Цитоэмбриологическая характеристика малины (Rubus Idaeus L.) разного уровня плоидности в связи с продуктивностью Мочалова Ольга Владимировна

Содержание к диссертации

Введение

2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИПЛОИДИИ В СЕЛЕКЦИИ КРАСНОЙ ГЛИНЫ . 7

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ...24

4. РАЗВИТИЕ ПЫЛЬНИКА, МИКР0СП0Р0ГЕНЕЗ И ФОНДИРОВАНИЕ ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН У КРАСНОЙ МАЛИНЫ В СВЯЗИ С ПОЛИПЛОИДИЕЙ . 31

4.1. Развитие стенки пыльника у малины 31

4.2. Микроспорогенез у диплоидов красной малины 33

4.3. Микроспорогенез у полиплоидов красной малины 38

4.4. Развитие пыльцевых зерен у диплоидов и полиплоидов малины 54

5. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЗРЕЛОЙ ПЫЛЬЦЫ ДИПЛОИДОВ И ПОЛИПЛОИДОВ КРАСНОЙ МАЛИНЫ В СВЯЗИ С ИХ ФЕРТИЛЬНОСТЬЮ 71

5.1. Морфологическая полноценность пыльцы малины разного уровня плоидности и содержание в ней крахмала 71

5.2. Размер пыльцевых зерен у диплоидов и полиплоидов малины ' 80

5.3. Количество проросткових пор у диплоидов и полиплоидов малины 86

5.4. Выделение полиплоидов малины по числу пор пыльцевых зерен 90

6. ПРОРАСТАНИЕ ПЫЛЬЦЫ ДИПЛОИДОВ И ПОЛИПЛОИДОВ МАЛИНЫ НА

РЫЛЬЦЕ, РОСТ ПЫЛЬЦЕВЫХ ТРУБОК В СТОЛБИКЕ ПРИ СКРЕЩИВАНИИ ФОНД МАЛИНЫ РАЗНОЙ ПЛОИДНОСТИ 98

6.1. Рост пыльцевых трубок диплоидов красной малины in vivo 98

6.2. Рост пыльцевых трубок при скрещивании форм малины разного уровня плоидности 104

6.3. Щтоморфологические и гистохимические изменения в проводниковой ткани столбиков малины в связи с опылением и ростом пыльцевых трубок 116

7. РАЗВИТИЕ МОДА И СМЕНИ, ЗАВЯЗЫВАЕМОСТЬ КОСТЯНОК ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ОПЫЛШШ 7 ДШЛОИДОВ И ПОЛИПЛОИДОВ КРАСНОЙ МАЛИНЫ 136

7.1. Основные цитоэмбриологические особенности завязывания семян и плодов у диплоидов и полиплоидов малины 136

7.2. Изучение завязываемоети плодов и костянок у диплоидов И ПОЛИПЛОИДОВ малины при их свободном опылении в связи с продуктивностью 141

7.3. Изучение завязываемоети плодов и костянок при скрещивании форм малины разного уровня плоидности и самоопылении полиплоидов 151

8. ИЗУЧЕНИЕ МОЩНОСТИ СМЕННОГО ПОКОЛЕНИЯ ПОЛИПОИДОВ КРАСНОЙ МАЛИНЫ 167

9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 172

10. ВЫВОДЫ 179

11. ЛИТЕРАТУРА 182

• ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИПЛОИДИИ В СЕЛЕКЦИИ КРАСНОЙ ГЛИНЫ
• МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
• Развитие стенки пыльника у малины
• Морфологическая полноценность пыльцы малины разного уровня плоидности и содержание в ней крахмала
• Рост пыльцевых трубок диплоидов красной малины in vivo

Введение к работе

Актуальной государственной задачей на настоящий период является более полное снабжение населения плодами,' ягодами и продуктами их переработки, что отражено в решениях ХХУІ съезда КПСС и Продовольственной программе СССР на период до 1990 года. Среди ягодных культур одной из важнейших следует считать красную малину, основным районом возделывания которой служит Западная Сибирь (Трушечкин В.Г., Шевякова Т.И., 1974; Казаков И.В.,' Кичина B.B.V 1980). Красная малина - это высокоурожайная," скороплодная,' зимостойкая культура с прекрасными вкусовыми и технологическими качествами плодов, хороший медонос. Плоды малины содержат большое количество витамина С, Р-активных соединений и фолиевой кислоты (Вигоров Л.И., 1970).

Итоги I Всесоюзного совещания по культуре малины показали,' что создание новых сортов, отвечающих требованиям интенсивного садоводства, невозможно без дальнейшего совершенствования методов селекционной работы (Трушечкин В.Г., 1970). Большие перспективы в этом направлении работы с культурой представляет метод индуцированной полиплоидии (Огольцова Т.П., 1973; Кичина В.В., 1975; Аверьянова М.А., 1981), о чем свидетельствует существование полиплоидных районированных сортов старой селекции,' обладающих рядом хозяйственно- ценных признаков, широкое распространение полиплоидов в природе. Доказано, что в эволюции рода Rutms амфи-диплоидия является крупным фактором видообразования.

Полиплоиды, как правило, характеризуются пониженной плодовитостью. Отбор селекционного материала на фертильность совместно с высоким процентом завязываемоети плодов и семян наиболее эффективно способствует повышению плодовитости полиплоидов многих культур (Шевцов И.А., 1976). Вопрос фертильности генеративных органов, таким образом, приобретает большое значение при использовании полиплоидов в селекции красной малины. Однако многие аспекты развития репродуктивных органов полиплоидов, в том числе процесса формирования и функционирования гамет, оплодотворения и развития семени у малины изучены недостаточно. Получены весьма неполные сведения о течении мейоза, не рассматривалась связь нарушения этого процесса с жизнеспособностью и физиологической активностью образующихся гамет. До конца не определены оптимальные методы выделения полиплоидов среди диплоидного селекционного материала. Неизвестно, какую роль играет псевдо-гамный апомиксис, обнаруженный у некоторых триплоидных сортов, среди индуцированных полиплоидных линий красной малины.

Учитывая актуальность использования метода полиплоидии в селекции, недостаточность данных по цитоэмбриологии диплоидных и полиплоидных форм, настоящее исследование было посвящено цито-эмбриологическому изучению диплоидов, триплоидов, тетраплоидов красной малины. Целью работы было определить влияние полиплоидии на особенности формирования и фертильность мужского и женского гаметофитов в связи с некоторыми элементами продуктивности и апомиксисом у растений. Необходимо было также разработать более совершенные и менее трудоемкие методы выделения и идентификации полиплоидов.

Для решения проблемы ставились следующие конкретные задачи: изучить процесс микроспоро- и микрогаметофитогенеза, фертильность зрелой пыльцы и семяпочек, способность пыльцы прорастать на рыльце и рост пыльцевых трубок в столбике при различных вариантах опыления, все это во взаимосвязи с некоторыми элементами продуктивности. В частности изучались завязываемоеть плодов и костянок, средняя масса плодов и масса 100 костянок при свободном опылении и скрещивании полиплоидов. Одной из задач было установить шюид-ность семенного поколения у полиплоидов для определения избирательности функционирования у них гамет определенного хромосомного состава и возможности апомиктического способа размножения.¹

В результате выполненной работы были сформулированы и выносятся на защиту следующие положения:

Снижение продуктивности полиплоидов красной малины обусловлено нарушениями в мейозе, формировании пыльцевых зерен, опылении и развитии костянок.

Для селекции малины на крупноплодное ть и высокую завя-зываемость костянок наиболее перспективен тетраплоидный уровень плоидности.

Отбор триплоидов по признаку высокой пыльцевой фертиль-ности позволяет их использование в качестве опылителей при скрещивании с диплоидами.

Для полиплоидов красной малины характерно формирование пыльцевых зерен с числом пор экзиновой оболочки более трех. Метод подсчета количества многопоровой пыльцы значительно ускоряет работу по выделению триплоидных и тетраплоидных растений.

