Введение к работе
Актуальность проблемы. Межклеточные контакты являются важнейшим звеном в процессе роста и развития многоклеточного организма. Существует множество типов и разновидностей таких контактов, с помощью которых клетки взаимодействуют друг с другом. Ключевую роль во взаимодействии растительных клеток играют контакты, представляющие собой каналы, напрямую связывающие цитоплазму и мембраны соседних клеток в единый континуум. В тканях высших растений выделяют два типа таких каналов - плазмодесмы и питомиктические каналы (ЦК). Плазмодесмы встречаются практически во всех типах растительных клеток, а образование ЦК, как правило, выявляется в микроспоцитах высших растений. В то время как плазмодесмы являются хорошо изученными структурами, формирование, функционирование и роль ЦК практически не исследована. Наиболее интересным феноменом, ассоциированным с ЦК, является перемещение по ним ядер из одной клетки в другую - цитомиксис (Шнайдер, 1975; Heslop-Harrison, 1966; Saggoo et al., 2011). Интерес к цитомиксису объясняется уникальными клеточными механизмами этого процесса, а также его возможным вкладом в формирование полиплоидных и анеуплоидных гамет, поскольку чаще всего этот процесс наблюдается в микроспорогенезе.
Несмотря на то, что цитомиксис открыт более ста лет назад (Arnoldy, 1900), на сегодняшний день в распоряжении исследователей имеется очень мало экспериментальных данных, характеризующих это явление. Остается неясным, какую роль играет цитомиксис в жизни растения, является ли он нормальным физиологическим процессом, или это - отклонение от нормы. Неизвестно, почему цитомиксис встречается чаще всего в клетках репродуктивной сферы, и одинаково ли протекает этот процесс в различных тканях одного растения и у различных видов. Спорным остается эволюционная значимость цитомиксиса. Цитомиксис многократно обнаруживался в микроспорогенезе полиплоидных форм растений. Однако неясно, каким образом связано появление этого процесса в микроспорогенезе с изменением уровня плоидности растения. Практически не изученными остаются цитологические механизмы этого процесса. Неизвестной также является судьба мигрирующего при цитомиксисе хроматина. В связи с этим актуальными задачами в изучении цитомиксиса на настоящий момент являются определение влияния уровня плоидности на проявление этого процесса, анализ ультраструктурных особенностей межклеточных каналов, ядра и хроматина при цитомиксисе, оценка влияния цитомиксиса на жизнеспособность клеток.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение особенностей цитомиксиса в микроспорогенезе растений табака разного уровня плоидности.
Задачи исследования:
-
Проанализировать частоту цитомиксиса в микроспорогенезе растений табака разного уровня плоидности.
-
Изучить механизмы формирования питомиктических каналов на различных стадиях микроспорогенеза.
-
Сравнить особенности формирования и функционирования питомиктических каналов в микроспорогенезе диплоидных и тетраплоидных растений табака.
-
Изучить ультраструктурную организацию ядра и его компонентов при цитомиксисе.
5. Оценить целостность геномной ДНК в микроспороцитах растений
табака с высокой частотой цитомиксиса.
Научная новизна и практическая ценность работы. Детальный анализ микроспорогенеза растений табака с разным уровнем плоидности позволил выявить многие ранее неизвестные закономерности межклеточной миграции ядер между микроспороцитами высших растений. При анализе частоты цитомиксиса в микроспорогенезе растений табака разного уровня плоидности показано, что частота цитомиксиса пропорционально возрастает у триплоидных и тетраплоидных растений, а у гаплоидных растений не отличается от диплоидных.
При электронно-микроскопическом анализе впервые было установлено, что межклеточная миграция хроматина происходит в составе ядра, при этом ядерная оболочка и хроматин не получают видимых повреждений после цитомиксиса. Выявлены два механизма формирования ЦК между микроспороцитами табака - на основе плазмодесм и de novo. Впервые выявлено участие в формировании ЦК особого класса клеточных органелл - сферосомоподобных везикул. С помощью цитохимического анализа выявлено наличие в этих органеллах фермента каллазы. При ультраструктурном анализе микроспорогенеза линии SR1 впервые описаны ядерные мостики - структуры, формирующиеся при слиянии оболочек двух ядер, контактирующих через ЦК. Изучена динамика ядрышка при цитомиксисе, показано, что после перехода через ЦК ядрышко может фрагментироваться и попадать в разные микроядра.
Впервые показано, что геномная ДНК, выделенная из микроспороцитов растений табака, характеризующихся высокой частотой цитомиксиса, не проявляет признаков деградации.
Практическая ценность данной работы заключается в создании ультраструктурного атласа микроспорогенеза табака и составлении схемы постадийной реорганизации межклеточных каналов в микроспорогенезе двудольных растений. Результаты данной работы могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии для студентов биологических факультетов.
Положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Частота цитомиксиса в микроспорогенезе табака возрастает у триплоидных и тетраплоидных растений.
-
Цитомиктические каналы в микроспорогенезе табака образуются на основе плазмодесм и de novo с помощью сферосомоподобных везикул, содержащих фермент каллазу.
-
При цитомиксисе мигрирующий хроматин не повреждается. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены
на следующих конференциях и симпозиумах: XLVI и XLVII Международных научных студенческих конференциях (2008 и 2009, Новосибирск) (в 2009 году доклад удостоен диплома первой степени); "Хромосома-2009" (2009, Новосибирск); XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии (2009, Владивосток); IV Международная конференция молодых учёных "Биология: от молекулы до биосферы" (2009, Харьков, Украина) (диплом за лучший устный доклад); XXIII Российская конференция по электронной микроскопии (2010, Черноголовка); XVI всероссийский симпозиум "Структура и функции клеточного ядра" (2010, Санкт-Петербург); I всероссийская молодежная научная конференция «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (2010, Томск); VII International
scientific conference for students and PhD students (2011, Львов, Украина) (доклад удостоен диплома второй степени); VII Международная конференция «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (2011, Алушта, Украина) (доклад удостоен диплома за лучший устный доклад); 2-ая Международная школа-конференция «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (2011, Звенигород); 11th Gatersleben Research Conference CHROMOSOME BIOLOGY, GENOME EVOLUTION AND SPECIATION (2012, Гатерслебен, Германия); The International PhD Student Conference on Experimental Plant Biology (2012, Брно, Чехия); Материал диссертационной работы был представлен в виде устных и стендовых докладов на отчетных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2008, 2011 гг.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК и 13 тезисов конференций.
Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список публикаций по теме диссертации, список цитируемой литературы и приложение. Работа изложена на 130 страницах, содержит 18 рисунков и 5 таблиц. Список цитируемой литературы включает 255 источника.
