Введение к работе
Актуальность темы, В настоящее время культуры клеток животных и человека находят все более широкое применение в медицине и биотехнологии. Развитие клеточных технологий и тканевой инженерии выдвигает ряд новых требований к материалам, формирующим субстрат-подложку для культивирования субстратзависимых клеток млекопитающих, и составляющих основу имплантируемых тканевых конструкций. Данпые материалы должны поддерживать адгезию, рост и сохранение функциональной активности клеток, обеспечивать иммобилизацию и направленную доставку факторов, управляющих формированием тканей, быть нетоксичными и, по возможности, имитировать характеристики биополимеров (белков и углеводов).
Понимание механизма кооперативных взаимодействий в биополимерах, являющихся не только существенной составной частью, но и управляющей основой организма, явилось толчком к созданию так называемых "умных" или "восприимчивых" синтетических полимерных материалов. Способность восприимчивых полимеров резко и обратимо реагировать на изменение внешних условий определяет их использование в качестве функциональных материалов в самых разных областях. Восприимчивые полимеры используют для направленной доставки лекарств, разделения макромолекул, иммобилизации биокатализаторов и клеток и многого другого.
хараете; '^Ч^ИЙ^МпА подразумева-
В 1990 году группой японских ученых был разработан термочувствитель
ный субстрат на основе поли-Н-изопропилакриламида (ПНИПА), термочувстви
тельного полимера, несущего функциональные С=0 и N-H группы, характерные
для молекул белков, и являющегося аналогом полилейцина по химическому со
ставу (Bae et al., 1990). Поли-Н-изопропилакриламид испытывает фазовый пере
ход из нерастворимого в растворимое в воде состояние при температуре около
32С, называемой нижней критической температурой сольватации (НКТС)
(Heskins et al, 1968). Из всех Н,Н-алкилпроизводных акриламида ПНИПА ха
рактеризуется наиболее резким набуханием/коллапсом при переходе температу
ры через критическую точку, что определяется уникальным балансом гидро-
фобно/гидрофильных взаимодействий в молекуле данного полимера. При тем
пературе 37С полимер находится в нерастворимом состоянии, что позволяет
использовать его в качестве твердого субстрата для культивирования клеток.
Понижение температуры культивирования ниже НКТС вызывает гидратирова-
ние ПНИПА и открепление клеток от поверхности субстрата без применения
протеолитических ферментов и диссоциирующих агентов. Было показано, что
сохранение целостности связанных с мембраной белков, межклеточных контак
тов и синтезированного клетками матрикса при бесферментном откреплении
клеток позволяет поддерживать специфическую активность клеток на протяже
нии многих пассажей (von Recum, et al, 1998). Зависимое от температуры изме
нение адгезионных характеристик и набухания субстрата ПНИПА позволяет
проводить позиционирование двух типов сокультивируемых клеток (Yamato et
al. 2002) и о с у щ открепленио .и пероноо інітантшяк іи о в клеток
(Kikuchi et al., 1998). Данные ' -—"-»*
ют широкие возможности его применения для культивирования специализированных клеток, создания тканевых эквивалентов и проведения исследований в области клеточной биологии. Однако разработанный японскими учеными метод полимеризации ПНИПА при помощи электронного луча высокой энергии непосредственно на покрываемой поверхности, имеет ряд ограничений на тип покрываемой поверхности и приводит к неконтролируемому изменению физико-химических характеристик субстрата. Аппаратура, используемая для формирования электронного луча, недоступна большинству исследователей, работающих с культурами клеток, а низкая плотность наносимого покрытия существенно затрудняет открепление клеток. Таким образом, наряду с несомненными преимуществами субстрата ПНИПА при проведении разработок в области тканевой инженерии, биотехнологии и медицины, недостатки, связанные с существующей технологией формирования данных субстратов, делают актуальной задачу разработки новых композиций и новых методов формирования термочувствительных субстратов.