Новизна работы заключается в том, что получены полные данные по протеканию основных цитоэмбриологических процессов у диплоидов и полиплоидов малины. Изучено строение клеток проводниковой ткани столбика до и после опыления. Полученные результаты свидетельствуют о возможности отбора на фертильность и завязываемоеть костянок у триплоидов и тетраплоидов, что позволяет наиболее эффективно осуществлять подбор высокофертильных пар для скрещиваний с целью создания новых высокопродуктивных сортов.

2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЩЛОИДИИ В СЕЛЕКЦИИ КРАСНОЙ малины

Род Rubus L. является высоко полиморфным в филогенетическом отношении и содержит виды, составляющие полиплоидный ряд от 2 № 14 до 2 п = 84. Полиплоидия имела большое значение в эволюции рода в целом и особенно подрода Eubatus Focke (ежевики). Для этого подрода характерны гибридизационные процессы,' ведущие к образованию аллополиплоидов различного типа и амфидиплоидов.^: Регулярное возникновение и функционирование нередуцированных гамет у Rubus в природе приводило и приводит в настоящее время к возникновению полиплоидных форм, экотипов,' подвидов и видов малин и ежевик. В результате эволюционного отбора,⁴ хромосомных и, главным образом,генных перестроек такие формы способны существовать в крайних природных условиях. При этом полиплоидия позволяла получать более адаптированные,' крупноплодные и мощные типы растений. Замечено,' что формы Rubus произрастающие в холодных северных и засушливых южных районах, на засоленных почвах имеют повышенную плоидность ( Darrow g.m. , 1937; Розанова M.^:A.V 1939,' I960; Haskell G.,1954; Кичина В.В., 1975.).

ВИД КраСНОЙ малИНЫ Rubus idaeus Ъ. ОТНОСИТСЯ К ПОДрОДУ малин Idaeobatus Pocke, который включает в себя 120 ВИДОВ.

По данным М.А.Розановой (I960) главное значение в эволюции видов данного подрода имеет мутационный процессе Полиплоидия вносит свой вклад в формо- и видообра зова тельный процессе Известно,' что вид R. sachaiinensis Levi., распространенный на Дальнем Востоке, является автополиплоидом,' видимо,происходящим от R. stri-gosus Mich.-вида близкого в филогенетическом отношении R. idaeus. Изучение течения микршорогенеза у R. sachaiinensis показало наличие квадривалентов при конъюгации хромосом,' фертильность пыльцы была низкойїКРозанова М.А., 1939, I960).

Скрещивание форм Rubus разной плоидности ведет,' как правило, к образованию потомства стерильного или с пониженной фер-тильностью. Преодоление нескрещиваемости и повышение плодовитости, в частности у малино-ежевичных гибридов," возможно в случае функционирования у малины нередуцированных гаметі Характерно, что в мейозе у 28-хромосомного гибрида между R. idaeus L. (красной малиной) и R- caesius ъ. (обыкновенной ежевикой) возможен как автосиндез между хромосомами r. caesius ъ., так и аллосиндез между хромосомами r. idaeus и r. caesius (Розанова М.А., 1938, 1940). Явление ауто- и аллосиндеза в мейозе у малино-ежевичных гибридов наблюдали также И.С.Горшков я Д.Ф.Петров (1934).

На территории СССР природное распространение вида красной малины оказывается довольно широким: от западной и северной границы страны до Дальнего Востока, включая Восточную Сибирь, и до Тянь-Шаня на юге, включая Среднюю Азию (Флора СССР, 1941).^: При этом.на краях ареала можно ожидать более активное участие нередуцированных гамет, образование которых, видимо, является характерной чертой всего рода, в формообразовательном процессе.¹ Так В.В.Кичина (1973, 1975) выделил триплоидные формы красной шлины, произрастающие в диком виде в Красноярском крае. Характерной чертой этих форм являлась выносливость в неблагоприятных природных условиях и хороший рост. Как известно, приспособленность к неблагоприятным условиям обитания присуща большинству естественных полиплоидов многих семейств покрытосеменных (Шевцов И.А.,' 1976).

Регулярное функционирование нередуцированных гамет и возникновение полиплоидов наблюдается и в культуре красной малины.

Так в старом сортименте малины еще в 20-е годы были выделены и триплоидные, и тетраплоидные сорта. По данным А.Е.Лонглея и

Д&.М.Дарроу ( Longley А.Е., Darrow G.M. ,1924 ), В ТЭКЖе П.Т.ТО- маса ( Thomas р.т.,1940)триплоидами оказались такие сорта, как (All Summer и White Queen , тетрашюядами - La Prance, Merveill Ronge, Haishamberry И Everbearing. ТрИШЮИДНЫе сорта наряду с мощными вегетативными побегами имели пониженную фер-тильность. Тетраплоиды характеризовались крупноплодноетью, ремонт антностьго, но были мало зимостойки и неустойчивы к грибным заболеваниям. Исследования советских ученых показали,' что к настоящему времени из 38 районированных в СССР сортов только три оказались триплоидными: Никольская Крупноплодная, Орлеанская Красавица, Прогресс. Тетрашюядный набор хромосом был найден у сортов Вечноплодная, Все Лето, Фонтенейская Красавица (Кичина В.В., 1973, 1975; Привалов Г.Ф., Щапов н.С, Чернова Г.Ф., 1970; Сухарева Н.Б., 1978). Из сортов новой селекции на Кубани триплоидными оказались Космос и Кубань, но у них предполагается возможность расхимеривания до диплоидного уровня ( Kirtbaja е.к., Dutova ъ. 1.,1973 ). Сильное вегетативное размножение благоприятствует возникновению диплоидных тканей внутри полиплоидного сортарлона, наблюдается миксоплоидность клеток побегов малины ( Haskell G., Tun w.N.,1961; Кичина В.В., 1973). Это обстоятельство объясняет расхождение в литературе относительно плоид-ности некоторых сортов. Так в исследованиях О.С.Жукова и А.А.Рязанова (1976) сорт Прогресс выступал, как диплоид, хотя у В.В.Кичины (1973, 1975) он числится в списке триплоидных сортов.

Возникновение всех указанных полиплоидных сортов малины, видимо, связано прежде всего со спонтанным возникновением и функционированием нередуцированных гамет (мейотические полиплоиды), - 10 -а также с соматическими мутациями (митотические полиплоиды). Исследования Т.П.Огольцовой (1973) показали, что спонтанные Mile's тические полиплоиды регулярно возникают в частоте 1:10 среди культурных диплоидных сортов малины. Так у 14 из 17 сортов малины старой и новой селекции были выделены спонтанные автотетра-плоиды. Выяснилось, что экологические условия не влияют на частоту появления спонтанных полиплоидов. Она не изменяется в зависимости от возраста плодоносящих растений. Спонтанные мейотические полиплоиды (в основном триплоиды) обычно составляют около 1% от общего числа сеянцев, возникающих при свободном опылении диплоидных сортов, В инбредных семьях частота встречаемости таких полиплоидов возрастает до 4-6$ (Огольцова Т.П., 1973;' Кичина В,В., Огольцова Т;П., 1973).

По внешним признакам спонтанные полиплоиды малины выделяются более крупными гофрированными листьями, замедленным ростом побегов и более поздним сроком созревания плодов. Полиплоиды, выделенные у сортов Карнавал, Новость Кузьмина и Ныобург, не отличались от диплоидов по фертильности и давали плоды, которые по основным качествам сходны с ягодами исходных диплоидных сортов. Полиплоидные сорта малины старого сортимента отличаются склонностью к ремонтантности и сильнорослости. Нередко полиплоиды имеют более крупные бессемянные плоды, более плотные ягоды, которые отличаются более приятным видом и лучше хранятся.¹ В таких плодах выявляется большой процент сахара. Получение полиплоидов считвется одним из путей улучшения химического состава (Виго-ров Л.И., 1970; Кичина В.В., Огольцова Т.П., 1970, 1973; Огольцова Т.П., 1973). Дж.Хаскел ( Haskell G.,1968),изучая методом хроматографии качественный состав фяавоноидов спонтанных и индуцированных полиплоидов красной малины, показал, что в отношении флавоноидных компонентов спонтанные полиплоиды более, чем кол-хиплоиды отличаются от родительского диплоидного сорта. У тетра-плоидов малины увеличивалось содержание общего азота,' редуцирующих Сахаров, каротина, рибофлавина, но снижалось количество общих и нередуцированных Сахаров, кальция и каротина. Подобные биохимические изменения, видимо, характерны для всех полиплоидов, в частности, отмечались для полиплоидов шпината (Алипи-ева М., 1968).

