Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Анатомия и морфология аортального клапана человека 10
Глава 2. Типы протезов и трансплантатов, используемых в хирургии пороков клапанов сердца 17
2.1. Механические протезы клапанов сердца 18
2.2. Биологические протезы клапанов сердца 19
2.3. Трансплантаты клапанов сердца 25
Глава 3. Кальцификация трансплантатов клапанов сердца 28
3.1. Общие представления о кальцификации 28
3.1.1 .Характеристика отложений фосфатов кальция .29
3.1.2. Физико-химические механизмы образования кристаллов гидроксиапатита в растворе 32
3.2. Общие представления о механизме кальцификации биоматериалов 36
3.2.1. Концентрационная гипотеза кальцификации биоматериалов 37
3.2.2. Клеточная гипотеза кальцификации биоматериалов 39
3.3. Кальцификация трансплантатов клапанов сердца 41
Глава 4. Использование клеточных технологий для уменьшения кальцификации трансплантатов клапанов сердца 45
Экспериментальная часть.
Материалы и методы исследований 52
- Анатомия и морфология аортального клапана человека
- Биологические протезы клапанов сердца
- Физико-химические механизмы образования кристаллов гидроксиапатита в растворе
- Использование клеточных технологий для уменьшения кальцификации трансплантатов клапанов сердца
Введение к работе
В кардиохирургии клапанных пороков сердца наряду с механическими клапанами и биопротезами применяются трансплантаты клапанов сердца, которые, в отличие от биопротезов, не подвергаются обработке фиксирующими агентами, такими, как глутаровый альдегид или эпоксисоединения. Преимуществами использования трансплантатов являются отсутствие необходимости применения пациентом долговременной антикоагулянтнои терапии, оказывающей повреждающее действие на печень. Это имеет большое значение, поскольку отмечаются случаи гибели пациентов с механическими протезами клапанов сердца из-за нарушения приема пациентами антикоагулянтных средств. Другим преимуществом является возможность ремоделирования трансплантатов путем их репопуляции клетками реципиента перед имплантацией, а также за счет миграции клеток из окружающих тканей после имплантации (Angell et al, 1989). Способность к ремоделированию особенно важна у детей и пациентов молодого возраста, когда необходимо обеспечить не только поддержание и обновление структуры трансплантата, но и его рост. Однако сроки функционирования трансплантатов ограничены из-за их кальцификации. Предлагаются различные гипотезы о механизме инициации кальциноза трансплантатов и биопротезов клапанов сердца. В частности, рассматривается предположение о связи инициации кальциноза с компонентами погибших клеток (мембраны клеток и органоидов, фрагменты ДНК, кальций-связывающие белки - кальсеквестрин, кислые фосфолипиды и др.) (Ferrans et al., 1980; Valente et al, 1985; Розанова и др., 1999). Согласно другому предположению, центры инициации кальциноза связаны с компонентами тканевого матрикса: с коллагеном I типа, фибронектином (Watson et al., 1998), эластином, кальций-связывающими белками (гла-протеины, остеокальцин, остеопонтин, остеонектин), фосфопротеинами (Shanahan et al., 1998; Proudfoot et al., 1998), щелочной фосфатазой (Hui et ah, 1998). При гибели клеток в результате
ферментативного лизиса может также нарушаться связь гликозаминогликанов с коллагеном в тканевом матриксе, что также может способствовать образованию сайтов, аффинных к фосфатам кальция (Loose et al., 1993). Однако ясного представления о механизме инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов в настоящее время нет.
Для повышения биосовместимости трансплантатов клапанов сердца и сосудов предлагается разрушать в них клетки донора до имплантации (девитализация ткани) (О' Brien et al., 1999; Teebken et al., 2000). Предполагается, что девитализация уменьшит иммунную реакцию организма реципиента на трансплантат, поскольку считается, что его иммуногенность определяется в основном клетками (Johnson et al., 1997). В первую очередь это относится к ксенотрансплантатам, однако говорится о повышении биосовместимости и аллографтов. На основе этого подхода уже производятся ксенографты, которые имплантируются больным. Широкое внедрение ксенографтов было бы важным этапом в кардиохирургии, поскольку они являются более дешевыми, доступными и снимают этические проблемы, связанные с использованием трансплантатов клапанов сердца человека. Однако их использование осложнено риском зоонозов. Помимо снижения иммуногенности трансплантатов, предполагается, что в результате лизиса и разрушения клеток донора до имплантации будут элиминированы центры нуклеации кальциноза. Однако неизвестно, в какой степени девитализация трансплантатов клапанов сердца может предотвращать кальциноз, поскольку остается неясным, какую роль играют клетки и их гибель в инициации кальциноза трансплантатов.