Как известно, термочувствительные субстраты, сформированные на основе линейных полимеров ППИПА, обладают слабой адгезивностью, вследствие высокой гидратируемости поверхности (Takezawa et al, 1990). Нами был предложен новый подход к разработке термочувствительного субстрата па основе ПНИПА, заключающийся во введении в состав линейного полимера ПНИПА мономерных звеньев Н-третбутилакриламида (НТБА), отличающегосяся от НИПА наличием одной дополнительной гидрофобной метальной группы. Для обеспечения ковалентного связывания субстрата с поверхностью и формирования сшитого полимерного геля было решено ввести в состав сополимера фото-индуцируемый мономер - акриламидобензофенон (ААБФ). Комплексное исследование особенностей фазовых переходов, физико-химических характеристик поверхности и биосовместимости субстратов ПНИПА/НГБА с различным соотношением мономерных звеньев представляет серьезный интерес для выявления факторов, определяющих свойства термочувствительных субстратов на микро и макроуровне, и их взаимодействие с клетками, жидкостями и тканями нашего организма. Таким образом, данная работа является актуальной не только для решения некоторых задач тканевой инженерии, биотехнологии и медицины, но и для проведения исследований, лежащих на стыке физики, химии и биологии.
Цель и задачи исследования.
Цель данной работы заключалась в разработке на основе сополимеров Н-изопропилакриламида (НИПА) и Н-третбутилакриламида (НТБА) и акрилами-добензофенона (ААБФ) новых термочувствительных материалов, предназначенных для поддержания роста субстратзависимых клеток, а также обеспечения открепления клеток от поверхности культивирования без применения протео-литических ферментов и диссоциирующих агентов.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: 1. Исследование особенностей фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА Выявление возможных механизмов модуляции температуры и кооперативно-
сти фазовых переходов сополимеров ПНИПА/НТБА в
растворах и в пленочных субстратах.
Разработка техники приготовления полимерных субстратов ПНИПА/НТБА и проведение анализа физико-химических характеристик их поверхности.
Исследование адгезии, роста и бесферментного открепления клеток от поверхности субстратов ПНИПА/НТБА Определение оптимального композиционного состава субстрата ПНИПА/НТБА, обеспечивающего высокую адгезионную и пролиферативную активность, а также эффективное бесферментное открепление клеток.
Разработка методики фотоиндуцируемого формирования полимерных сеток, определение влияния введенных в состав сополимера фотоиндуцируе-мых мономеров акриламидобензофенона (ААБФ) на термочувствительность формируемых субстратов ПНИПА/НТБА/ААБФ и их взаимодействие с клетками.
Научная новизна работы
Впервые исследования кооперативных фазовых переходов в растворах термочувствительных полимеров и полимерных субстратах ПНИПА/НТБА были проведены параллельно с определением физико-химических характеристик поверхности субстратов и исследованием активности клеток, культивируемых на них. В работе впервые получены следующие результаты:
1) обнаружено, что усиление межмолекулярных гидрофобных взаимодействий в сополимерах ПНИПА/НТБА, которое происходит при увеличении процентного содержания НТБА, вызывает изменение конформации сколапсиро-вавшего сополимера и приводит к компактизации его структуры.
определено, что усиление межмолекулярных гидрофобных взаимодействий в сополимерах ПНИПА/НТБА при увеличении процентного содержания гидрофобного мономера НТБА приводит к линейному снижению температуры и нелинейному снижению кооперативности фазового перехода в растворах сополимеров ПНИПА/НТБА и пленочных субстратах, приготовленных на их основе.
показано, что снижение размеров кооперативных доменов при увеличении процентного содержания гидрофобных мономеров приводит к значительному снижению темпов объемно-конформационных преобразований в растворах полимеров и термочувствительных субстратах ПНИПА/НТБА
установлено, что при увеличении процентного содержания НТБА в сополимере ПНИПА/НТБА происходит снижение числа полярных групп, находящихся в конформации, подходящей для образования водородных связей с молекулами воды, что приводит к изменению гидрофильно/гидрофобных свойств поверхности субстратов при 37С и обуславливает изменение клеточного ответа.