Исследования показывают, что среди новых сортов малины спонтанные полиплоиды становятся все более редкими и, видимо," это связано прежде всего с отборами в процессе постановки садоводства на промышленную основу. Главными хозяйственно-ценными признаками полиплоидов являются крупноплодноеть и ремонтантность. Для промышленного же садоводства необходимы ранние сорта с одновременным созреванием плодов, в которых увеличение размера плодов происходило бы за счет увеличения в них чясла костянок, желательно, бессемянных, а не за счет укрупнения костянок и семян, как ЭТО наблюдается у ПОЛИПЛОИДОВ ( Kollanyi L., Simon т., 1970; Кичина В.В., 1973).

Тем не менее распросранение в природе достаточно плодовитых, устойчивых полиплоидных форм малины," наличие районированных полиплоидных сортов, обладающих рядом ценных для селекции качеств, дает перспективу использования метода полиплоидии в селекции красной малины. В последнее время остро стал вопрос о расширении и качественном совершенствовании методов селекции. В частности используются в качестве родительских компонентов индуцированные полиплоиды лучших современных сортов,¹ а также ценные тетраплоиды старого сортимента малины (Кичина В.В.,' 1970).

Как известно, селекция на полиплоидном уровне перспективна только в случае учета селекционерами некоторых требовании и выполнения ими определенных правил, К настоящему времени наибольший успех в использовании полиплоидии достигнут у вегетативно размножающихся и перекрестноопыляющихся культур,' многолетников с небольшим числом хромосом. Ьйлина - типичный полукустарник с многолетней подземной частью, состоящей из корневища и боковых придаточных ветвей,' и надземной - из однолетних и двулетних побегов. Из придаточных почек корневища развиваются побеги замещения, которые плодоносят на второй год (Казаков В.И., Кичина В.В., 1976, 1980)..

Главное преимущество полиплоидов состоит в возможности увеличения разнообразия сочетания и рекомбинации генетического материала, что позволяет получать на полиплоидном уровне более высокий эффект гетерозиса. Аутотетраплоиды имеют более сложный характер менделевского расщепления. Различное сочетание доминантных и рецессивных аллелей приводит к различной степени проявления признаков. Часто наблюдается кумулятивное действие гена,' то есть проявление его усиливается с увеличением дозы гена (Турбин Н.В., 1972). Несмотря на сбалансированность набора хромосом, у аутополиплоидов может меняться генный баланс. Удвоение хромосом нарушает количественное соотношение между цитоплазмой и ядром. Это изменение зависит от генотипа диплоидных форм. Таким образом,полиплоиды представляют собой качественно новый материал для селекционного процесса (Шевцов И.А., 1976). Основным требованием успешной работы с полиплоидами является создание наиболее разнообразного материала, обладающего столь же большой генетической изменчивостью, как это наблюдается у диплоидных форм различных культур. Последнее может быть осуществлено при - ІЗ - вовлечений в полишюидизацию как можно большего количества генетически различающихся сортов и при переводе на полиплоидный уровень большего количества растений в пределах сорта (Рад-жабли Е.П., удь В.Д., 1972; Шевцов И.А., 1976).

В связи с вышесказанным первым этапом в селекции малины ставилась задача создать устойчивые тетраплоидные родительские линии, пригодные для селекционной работы с полиплоидами. К настоящему времени выделены путем обработки колхицином тетраплоидные клоны почти у всех селекционно-ценных сортов.

Искусственное получение полиплоидов малины особенно успешно осуществлено Т.П.Огольцовой (1971,* 1973). Ею была разработана методика массового получения индуцированных аутополиплоидов путем воздействия колхицина на корешки, семена и точки роста на базе генотипов лучших диплоидных сортов малины.^: Выл получен достаточно разнообразный генетически-селекционный материал для проведения дальнейшей работы - получения на основе этих полиплоидных линий новых высокопродуктивных и устойчивых сортов красной малины.

Экспериментальные данные по исследованию всех практически ценных аутотетраплоидов показывают, что лучшие результаты могут быть достигнуты не путем отбора внутри аутополиплоидных популяций, а только при отборе потомств от скрещивания аутополиплоидных популяций различного происхождения. Создание более гетерозисних полиплоидных форм происходит вследствие улучшения комбинационной ценности объединенных в одном организме геномов. В процессе размножения аутополиплоидов происходит стабилизация генетических систем, способствующая нормализации цитогенетических процессов. Плодовитость растений повышается. Это позволяет считать возможным использование экспериментальных приемов улучшения мейоза, при этом высказываются предположения о целесообразности перестройки мейоза аутополиплоидов на бивалентную конъюгацию по типу аллополиплоидов (Семенов В.И., Семенова Е.В., Капицына Л.&, 1969; Турбин Н.В., 1972; Чувашина Н.П., 1980), Для этого необходимо проводить скрещивание аутополиплоидов различных видов, различных эколого-географических форм и вызывать нарутпение гомологии путем патогенетических перестроек. У ягодных культур успеха в этом направлении добилась Л.А.Фролова (1980). Она показала, что скрещивание генетически различающихся тетраплоидов черной смородины увеличивает бивалентную конъюгацию хромосом, частично нормализует мейоз, повышает процент завязывания плодов и количество семян. Исследования показывают, что отбор на плодовитость на полиплоидном уровне должен носить комплексный характер, охватывающий как вопросы улучшения правильности мейоза и повышения жизнеспособности гамет, так и завязываемоети большего количества плодов. У малины это важно в отношении числа костянок в одном плоде и массы отдельных костянок.

В селекции малины на полиплоидном уровне необходимо было дать оценку результативности отбора сеянцев от скрещивания индуцированных полиплоидных линий красной малины и выявить наиболее ценные.полиплоидные формы для последующего использования в селекции. Эта задача частично была выполнена работой М.А.Аверьяновой (1981).

Было показано, что новые полиплоиды малины - потомство ав-тотетраплоидов 17 сортов малины - можно рассматривать как доноры на крупноплодность и урожайность. Плодовитость полиплоидных сеянцев зависела от генотипического разнообразия компонентов скрещивания, причем гибридные растения были более плодовиты, чем полученные от свободного опыления и самоопыления. Включение в гибридизацию наиболее плодовитых тетраплоидов повышало результаты скрещиваний. Были выделены сеянцы, представляющие интерес для дальнейшей.селекционной работы (Кичина В.В.,' Аверьянова М.А., 1981, а,б).

Работа М.А.Аверьяновой (1981) подтвердила данные Т;Ш0голь-цовой (1971, 1973) о перспективности перевода диплоидных сортов малины на полиплоидный уровень, о влиянии полиплоидии на характер изменчивости хозяйственно-ценных признаков.^; Были выявлены особенности роста и развития автотетраплоидов, которые стали основой для выбора исходного материала при полиплоидизации. Оказалось, что в практической селекции для перевода растений на тетраплоидный уровень целесообразно отбирать диплоидные сорта с высокой фертильностью, с максимальным числом плодолистиков в гинецее. Было показано, что отбор на крупноплодность и урожайность возможен как на триплоидном, так и на тетраплоидном уровне. Для получения триплоидных сеянцев целесообразно использовать тетраплоиды в качестве материнских растений.

Опыт селекционной работы показывает, что для каждого вида растений существует оптимальный уровень плоидности, который может быть и триплоидным. Однако триплоидные формы ввиду нарушенного мейоза характеризуются значительно сниженной плодовитостью. В практическом отношении триплоидия имеет ценность, когда используются вегетативные органы или плоды, но не семена (Шевцов И.А., 1976).