Для ускорения ремоделирования и предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов предложено также заселять их после девитализации клетками реципиента: миофибробластами, эндотелиальными, стволовыми клетками (Eberl et al., 1992; Loose et al.,
1993; Curtil et aL, 1997; Steinhoff et aL, 2000; Акатов и др., 2001; Hoerstrup et aL, 2002). При этом подразумевается, что посеянные клетки будут предотвращать кальциноз путем поддержания гомеостаза кальция и фосфатов, рН среды и т.д. Несмотря на достаточно большое количество работ в этом направлении, остается неясно, в какой степени девитализация трансплантатов и последующий посев клеток реципиента могут способствовать ремоделированию ткани и предотвращать кальциноз. Неизвестно, будут ли посеянные клетки мигрировать в ткань и что для этого необходимо.
В связи с этим возникает настоятельная необходимость в исследовании механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца с целью разработки на основе полученных представлений способов его предотвращения.
Цель работы. Целью данной работы являлось изучение механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка на основе полученных представлений способов его предотвращения. Основные задачи исследования.
Изучение кальциноза трансплантатов клапанов сердца после их девитализации известными способами.
Изучение локализации центров инициации кальциноза в трансплантатах клапанов сердца.
Разработка способа предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца.
Исследование кальциноза трансплантатов клапанов сердца после их девитализации и заселения клетками реципиента.
Научная новизна работы.
Впервые предложена гипотеза о ведущей роли митохондрий в инициации кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Впервые с помощью электронной микроскопии показано, что центрами кальцификации в трансплантатах стенок аорты являются митохондрии.
Впервые показана возможность полного предотвращения кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов путем обеспечения гибели клеток в условиях, препятствующих аккумуляции кальция митохондриями. Впервые показано, что гладкомышечные клетки, изогенные реципиенту, посеянные на девитализированные трансплантаты стенок аорты, снижают их кальциноз. Полученные данные расширяют представление о механизмах нормальной и патологической кальцификации биологических тканей, что актуально не только для проблемы понимания механизма кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов, но и для проблемы патологической минерализации тканей в организме, в частности при атеросклерозе сосудов. Практическая значимость.
На основе проведенных исследований разработан эффективный способ предотвращения кальциноза трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Предложенный способ запатентован и внедряется в технологический регламент производства аллотрансплантатов клапанов сердца в НЦ ССХ им. А.Н.Бакулева РАМН, г. Москва. Полученные результаты также являются основой для разработки способа снижения кальцификации трансплантатов клапанов сердца и сосудов с помощью посева гладкомышечных клеток реципиента на девитализированные трансплантаты клапанов сердца и сосудов.
Анатомия и морфология аортального клапана человека
Изучение механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка способов его предотвращения проводились для аортального клапана, поскольку чаще наблюдается кальцификация при протезировании митрального и аортального клапанов (Hultgren, 1948).
Аортальный клапан (АК) расположен между левым желудочком (ЛЖ) и аортой (рис.1). ЛЖ выталкивает кровь в аорту через открытый АК. Главной задачей АК является обеспечение свободного потока крови из ЛЖ в аорту и недопущение ее обратного тока (Собовый, 2002; Иванова, 2003).
Синусы являются расширяющимися карманами, расположенными в наиболее проксимальной части восходящей аорты. Правая и левая коронарные артерии в норме связаны с правым и левым коронарными синусами. Присутствие синусов и их суммарная кривизна снижают пиковую нагрузку на створки за счёт перераспределения нагрузки со створок на аортальную стенку. Поэтому сохранение эластичности синусов является важным фактором долговечности створок и аортального клапана в целом. Створки АК в норме похожи на полулуния, основания которых в полтора раза длиннее свободного края. В открытом АК линия прикрепления створок к стенке аорты U-образна, а все три створки образуют аортальное фиброзное кольцо, называемое фиброзной «короной». Синотубулярное соединение разграничивает верхний край синусов и начало восходящей аорты.
Главными компонентами створок, определяющими их механические свойства, являются коллагеновые и эластиновые волокна, имеющие разную сопротивляемость нагрузкам. Эластиновые волокна могут быть растянуты до 100% по сравнению с исходной длиной. Коллагеновые волокна более жёсткие и не могут удлиняться более чем на 10 - 15% (Wright, 1974). Коллагеновые волокна определяют прочность ткани, а эластиновые волокна - ее упругость. Преобладание коллагеновых волокон в циркулярном направлении приводит к тому, что усиление нагрузки лишь слегка увеличивает удлинение створок. В радиальном направлении, где преобладают эластиновые волокна, наблюдается значительное удлинение ткани без существенного увеличения напряжения. Такая анизотропия характерна для большинства биологических тканей, имеющих волокнистую основу с различными направлениями, вдоль которых ориентированы волокна. Явление анизотропии связано с различными факторами. Во-первых, фиброзные компоненты створок достаточно свободно связаны друг с другом и движутся в матриксе друг относительно друга, при этом толщина створок в течение сердечного цикла изменяется (Hilbert, Ferrans, 1992). Во-вторых, на разных уровнях фиброзных структур наблюдается значительная извитость волокон. Из-за нее малый начальный уровень напряжения сохраняется в ткани до тех пор, пока волокна полностью не распрямятся. Это предохраняет волокна от повреждений и разрывов. Полное распрямление волокон неестественно, так как нагрузки, которым подвергается клапан, в 500 - 1000 раз меньше тех, которые может выдержать материал створок (Зайцев, 1988). Коллагеновые волокна, достигающие комиссур, вплетаются в волокна стенки синусов. Синус и створка образуют в диастолу круглое образование. Это служит передаче кругового напряжения створок на стенку синуса и распределению напряжения на большую площадь. Расширение корня аорты также является очень важным фактором предотвращения обратного изгиба, сморщивания тканей и их дегенерации. Напряжение створок распределяется неравномерно. Оно максимально в области прикрепления створок, где и происходит наиболее часто отрыв створок (Барбараш, 1996).