Практическое значение
Разработанные нами субстраты ПНИПА/НТБА поддерживают адгезию, пролиферацию клеток и экспрессию большинства генов на уровне, сравнимом с культивированием на специально обработанном для роста клеток полистироле, но при этом обеспечивают эффективное открепление клеток без применения ферментов и диссоциирующих агентов. Данные субстраты могут быть исполь-
зованы для позиционирования трех и более типов клеток, создания сложных тканевых конструкций, предназначенных для восстановления поврежденных органов и тканей. Термочувствительные субстраты обеспечивают возможность получения интактных первичных культур клеток и сохранения их специфической активности в течение многих пассажей, что открывает перспективу их применения в биотехнологии, для производства биологически активных препаратов, а также в медицине для проведения клеточной терапии тканей и органов. Высокая эластичность разработанных субстратов в сочетании с возможность контролируемой доставки лекарственных препаратов открывают возможность применения разработанных нами материалов в качестве полимерного покрытия имплантируемых конструкций.
Апробация работы и публикации. Работа была представлена на Втором съезде биофизиков России (Москва, 1999), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пушино, 2000), 14 конференции European Colloid and Interface Society , (Греция, 2000), IV Международной конференции "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов"( Москва , 2001), конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" ( Пушино 2001), 18 Европейской конференции по биоматериалам, (Штудтгарт, Германия, 2003). По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, и пяти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитированной литературы из ,^у наименований. Работа изложена на >/у^ЯЬтраницах машинописного текста и содержит "2% рисунка и sif- таблиц.
Высокомолекулярные полимеры поли-Н-изопропилакриламид (ПНИПА), поли-Н-третбутилакриламид (ГОГГБА), а также сополимеры ПНИПА/НТБА, в соотношении, 85/15, 65/35 и 50/50 моль/моль соответственно, а также фотоин-дуцируемый сополимер, включающий акриламидобензофенон ПНИ-ПА/НТБА/ААБФ в соотношении 85/13.8/1.2 соответственно, были синтезированы, очищены, охарактеризованы и предоставлены для исследований Т.А Го-лубевой и А.В. Гореловым. (Department of Chemistry, University College Dublin).
Полимерные субстраты формировали на покрываемой поверхности путем медленного высушивания 5% растворов полимеров в 100% этиловом спирте. Толщину пленки определяли микрометром. Формирование поперечных сшивок и ковалентное связывание субстратов с поверхностью полистирола проводили облучением субстратов УФ-лампой ДРТ-220 при энергетической освещенности 0,1 Вт/см2. (Рис.1)
И Н
І I
CHj— с — сн,— сн— сн,— с —
с=о с==о с=^о
і ! L
Н,С СН, ^^ сн1
Ряс. ]. Схема ковалентного связывания субстрата ГШИПА/НТБА/ААБФ с поверхностью полистирола; 1-ІІИПА; 2- ААБФ; 3-ІГГБА; 4-полистирол
За процессами коллапса/сольватации следили по изменению оптического пропускания 0.02% растворов полимеров, измеренного на длине волны 500 им. Оптическое пропускание водных растворов полимеров было измерено на спектрофотометре "Hitachi U-3410", оснащенном термостатируемыми кюветами с длиной оптического пути 1 см. Скорость прогрева и охлаждения кювет растворов составляла 0.2С/мин, точность регистрации температуры +0.ГС.
Метод гравиметрии был применен для исследования процесса набухания полимерных субстратов в воде. Степень набухания полимерных субстратов определяли как отношение массы воды в набухшем полимере к массе сухого полимера. Равновесное содержание воды определяли как отношение сорбированной полимерным субстратом в течение суток воды, к весу набухшего полимера. Взвешивание проводили на весах Mettler HL52, точность определения веса составила +0.05мг
Кооперативный фазовый переход в водных растворах термочувствительных полимеров был изучен методом дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии. Измерения проводились на микрокалориметре ДАСМ-4 (НПО "Биоприбор") с объемом измерительной ячейки 0.47 мл. Сканирование проводилось в диапазоне температур 1-50С, при скорости нагрева 5К/мин и избыточном давлении 2 атм. Точность регистрации температуры составляла+0. ГС.