У малины продуктивность на триплоидном уровне может зависеть и от такого явления, как апомиксис. Для всего рода неоднократно отмечалась возможность такого типа размножения, которое не связано со слиянием мужской и женской гамет, но происходит при помощи семян.^! Многие авторы рассматривают род Rubus в природе, как апомиктячески-половой полиморфный комплекс видов и разновидностей, в пределах которого непрерывно

Протекают ГИбрИДИЗаЦИОННЫе Процессы ( Pratt С, Einset G.,1965, Dowriek G.J., 1961,1966; . Петров Д.Ф.,' 1972, 1976; Петрус Ю.П, 1975; Сухарева Н.Б., 1978).

Тип апомиксиса у Rubus доследовался и уточнялся неоднократно. Практически во всех работах по апомиксису у Rubus было показано, что развитие у него семян без оплодотворения происходит обязательно при наличии опыления собственной пыльцой. Таким образом Rubus свойственен псевдогамный апомиксис, при котором происходит слияние одного из спермиев с полярными ядрами и развитие гибридного эндосперма, двойное оплодотворение не происходит, а наблюдается деление и развитие без оплодотворения гаплоидной или диплоидной яйцеклетки - гаплоидный или диплоидный партеногенез ( Pratt С, Einset J.,1955; Harkarian D.,01mo H.P., 1959;. Dowriek g. , J. ,1961; Мандрик В.'Ю., Петрус Ю.Ю., 1973; Петров Д.Д., Сухарева Н.Б., Лизнев В.Н., 1974; Петров Д.Ф., Сухарева Н.Б., 1977). В то же время нанесение пыльцы груш, яблони, сливы, земляники наряду с собственной пыльцой при межсортовых скрещиваниях малины, способствует увеличению количества костянок в плодах, улучшает прорастание семян и рост гибридных сеянцев (Павлов О.А., 1973).

Апоспория является второй эмбриологической особенностью рода Rubus. Было неоднократно показано развитие дополнительных к основному зародышевых мешков в семяпочке, происходящих из клеток многоклеточного археспория или соматических клеток нуцеллуса.

Для видов рода Rubus характерна и генеративная и соматическая апоспория (.Pratt С, Einset J., 1955; Мандрик В.Ю., Петрус Ю.Ю., 1976). Дальнейшая судьба апоспорических зародыше- вых мешков не всегда бывает однозначной. Как правило, у диплоидных видов малины и ежевики эти зародышевые мешки отстают в своем развитии от основного зародышевого мешка, происходящего путем деления материнской макроспоры, и затем дегенерируют на различных стадиях развития амфимиктического зародыша, В то же время у полиплоидов при нарушении развития основного зародышевого мешка апоспорический зародышевый- мешок, видимо, может занять его место и дать начало апомиктическому зародышу ( Pratt c.,Einset j., і

1955).

При цитоэмбриологическом исследовании полиплоидных апомик-тических видов Rubus всегда стоит вопрос о плоидности ядер обра зущегося у них зародышевого мешка и о его происхождении. Было выяснено, что и половые и апомиктические зародышевые мешки у Rubus развиваются ПО ТИПУ Polygonum ( Thomas Р.Т.,1940 a; Dow-rick G.J.,1961,1966 ; Петров Д.Ф., Сухарева И.Б., 1977).

Вопрос о плоидности зародышевого мешка неоднократно решался на основе изучения размножения видов Rubus и определения плоидности возникающего семенного апомиктического поколения. Была показана возможность постепенного перехода видов внутри рода от полностью размножающихся половым путем до полностью апомиктичес-ких. Последнее зависело- как от плоидности материнской формы,так и плоидности опылителя. У диплоидных и ПОЛИПЛОИДНЫХ ВИДОВ Rubus при опылении их пыльцой разной плоидности было выделено несколько

ОСНОВНЫХ путей формирования зародыша ( Thomas Р.Т.,1940 a; Marka--rian D., Olmo H.P.,1959; Dowrick G.J.,1961,1966 ). У ДИПЛОИДНЫХ видов Rubus обычно наблюдается развитие полового зародыша. Для некоторых диплоидов и отдельных полиплоидов характерно формирование нередуцированных мужских и женских гамет. Участие - 18 -нередуцированных гамет в половом процессе у диплоидных видов R. rusticanus Merc. И R. idaeus ПРИВОДИЛО К увеличению плоидности их семенного потомства. В природе таким примером может СЛУЖИТЬ ВОЗНИКНОВеНИе ЛОГГанЯГОДЫ R. loganobaccus Baily.

Как предполагают, она возникла путем оплодотворения гаплоидной яйцеклетки R. vitifolius Cham, et Schlecht ДИПЛОИДНЫМ СПврмием R. idaeus ( Crane M.B., 1940 a, B; Thomas P.Т., 1940 a,' в).

ПО данным П.Томаса ( Thomas P.Т., 1940 a ) у ПОЛИПЛОИДНЫХ видов ежевик половой способ размножения, как правило, связан с аллоплоидным происхождением вида, а апомиктический - с автопло-идным. Показано также, что с увеличением плоидности опылителя количество апомиктов в потомстве некоторых полиплоидов видов Rubus может увеличиваться от 0 до 100$.' Так при опылении окто-

ПЛ0ИДН0Й R. vitifolius ПЫЛЬЦОЙ ДИПЛОИДНОЙ формы R. idaeus ВСе потомство было гибридным и возникало половым путем. При опылении же этого вида пыльцой тетраплоидной формы R. idaeus в потомстве наблюдались как гибриды, так и апомикты.¹ При опылении тетрапло-

ИДНОГО ВИДа R. laciniatus Wield. ПЫЛЬЦОЙ ДИПЛОИДНЫХ ВИДОВ Rubus

63$ возникших сеянцев были матроклинными.⁵ Кроме того,' в потомстве наблюдались гаплоиды и гибриды от оплодотворения гаплоидным спермием редуцированных и нередуцированных яйцеклеток.³ При опылении R. laciniatus пыльцой видов большей плоидности (4х,' 5х, 6х, 7х, 8х) в потомтсве наблюдались только апомикты ( crane м.в.,

1940 a; Dowrick G. 'j., 1961,1966 ).

Возникновение довольно большого количества гаплоидов при репродукции Таких ВИДОВ ежеВИК, как R. caesius ( 4х ), R. laciniatus ( 4х ), R. procerus P.J.M. ( 4х ), R. Borreri Bell-Salt ( 6x), R. vitifolius ( 8x ), ( Crane M.B., 1940 a; Markarian D., Olmo H., 1959 ; Dowrick G.I.,' 1961,1966 ) послужило ОСНОВОЙ - 19 -для гипотезы, выдвинутой Дж.Довриком ( Dowrick G.J.,1961,1966 ). По этой гипотезе у полиплоидных (видимо четных по кратности основному числу) видов Rubus функционируют только редуцированные половые зародышевые мешки обычного типа. Образование же у них диплоидных яйцеклеток с их последующим апомиктическим или амфи-миктическим развитием происходит в результате явления автомик-сиса. При этом гипотетически предполагается,' что вначале наблюдается митотическое деление ядра яйцеклетки, а затем вторичное слияние образовавшихся дочерних ядер. Подобный механизм диплои-дизации яйцеклетки должен приводить у ежевик к образованию гомозиготного потомства.

