дополнительного раунда клеточного деления двуядерные клетки можно рассматривать как разновидность аномальных диад с неполным разделением цитоплазмы.
Организация МТ цшпоскелета в МКП с преждевременным цитокинезом. Процесс построения характерной для мейоза двудольных биполярной системы фибрилл на стадии телофазы 1, интерзональной системы МТ, проходил единообразно как в клетках с преждевременным цитокинезом, так и в клетках контрольных растений (рис. 16 н). Формирование веретен второго деления, а также кариокинез в каждом из условных компартментов проходил независимо и без видимых нарушений (рис. 16 о). Цикл кариокинеза, как и в норме, заканчивался образованием четырех ядер, расположенных симметрично вокруг мембранного «тоннеля» первого деления (рис. 16 п, р).
Дальнейшее развитие клеточного деления в таких клетках в целом происходило в соответствии с нормой и заканчивалось цитокинезом. Однако наличие в цитоплазме клетки во время второго деления мейоза мембранного «тоннеля» накладывало свой отпечаток на динамику микротрубочкового цитоскелета в телофазе 2.
В телофазе 2 в МКП с «тоннельным» цитокинезом дочерняя мембрана, сформированная после первого деления мейоза, механически препятствовала образованию части вторичных веретен и интерзональной системы МТ. В результате этого четыре ядра оказывались связанными друг с другом интерзональными пучками МТ не тетраэдрически, как в норме, а по кольцу (рис. 16 п, р). Как следствие, в МКП вместо шести образовывалось четыре фрагмопласта. Области перекрывания интерзональных фибрилл заполнялись пузырьками клеточной пластинки. Можно предположить, что в части клеток в случае, если формирование системы фрагмопласт - клеточная пластинка происходило правильно, то пузырьки клеточной пластинки достигали кортикальной зоны и образовывали дочернюю мембрану, сливаясь с материнской. В результате двух раундов цитокинеза в таких клетках формировалась тетрада микроспор, выделить которую в общей массе тетрад довольно трудно. Если же формирование системы фрагмопласт - клеточная пластинка происходило с отклонениями, например, со смещением к периферии МКП, то разделение цитоплазмы происходило не полностью, а в виде «надсечек». В данном случае результатом двух раундов цитокинеза являлась четырехядерная монада своеобразной формы (рис. 16 м).
У видов двудольных растений, в том числе и у табака, первое деление мейоза заканчивается формированием интерзональной цитоскелетной системы, которая играет роль неподвижного фрагмопласта и одновременно выполняет функцию радиального цитоскелета в интеркинезе (Дорогова, Шамина, 2005; Шамина и др., 2006; Шамина, Сидорчук, 2006). В норме отсутствие цитокинеза на данном этапе клеточного цикла обеспечивается, по-видимому, запрограммированным блоком образования клеточной пластинки (Дорогова, Шамина, 2005; Шамина и др., 2006). Описанная нами аномалия свидетельствует о том, что интерзональная система МТ, сформированная в МКП табака после первого деления мейоза, вполне функциональна, чтобы обеспечить формирование клеточной пластинки и дальнейшее ее преобразование в дочернюю мембрану. Однако эффективность этой системы в большинстве случаев недостаточна, чтобы координировать процесс цитокинеза в полной мере, о чем и свидетельствует появление МКП с неполным разделением цитоплазмы у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом.
Появление МКП с неполным разделением цитоплазмы по типу «тоннельного» цитокинеза отмечено у межродовых гибридов злаков (Шамина и др., 2003). Аномальный вид клеточной пластинки в данном случае был вызван блоком цитокинеза в телофазе 1 мейоза. Однако само по себе разделение цитоплазмы в первом делении мейоза является нормой для злаков. У трансгенных же растений табака аномальный «тоннельный» вид формирующейся клеточной пластинки является вторичным нарушением, тем более что в части клеток разделение цитоплазмы происходит полностью. Основным нарушением в данном случае является инициация дополнительного раунда цитокинеза в первом делении мейоза, что не характерно для двудольных. Таким образом, при данной аномалии происходит смена типа деления цитоплазмы: симультанного на сукцессивный. По-видимому, в части МКП мутантных растений нарушается механизм, обеспечивающий сопряжение между делением ядра и делением цитоплазмы во времени, вследствие чего процесс образования клеточной пластинки и дочерних мембран запускается уже после первого деления мейоза. При этом, как нами показано, преждевременный цитокинез не отменяет и не препятствует цитокинезу после второго деления мейоза. Причем все морфологические процессы, характерные для симультанного типа цитокинеза и лежащие в основе формирования системы фрагмопласт - клеточная пластинка, остаются без изменений.
Известны несколько мутаций, одним из фенотипических эффектов которых является внеплановая активация деления цитоплазмы в ходе мейоза и смена типа деления цитоплазмы. Так, мутация dyad у A. thaliana приводила к блокированию второго деления мейоза при развитии мегагаметофита, но первое деление завершалось разделением цитоплазмы и формированием диад (Siddiqi et al, 2000). Мутация tam у A. thaliana характеризовалась значительной задержкой прохождения фаз мейотического деления в части МКП. Это приводило к сильной асинхронности мейоза и двум последовательным раундам цитокинеза в первом и втором делениях, то есть, по сути, к переключению в части клеток симультанного типа цитокинеза на сукцессивный (Magnard et al., 2001). Смена типа цитокинеза была также обнаружена при изучении роли цитоскелета в определении плана деления МКП у гибридов орхидей (Brown, Lemmon, 1991).
Согласно имеющимся на сегодняшний день в научной литературе данным, преждевременное образование дочерних мембран может свидетельствовать о существовании специального механизма запуска цитокинеза. И хотя этот механизм сопряжен с ядерным циклом, но эта связь далеко не жесткая, и поэтому даже когда ядерный цикл не закончен или блокирован, цитокинез все равно может инициироваться и завершиться образованием дочерних мембран (Siddiqi et al., 2000; Magnard et al., 2001; Дорогова, Шамина, 2005). Поэтому единственной причиной описанного фенотипа может быть, на наш взгляд, нарушение в регуляторной системе цитокинеза, которое вызывает преждевременную, «внеплановую» активацию сигнала, обуславливающего запуск процесса образования дочерней мембраны.