Метод атомной силовой микроскопии был применен для анализа шероховатости поверхности полимерных субстратов. Измерения проводились на приборе Digital Instruments Dimension 3100 при комнатной температуре и влажности воздуха в контактной моде с использованием наконечника кантилевера изготовленного из нитрида кварца (коэффициент жесткости 0.57 Н/м). Шероховатость субстратов определялась как среднее геометрическое (Root Mean Square roughness (Rms)) стандартное отклонение от среднего значения Zq, высоты в исследуемой области
Метод инфракрасной Фурье- спектроскопии полного отражения был применен для анализа химической композиции поверхности исследуемых субстратов. Измерения проводились на ИК-спектрометре FTIR-8300 фирмы Himadsu, в котором многократное отражение и усиление детектируемого сигнала достигается при помощи кристалла алмаза, входящего в непосредственный контакт с исследуемой поверхностью. Сканирование проводилось в диапазоне длин волн 500 -4000 смл, результаты измерений усреднялись по 40 сканированиям, разрешение пиков составило 4 см*1.
Измерение эластических свойств поверхности полимерных пленок проводились при комнатной температуре и окружающей атмосфере на приборе Nano-Hardness-Tester (NHT CSM Instruments), при помощи индентора Берковича с алмазным наконечником. В качестве субстрата для нанесения полимерных покрытий мы использовали покровные стекла, глубина индентации (деформации) не превышала 1 мкм. Определение модуля Юнга проводили методом Оливера и Пхарра из кривой разгрузки после третьего цикла индентации.
Исследование краевого угла смачивания поверхности было проведено на гониометре собранном А.В.Гореловым на основе Newport Optics с дополнительными оптомеханическими устройствами Newport Optics и Edmund Optics. Анализ изображения был проведен с использованием программного обеспечения DROPimage (Rame-Hart Inc). Измерения проводились на полимерных субстратах толщиной 5-Ю мкм, сформированных на поверхности покровных стекол, на платформе с контролируемой температурой 37С в атмосфере, насыщенной паром. Деионизованная вода подавалась на поверхность субстрата со скоростью 0.002мл/мин через иглу, соединенную с перистальтическим насосом, что обеспечивало среднюю скорость продвижения линии трехфазного контакта около 0.05мм/мин. Краевой угол смачивания поверхности определялся путем численного анализа профиля капли в точке контакта.
В работе использовали культуры клеток линий Vero, NCTC clone L929, НЕР-2 и ВНК. Клетки культивировали в среде Игла в модификации Дальбекко (ДМЕМ), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), 50мкг/мл пенициллина, 50мкг/мл стрептомицина и 1% L-глутамина при 37С во влажной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5%СОг- Ферментативное открепление клеток проводили в смеси растворов трипсина и версена (1:1). Плотность посева составляла 30-50 тыс.кл/см2. Подсчет живых клеток проводили с использованием камеры Горяева, жизнеспособность клеток определялась по исключению трипанового синего. Посев клеток на поверхность термочувствительных субстратов и наблюдения за клетками проводили на термостатируе-мой поверхности при температуре 37С, поддерживаемой жидкостным термостатом MLM U10. Кинетику прикрепления клеток к поверхности субстратов оценивали по убыли клеток из среды. Бесферментное открепление клеток от поверхности полимерных субстратов проводили при температуре 5С. Визуальное наблюдение за процессом открепления клеток проводили при помощи микроскопа Биолам-МПЗ, регистрируя время, в течение которого происходит открепление более 90% клеток с поверхности субстрата. Микрофотосъемка клеток проводилась на микроскопе Peraval Interphako методом дифференциально-интерференционного контраста.