Подобная точка зрения находит подтверждение в цитоэмбриоло-гических исследованиях ряда авторов. Так у R. caesius (4х = 28), вида который вначале был описан Б.Лидфорссом как обязательный апомикт, продуцирующий только апоспорические зародышевые мешки, в более поздних исследованиях Г.Христена были найдены и редуцированные И ДИПЛОИДНЫе МЭКрогамеТОфиТЫ ( Lidforss,19H; Christen 1950; ЦИТ. ПО Dowrick G.J.,1961 ). У R. caesius (4х ), R. salva-tus ( 4x ), R. laciniatus были найдены все стадии мейоза материнской клетки макроспор и почти все митотические деления в развитии гаплоидного женского гаметофита. Апоспорические зародышевые мешки у этих видов или совсем не наблюдались или достигли в развитии ТОЛЬКО 1-4 ядерной стадии ( Dowrick G.J.,1961,1966;

Мандрик В.Ю., Петрус Ю.Ю., 1975, 1976; Петрус Ю.Ю., 1975). В то

ЖЄ время У ТетраПЛОИДНЫХ ВИДОВ ежеВИК R. nitidoides W. И R. sul- catus vest часто происходила дегенерация тетрад макроспор и гаплоидных зародышевых мешков, тогда развивались апоспорические зародышевые мешки ( Thomas р.т., 1940а; Мандрик В.Ю., Петрус Ю.Ю., 1976). Все это свидетельствует о вариабельности в развитии заро- дышевых мешков и их шюидности у видов рода Rutms. Особенно склонны к формированию апоспорических зародышевых мешков три-плоидные апомиктичеокие сорта красной малины r. idaeus. Было показано, что тришюидные сорта immer tragende, Вечношюдоно-сящая, Полковник Вильдер, Ореховка,' Прогресс являются псевдо-гамными апомиктами (Петров Д.'Ф.¹,' 1939,' 19646; Петров Д.Ф.¹,' Сухарева HJRV Лизнев B.te, I974;¹ Петров ДЖЇ Сухарева яШ 1977; Сухарева Н.Б.,' 1978) 7 Апоспорические зародышевые мешки у

ЭТИХ СОРТОВ раЗВИВаюТСЯ ПО Polygonum -ТИПУ. ПрИ КаСТраЦИИ без последующего опыления цветков этих сортов совершенно не происходило завязывания костянок, при самоопылении завязывались единичные костянки. При свободном опылении и при искусственном опылении триплоидов пыльцой диплоидных и тетраплоидных сортов малины продуцировалось большое количество жизнеспособных семяні Все сеянцы, выращенные из этих семян,' имели триплойдныи набор хромосом и были полностью матроклинны по внешним признакам.' При опылении же триплоидных сортов малины пыльцой гексаплоидной ежевики Техас; потомство имело гибридное число хромосом и промежуточные между видами морфологические признаки. Такое функционирование яйцеклеток возможно лишь в случае развития у триплоидов малины нередуцированных зародышевых мешков (Петров Д;^:Ф.'У Сухарева ЕЖ*,' 1977)-^

БЫЛ ОПИСан Случай ПСеВДОГаМИИ У ДИПЛОИДНОЙ формы R. idaeus при опылении ее пыльцой триплоидной ежевики R. canadensis. Возникшее потомство имело диплоидный набор хромосом и было полностью матрокЛИННО ПО Внешним Признакам ( Aalders L.Е.,1964 ).

В данном случае неизвестен точный способ апомиктического поколения, можно предположить диплоидизацию яйцеклетки путем авто-миксиса. К сожалению, не было проведено точного исследования на гомозиготность полученных сеянцев.

КЛІратт И Дж.¹ ЭЙИНСет ( Praat С, Einset J,*1955 ), ИС- следуя способ репродукции три-, пента, гепто-,' нонашюидных ежевик (Зх, 5х,' 7х,' 9х), показал^?' что у этих видов развитие и функционирование апоспорических зародышевых мешков происходит чаще, чем у ди- и тетрашюидных,' так как у них наблюдаются большие нарушения мейоза, аномалии гаплоидных зародышевых мешков.' Макрогаметофиты с числом хромосом равным соматическому в таком случае могли развиваться путем нередукции из спорогенних клеток и соматических клеток нуцеллуса.

Нарушения в развитии женского гаметофита у полиплоидных видов наблюдали П. Тома С ( Thomas р. т., 1940а,'), Е.*Керр ( Kerr е. А., 1954), К.ПраТТ И Дж.ЭЙИНЗеТ ( Pratt С,Einset J.,1955 ). ОСНОВНЫМИ типами нарушений являются замедленное развитие зародышевых мешков и их дегенерация на разных стадиях развития,' отсутствие внутриядерной и внутриклеточной дифференциации,' обратная полярность расположения яйцевого аппарата," аномальное расположение полярных ядер, частая дегенерация яйцеклеток.* В результате большая часть семяпочек у этих видов оказывалась нежизнеспособными. У некоторых полиплоидных видов и сортов Rubus показано образование партенокарпических плодов и костянок ( Crane м.в., 1940а; Сухарева Н.Б., 1978).^;

По общепринятой в последнее время генетической теории апо-миксиса, выдвинутой ЛЛоуэром (цит.¹ по Д.Ф.ЇІетрову,' 1972,' 1976) возникновение апомиктического поколения подчиняется генетическому контролю. Лишь сочетание в одном растении аллелей трех рецессивных генов, контролирующих образование нередуцированных яйцеклеток, неспособность яйцеклеток к оплодотворению и способность яйцеклеток развиваться без оплодотворения,приводит у него к устойчивому апомиксису. Генетическая теория включает в себя две предыдущие теории апомиксиса: "гибридную" теорию А.Эрнста,¹ по которой развитие растений без оплодотворения является прямым следствием отдаленной гибридизации,' и "полиплоидную" теорию Э.Страсбургера и П.Томаса, по которой апомиксис имеет своей причиной полиплоидию. В настоящее время принята та точка зрения,' что отдаленная гибридизация и полиплоидия выступают лишь в качестве важнейших условий, способствующих бесполосеменному размножению (Петров Д.Ф.', 1972, 1976).

Рецессивность генов,¹ ответственных за проявление апомиксиса,' приводит к тому, что при скрещивании половых и апомиктических форм поколение р₁ всегда оказывается половым и только в р₂ наблюдается сложное расщепление на половые и апомиктические формы (Петров Д.Ф., 1964а)'і

Одной из возможностей использования апомиксиса в селекции является выведение новых сортов,' ценные качества и гетерозис которых могут быть закреплены в поколениях (Петров Д.'Ф.¹^ 1963,' 1976). В селекционной работе с Rubus было бы желательно получить полиплоидные гетерозисные сорта красной малины,' обладающие устойчивым апомиксисом (Кантор Т.С,' 1970);^; Распространению этих сортов весьма способствовало бы вегетативное размножение, являющееся основным для малины.' Однако направленная селекционная работа с апомиктическими формами Rubus не проводилась.^ До сих пор неясно, существует ли апомиксис у индуцированных колхицином и спонтанных полиплоидных,' в основном тетраплоидных,' линий красной малины, являющихся в настоящее время исходным материалом для селекционной работы с этой культурой;¹

Полиплоидия является новым методом в селекции красной малины и в этом направлении уже получены обнадеживающие результаты^ Отбор сеянцев от скрещивания полиплоидных линий различного генети- — 23 — ческого происхождения на фертильность и продуктивность следует считать основным способом, позволяющим получать новые сорта малины,' обладающие такими хозяйственными признаками,' как крупно-плодность,' урожайность и устойчивость к неблагоприятным условиями Однако дальнейшее совершенствование селекционной работы с красной малиной на полиплоидном уровне сдерживается недостаточными познаниями цитоэмбриологических процессов, определяющих образование и функционирование у триплоидов и тетраплоидов жизнеспособных гамет,' нормальное осуществление оплодотворения,' развитие зародыша, семени и плода Не определены возможности апомиктичес-кой репродукции у полиплоидов красной малины,¹ До конца не разработаны методы выделения и идентификации семенного поколения от скрещивания форм разной плоидности по числам хромосом в массовом масштабе, необходимом ддя успешной селекционной работы с культурой.

Наша работа была посвящена цели заполнить некоторые пробелы,' касающиеся фертильности и продуктивности полиплоидов красной малины.

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Материалом исследований послужили сорта и формы малины красной Rubus idaeus L. (сем.^! Rosaceae Juss. ) разной ШЮЙД-ности, находящиеся в селекционно-практической работе у Й?А.Соко-ловой (НИИ садоводства Сибири имени МЛ^Лисавенко)^ Бее полиплоиды в селекционный фонд были любезно предоставлены ВЖ'Кичи«-ной (НИЗИСНП).' Для более полного цитоэмбриологического исследования использовались сорт Карнавал,' тетраплоидная форма этого сорта, а также три отборных сеянца: 144,' І46-П,' І46-Ш (2 п- 21,' 21, 28).^а Сеянцы были выделены нами в 1979 году в результате подсчета числа хромосом у 43 вегетативно-размноженных клонов,' происходящих из семян от свободного опыления диплоидных и полиплоидных сортов малины.* Семья 144 происходила от свободного опыления диплоидов (смесь семян разных сортов),' семья 146 - от свободного опыления тетраплоидов (смесь семян разных сортов)^ Контролем служили местный сорт Барнаульская и диплоидный сеянец I46-I, того же происхождения, что и полиплоидные сеянцы."

Для совершенствования методики выделения полиплоидов изучали число проросткових пор пыльцевых зерен и подсчитывали число хромосом у 179 сеянцев от свободного опыления полиплоидов следующих сортов красной малины: Комета (4х=28),' Оттава (4х=28),' Карнавал (4х=28), Латам (4х=28),' І^гбин Болгарский (4x^28),' Ллойд Джордж (Зх=21,' 4х=28), Моллинг Промис (4х=28),' Моллинг Эксплойт (4х=28), Моллинг Интерпрайс (4x=28)v

Для изучения наличия псевдогамии определяли плоидность у 23 сеянцев из семян I980-I98I гг.,' полученных от скрещивания между собой форм малины разного уровня плоидностиї

Для подсчета числа хромосом апикальные точки роста однолетних побегов фиксировали в уксусном алкоголе (3:1) после 24-часовой предобработки в 0,2$ растворе колхицина при температуре +4 В процессе работы было выяснено, что в 10-11 часов утра в теплую и солнечную погоду наблюдалось самое большое число :митотически делящихся клеток, давленные препараты,' приготовленные из точек роста, окрашивали уксусным гематоксилином по методике ЛЬ'АЇТо-пильской, С.В.Лучниковой,' НЛІ.Чувашиной (I975).^J

Фиксации для цитоэмбриологических исследований проводили в формальацеталкоголе (1:1:8) и по Карнуа (6:3:1)^ Постоянные препараты готовили по общепринятой методике (Паушева ЗЖ,' 1974) после заливки материала в парафин. Срезы получены на ротационном микротоме толщиной 5-6 мкм. Препараты окрашивались гематоксилином по Эрлиху и Гайденгайну (Цитологическая и цитоэмбриологичес-кая техника, 1981) с подкраской алциановым синим (Пирс эЛ'1962)';

Для изучения мейоза и стадий развития пыльцевых зерен пыльники окрашивали уксусным гематоксилином (Топильская Л«А.^],' Лучникова СВ., Чувашина НЛІ., 1975),- Готовили давленные препараты.-* Просматривали 200-300 материнских клеток пыльцы (МШІ) на разных стадиях микроспорогенеза и 500-1000 тетрад микроспор. Анализ конъюгации хромосом в диакинезе-метафазе I и тип распределения хромосом к полюсам в анафазах I и П проверяли на 30-60 МКП.*

Фертильность зрелой пыльцы определяли в 1979^-1981 ггі при воздействии KJ + J₂ (Паушева З.П.',' 1973)^ Анализировали 200-400 пыльцевых зерен для каждой формы.Для нахождения среднего размера пыльцы после окрашивания Kj + j₂ измеряли с помощью окулярмикрометра диаметр^ 50-100 пыльцевых зерен.'

Для определения количества пор в экзине пыльцевых зерен использовалась методика окрашивания спиртовым раствором фуксина (Цитологическая и цитоэмбриологическая техника,' 1981), но с некоторыми изменениями. Пыльца непосредственно из свежевысушенных пыльников собиралась на тонкий скальпель и затем препаровальной иглой переносилась на предметное стекло. На пыльцу наносили каплю ксилола для растворения жира. После испарения ксилола пыльцу помещали в каплю 0,01% спиртового раствора основного фуксина, перемешивая пыльцевые зерна в красителе препаровальной иглой. После испарения спирта на пыльцу капали кашпо глицерина и вновь перемешивали в нем пыльцевые зерна до тех пор, пока глицерин не приобретал равномерную розовую окраску; В данном случае введение в методику глицерина вместо общепринятой глицерин-желатины более удобно, так как позволяет поворачивать пыльцевые зерна легким нажимом препаровальной иглой на покровное стекло. Экзина пыльцевого зерна после окрашивания оказанным методом^ приобретает темно-розовый цвет,¹ поры и борозды остаются более светло окрашенными; После приготовления препарат следует на 5-Ю минут отложить или слегка подогреть на спиртовке для того, чтобы набухла пыльца, сморщенная в высушенном состоянии^ Количество пор подсчитывали у 200-300 пыльцевых зерен каждой исследуемой формы. После долгого хранения в глицерине (несколько часов) экзина пыльцевых зерен частично обесцвечивается^

Размеры трехпоровых и многопоровых пыльцевых зерен определяли после окрашивания спиртовым раствором фуксина.⁴ Для сравнения величины треугольных в плане (трехпоровых) и четырехугольных в плане (четырехпоровых)пыльцевых зерен, у первых измерялась сторона, у последних - диагональ.

Рост пыльцевых трубок в столбике, а также отложение каллозы в проводниковой ткани столбика малины исследовали методом УФ-микроскопии в собственной модификации методики Дж^Дженсєна (1965)V

Учитывая большую плотность тканей столбика плодово-ягодных растений, лучшие результаты показал следующий метод мацерации столбиков малины: отделенные от цветоложа плодолистики в течение 1-2 минут кипятили в фарфоровом тигле над пламенем спиртовки в насыщенном водном растворе едкого натрия,' охлаждали в течение 10 минут в том же растворе и затем промывали на стекле с лункой в трех сменах дистиллированной воды. Раздавливание столбиков проводили между двумя тонкими предметными стеклами в капле 0,'005$ водного раствора анилинового синего, подщелоченного аммиаком до рН = 8,2. Препараты изучали в УФ-свете с фильтром УФС-6 (длиной волны 656 нм) непосредственно после приготовления^ Использовали люминисцентный осветитель 0Й-І8А,' лампу широкого спектра СВД-І20А, запирающие светофильтры 3KJ-3 и IC-I8,^j

В присутствии флюорохрома каллоза,' находящаяся в стенках и каллозных пробках пыльцевых трубок,' дает характерное зеленовато-желтое свечение, позволяющее легко выявить пыльцевые трубки,³

Для изучения роста пыльцевых трубок пыльцы диплоидов и полиплоидов в столбике материнских форм разного уровня плоидности проводили скрещивание форм по схеме: 2Х х 2хУ 2х х ЗхУ 2х х 4х,^! Зх х 2х, Зх х Зх,' 4х х 4х. Гинецеи фиксировали в формальацетал-коголе (1:1:8) через I, 3, 5,' 8-9 часов после опыления,"¹

Для изучения отложения каллозы в клеточной оболочке клеток проводниковой ткани поперечные микротомные срезы столбика депа-рафинировали по общепринятой методике до дистиллированной воды и затем помещали в водный раствор 0,005$ анилинового синего (Ш = 8,2) под покровное стекло. Препарат исследовали описанным выше методом в УФ-свете,^: Контролем служили срезы в дистиллированной воде без добавления флюорохрома.'

Постоянные препараты,' предназначенные для изучения морфологии и цитохимии клеточных оболочек клеток проводниковой ткани столбика малины до и после опыления," окрашивали и наблвдали несколькими методами. Было применено окрашивание алциановым синим по Стидмену (Пирс 3.V 1962);^; Для этого микротомные срезы окрашивали гематоксилином по Гайденгайну и после промывки в водопроводной воде на несколько секунд помещали в алциановыи синий (0,1$ - раствор в 3$ - уксусной кислоте);⁵ Затем препараты проводили через спирты и ксилол в канадский бальзам;¹ Алциановыи синий является одним из красителей,' хорошо выявляющих клеточные оболочки^ Окрашивание основывается на солевой связи красителя со свободными карбоксильными группами пектиновых веществ,' входящих в матрикс клеточной оболочки ( Benes К.,1968 ).

Окрашивание амидочерным В было применено для выявления белка (Руководство по количественному иммуно электрофорезу,' 1977).' Срезы столбиков, освобожденныеот парафина, помещали на ночь в раствор амидочерного В,' Для приготовления красителя 0,5 г амидо-черного растворяли в 45 мл ледяной уксусной кислоты с добавлением 10 мл 96 этанола и 45 мл дистиллированной воды.* Избыток краски удаляли, помещая срезы на 30 минут в дифференцирующий раствор, содержащий 96 этанола - 10 мл,' ледяной уксусной кислоты - 45 мл, дистиллированной воды - 45 мл.¹ Срезы просматривали под микроскопом в капле свежего дифференцирущего раствора;* .Ами-дочерный В является качественным реактивом на общий белок.¹

Окрашивание хлорцинкйодом использовали для выявления целлюлозы (Дженсен У., 1965). Депарафинированные срезы столбиков помещали в каплю реактива и наблюдали под микроскопом.' Реакция основана на появлении синей окраски в присутствии полисахарида в результате разрыва водородных связей между молекулами клетчат- -ЗЭ-ки и скопления между этими молекулами ионов йода.- Окрашивание не является строго специфичной реакцией на клетчатку. Поэтому для ее выявления было осуществлено исследование срезов в поляризованном свете. Микротомные срезы столбиков после удаления парафина в дистиллированной воде помещали между фильтрами-поляризаторами микроскопа Ни .Анизотропное свечение целлюлозы наблюдается в результате кристаллической микрофибрильной укладки молекул полисахарида в клеточной оболочке.

Фертильность женских генеративных органов определяли по за-вязываемости костянок у форм разного уровня шюидности при их свободном опылении, самоопылении и скрещивании между собой (Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур, 1980), Ежегодно кастрировали 30-60 цветков материнской формы. Опыление проводили двукратно с использованием бумажных изоляторов. Завязываемость плодов и костянок отмечали по трем ревизиям, при этом учитывали количество высохших завязей.

Для определения средней массы плода взвешивали отдельно от цветоложа 30-60 плодов от свободного опыления.¹ При самоопылении и скрещивании полиплоидов взвешивали все завязавшиеся плоды. Масса 100 костянок определялась по формуле ^'(Щ чІЬлЬ''кс'тянок ^х х 100, При расчете процента полезной завязи_количество опыленных семяпочек определялось приблизительно, на основе средних данных,' и равнялось произведению количества опыленных цветков на среднее число плодолистиков в одной гинецее (при этом исходили из того, что в одном плодолистике развивается одна семяпочка). Количество высохших костянок на разных стадиях их развития иногда определялось путем пршлых подсчетов, чаще их число рассчитывалось приблизительно, по формуле: количество высохших плодов х среднее число костянок в одном плоде.' - зо -

Для проверки исследуемого материала на автономный апомик-сис ежегодно в течение трех лет проводилась кастрация и изоляция 30 цветков каждой формы малины без их дальнейшего опыления;' Для определения возможности псевдогамии подсчитывали числа хромосом в семенном потомстве при опылении триплоидных и тетрапло-идных форм малины пыльцой разной шюидности.'

Статистическая обработка материала проводилась по общепринятой методике (Рокитский П.Ф., 1973).

Цитоэмбриологические исследования выполнены на микроскопах Nf (Цейсе) и Ни (Цейсе). Микрофотографии получены использованием микрофотонасадок МФН-3, МФН-І2. Расчет увеличения фотографий был сделан общепринятым способом, используя объектмикрометр (Цитологическая и цитоэмбриологическая техника, I98I)v - ЗІ -

4. РАЗВИТИЕ ПЫЛЬНИКА,' МИКРОСПОРОГШЕЗ и фондирование ПЫЛЬЦЕВЫХ ЗЕРЕН У КРАСНОЙ МАЛИНЫ В СВЯЗИ С ПОЛИПЛОИДИЕЙ

Использование полиплоидии в селекции красной глины

Род Rubus L. является высоко полиморфным в филогенетическом отношении и содержит виды, составляющие полиплоидный ряд от 2 № 14 до 2 п = 84. Полиплоидия имела большое значение в эволюции рода в целом и особенно подрода Eubatus Focke (ежевики). Для этого подрода характерны гибридизационные процессы, ведущие к образованию аллополиплоидов различного типа и амфидиплоидов.: Регулярное возникновение и функционирование нередуцированных гамет у Rubus в природе приводило и приводит в настоящее время к возникновению полиплоидных форм, экотипов, подвидов и видов малин и ежевик. В результате эволюционного отбора,4 хромосомных и, главным образом,генных перестроек такие формы способны существовать в крайних природных условиях. При этом полиплоидия позволяла получать более адаптированные, крупноплодные и мощные типы растений. Замечено, что формы Rubus произрастающие в холодных северных и засушливых южных районах, на засоленных почвах имеют повышенную плоидность ( Darrow G.M. , 1937; Розанова M.:A.V 1939, I960; Haskell G.,1954; Кичина В.В., 1975.).

Вид красной малины rubus idaeus ъ. относится к подроду малин Idaeobatus Pocke, который включает в себя 120 ВИДОВ.

По данным М.А.Розановой (I960) главное значение в эволюции видов данного подрода имеет мутационный процессе Полиплоидия вносит свой вклад в формо- и видообра зова тельный процессе Известно, что вид R. sachaiinensis Levi., распространенный на Дальнем Востоке, является автополиплоидом, видимо,происходящим от R. stri-gosus Mich.-вида близкого в филогенетическом отношении R. idaeus. Изучение течения микршорогенеза у R. sachaiinensis показало наличие квадривалентов при конъюгации хромосом, фертильность пыльцы была низкойїКРозанова М.А., 1939, I960).

Скрещивание форм Rubus разной плоидности ведет, как правило, к образованию потомства стерильного или с пониженной фер-тильностью. Преодоление нескрещиваемости и повышение плодовитости, в частности у малино-ежевичных гибридов," возможно в случае функционирования у малины нередуцированных гаметі Характерно, что в мейозе у 28-хромосомного гибрида между R. idaeus L. (красной малиной) и R- caesius ъ. (обыкновенной ежевикой) возможен как автосиндез между хромосомами R. caesius ъ., так и аллосиндез между хромосомами R. idaeus и R. caesius (Розанова М.А., 1938, 1940). Явление ауто- и аллосиндеза в мейозе у малино-ежевичных гибридов наблюдали также И.С.Горшков я Д.Ф.Петров (1934).

Материал и методика

Материалом исследований послужили сорта и формы малины красной Rubus idaeus L. (сем.! Rosaceae Juss. ) разной ШЮЙД-ности, находящиеся в селекционно-практической работе у Й?А.Соко-ловой (НИИ садоводства Сибири имени МЛ Лисавенко) Бее полиплоиды в селекционный фонд были любезно предоставлены ВЖ Кичи«-ной (НИЗИСНП). Для более полного цитоэмбриологического исследования использовались сорт Карнавал, тетраплоидная форма этого сорта, а также три отборных сеянца: 144, І46-П, І46-Ш (2 п- 21, 21, 28).а Сеянцы были выделены нами в 1979 году в результате подсчета числа хромосом у 43 вегетативно-размноженных клонов, происходящих из семян от свободного опыления диплоидных и полиплоидных сортов малины. Семья 144 происходила от свободного опыления диплоидов (смесь семян разных сортов), семья 146 - от свободного опыления тетраплоидов (смесь семян разных сортов) Контролем служили местный сорт Барнаульская и диплоидный сеянец I46-I, того же происхождения, что и полиплоидные сеянцы."

Для совершенствования методики выделения полиплоидов изучали число проросткових пор пыльцевых зерен и подсчитывали число хромосом у 179 сеянцев от свободного опыления полиплоидов следующих сортов красной малины: Комета (4х=28), Оттава (4х=28), Карнавал (4х=28), Латам (4х=28), І гбин Болгарский (4x 28), Ллойд Джордж (Зх=21, 4х=28), Моллинг Промис (4х=28), Моллинг Эксплойт (4х=28), Моллинг Интерпрайс (4x=28)v

Для изучения наличия псевдогамии определяли плоидность у 23 сеянцев из семян I980-I98I гг., полученных от скрещивания между собой форм малины разного уровня плоидностиї

Для подсчета числа хромосом апикальные точки роста однолетних побегов фиксировали в уксусном алкоголе (3:1) после 24-часовой предобработки в 0,2$ растворе колхицина при температуре +4 В процессе работы было выяснено, что в 10-11 часов утра в теплую и солнечную погоду наблюдалось самое большое число :митотически делящихся клеток, давленные препараты, приготовленные из точек роста, окрашивали уксусным гематоксилином по методике ЛЬ АЇТо-пильской, С.В.Лучниковой, НЛІ.Чувашиной (I975).J

Фиксации для цитоэмбриологических исследований проводили в формальацеталкоголе (1:1:8) и по Карнуа (6:3:1) Постоянные препараты готовили по общепринятой методике (Паушева ЗЖ, 1974) после заливки материала в парафин. Срезы получены на ротационном микротоме толщиной 5-6 мкм. Препараты окрашивались гематоксилином по Эрлиху и Гайденгайну (Цитологическая и цитоэмбриологичес-кая техника, 1981) с подкраской алциановым синим (Пирс эЛ 1962)

Развитие стенки пыльника у малины

У цветковых растений формирование микроспор и мужского гаметофита тесно связано с формированием микроопорангия и развитием цветка. Зачатки тычинок в виде меристоматичеоких бугорков закладываются в зачаточном цветке. Образование ряда таких бугорков происходит рядом с зачатками лепестков и чашелистиков ближе к центральной части цветка, которая вытянута в виде головки (Витковский В.Л.1, 1969).

Дифференциация тычинки идет затем по типу разделения на тычиночную нить и четырехлопастный пыльник. Каждая лопасть пыльника преобразуется в микроспорангий. Два латеральных микро-спорангия составляют теку. Теки соединены между собой связником. Через некоторое время в субэпидермальном слое меристемы каждой лопасти пыльника дифференцируется однослойный тяж археспория.

class3 ПРОРАСТАНИЕ ПЫЛЬЦЫ ДИПЛОИДОВ И ПОЛИПЛОИДОВ МАЛИНЫ НА

РЫЛЬЦЕ, РОСТ ПЫЛЬЦЕВЫХ ТРУБОК В СТОЛБИКЕ ПРИ СКРЕЩИВАНИИ ФОНД МАЛИНЫ РАЗНОЙ ПЛОИДНОСТИ class3

Морфологическая полноценность пыльцы малины разного уровня плоидности и содержание в ней крахмала

Морфологическая полноценность строения зрелых пыльцевых зерен является одной из характеристик фертильности пыльцы, которая, как правило, свидетельствует о функциональной активности и жизнеспособности мужских гамет. Окончательное суждение о фертильности пыльцы может быть вынесено при проращивании пыльцы на рыльце в заведомо совместимых комбинациях. Напротив, при стерильности пыльцевых зерен наблюдается морфологическая и физиологическая неполноценность в развитии пыльцы.4 Для стерильной пыльцы характерно отсутствие запасных питательных веществ, аномальное строение генеративной сферы, частичная или полная дегенерация цитоплазмы и т.д. Такая пыльца не может прорастать на рыльце, имеет аномальный рост в столбике и, следовательно, неспособна к своей основной оплодотворяющей функции.

У подавляющего большинства культурных растений фертильность пыльцы полиплоидов обычно оказывается ниже, чем таковая у исходных диплоидов (Поддубная-Арнольди В.А., 1948; Ефремов А.Е.,1967; Жатов А.И., Мигаль Н.Д., Коваленко В.М.-, 1969; Радионенко А.Я., 1972; Жатов А.И., 1983). Причины этого кроются в нарушении течения мейоза, образовании анеуплоидных гамет, изменении физиологических процессов в пыльцевых зернах и т.д. Выло показано, что фертильность пыльцы может сильно варьировать у различных растений внутри полиплоидной популяции. Все растения можно разделить на две основных группы. Первую группу составят растения с нормальным течением мейоза, высокой степенью фертильності пыльцы, довольно выравненной по размеру. Во вторую группу войдут растения с нарушениями в мейозе, низкой фертильностью пыльцевых зерен, с пыльцой, сильно варьирующей по величине. Показана перспективность выбраковки в популяции растений второй группы для повышения ее продуктивности (Зайковская Н.Э, Ярмолюк И.Т.т, 1972; Позднякова Н.Н., 1978; Чувашина Н.П., 1980).

Диплоидные сорта и формы малины характеризуются высоко ферТИЛЬНОЙ, однородной по величйне И форме ПЫЛЬЦОЙ ( Longley А., Darrow J.,1924 ; Жуков О.С., Рязанов А.А., 1976; Аверьянова М.А., 1981). Несколько пониженная фертильность пыльцы была свойственна сортам красной малины Оттава, Латам, Карнавал (Кичина В.В., 1975; Аверьянова М.А., 1981). В природе у диплоидных форм красной малины могло образовываться до 32,6$ стерильной пыльцы (Мандрик В.Ю., Петрус Ю.Ю., 1973).

Рост пыльцевых трубок диплоидов красной малины in vivo

Рост пыльцевых трубок в столбике характеризует один из промежуточных этапов во взаимодействии мужского и женского гамето-фитов, предшествующих оплодотворению и образованию зрелого зародыша, семени, плода. Этот процесс многократно изучался у большого количества культурных растений- в связи с задачами определения сроков и скорости роста пыльцевых трубок, временем оплодотворения, воздействия разнообразных факторов на скорость роста трубок (особенно температуры), изучением типа несовместимости у растений и задачами преодоления несовместимости и т.д. (Линскенс Н. ,1973; Поддубная-Арнольди В.А.; 1976; Литвак А.И., 1978; Haiteriein A.J., Clayberg CD., Teare J. D., 1980; Kuo C.G., Peng J.S., Tsay J. .1981).

Впервые АМИЦИ ( Amici,1924, ЦИТ. ПО Linskens H.F.,1964 ) заметил, что пыльцевые зерна прорастают на рыльце растений и пыльцевые трубки растут в столбике и входят в завязь. Прорастанию пыльцы предшествует ее улавливание рыльцем, когда оно находится в восприимчивом к пыльце состоянии, и набухание (гидратация) пыльцевого зерна ( Hesiop - Harrison J., 1975,1976 ).Пыльцевая трубка прорастает через проростковые поры пыльцевого зерна, проникает в столбик, где растет через проводниковую ткань или по каналу, и, дорастая до завязи, входит в семяпочку.

Существует два основных типа проникновения пыльцевой трубки в столбик, связанных с типом несовместимости. При спорофитном типе несовместимости при взаимодействии с тканями рыльца пыльцевое зерно выделяет особый фермент - кутиназу, который растворяет кутикулу, покрывающую сосочки рыльца. После прохождения через кутикулу пыльцевая трубка начинает расти вниз между кутикулой и пектоцеллюлозной стенкой. Далее пыльцевая трубка растет по тканям столбика до завязи. При реакции несовместимости нарушается действие фермента. Спорофитный тип несовместимости характерен для растений не имеющих на рыльце секреции ("сухой" тип рыльца), для семейств compositae и Cruciferae. Пыльцевые зерна при этом обычно трехклеточные ( Linskens Н.Р.,1964; Vasil I.К.,1974; Heslop-Harrison J., 1975,1976; Heslop-Harrison Y., 1977 ).