Участие всех компонентов клапана в перераспределении напряжения свидетельствует о необходимости максимального соответствия характеристик заместителя клапана его нативным свойствам для обеспечения долговечности работы. Очень важным в сопротивляемости клапана постоянным нагрузкам считается также постоянное обновление клеток и матрикса тканей, поэтому долговечность трансплантатов клапанов связывают с наличием в них живых клеток (O Brien et at., I987 a).
Аорта, входящая в состав аортального клапана, относится к артериям эластического типа, стенки которых образованы, в основном, многочисленными слоями эластических мембран и подразделяются на три слоя (рис. 4); 1 - внутренняя оболочка (tunica intima), 2 - средняя оболочка (tunica media) и 3 - наружная оболочка (tunica adventitia).
Внутренняя оболочка аорты изнутри выстлана эндотелием, который составляет часть этой оболочки, а снаружи граничит с пластинкой эластина, которую называют внутренней эластической мембраной; она также считается частью внутренней оболочки. Интима составляет около 20% общей толщины стенки аорты эластического типа и содержит меньше эластина, чем средняя оболочка. Основной тип клеток в интиме -относительно недифференцированные гладкомышечные клетки, а также другие типы клеток, например фибробласты и макрофаги.
Средняя оболочка образует основную массу стенки артерии эластического типа и состоит преимущественно из концентрически расположенных фенестрированных (от лат. fenestrae - окна) эластических мембран, между которыми спирально располагаются гладкомышечные клетки. Межклеточное вещество, вырабатываемое этими клетками, состоит из эластина, коллагеновых волокон и имеет высокое содержание сульфатированных гликозаминогликанов (ГАГ). ГАГ связаны с неколлагеновыми белками, образуя протеогликаны, которые, в свою очередь, формируют сложную сеть макромолекул, способную удерживать сравнительно большое количество тканевой жидкости. Через тканевую жидкость клетки стенок аорты и створок сердечного клапана снабжаются кислородом и питательными веществами, удаляются метаболиты. Поэтому тканевая жидкость в матриксе является важнейшим компонентом в поддержании жизнеспособности клеток и, следовательно, структуры и функции всей ткани (Хэм, Кормак, 1983, б).
Биологические протезы клапанов сердца
Биологическими протезами называют клапаны из биологических тканей, консервированных в растворах глутаральдегида (ГА), который увеличивает их структурную стабильность и снижает возможность развития иммунного конфликта (Константинов Б.А., Дземешкевич, 1983). В последнее время для консервации биопротезов используются также эпоксисоединения (Барбараш, 1996). Биопротезы клапанов сердца имеют, как правило, естественный или смоделированный трехстворчатый запирательный элемент биологической природы, фиксированный на искусственном опорном каркасе.
Для изготовления биопротезов предлагаются различные ткани ксеногенного происхождения (свиньи или теленка): корень аорты или лёгочного ствола, перикард, твёрдая мозговая оболочка, глиссонова капсула печени, широкая фасция бедра. Биопротезы могут быть цельные и композитные, выполненные на каркасе и бескаркасные. Широко используются биопротезы, изготовленные из аортального ксеноклапана, фиксированные глутаровым альдегидом (ГА), и трёхстворчатые клапаны, изготовленные из бычьего перикарда, фиксированного глутаровым альдегидом, либо эпоксисоединениями. Остальные клапаны либо ещё мало изучены в клинике, либо их непригодность для применения достоверно доказана.
Фиксация ксенотканей ГА или эпоксисоединениями вызывает гибель клеток и тем самым, как полагают, устраняет их иммуногенность. За счёт межмолекулярных связей, образующихся при фиксации, усиливается стабильность коллагеновых структур клапана, что увеличивает механическую прочность биопротеза. Недостатком такой фиксации служит то, что она приводит к дисфункции ткани с появлением кальциноза. Кроме того, фиксированная ткань не способна к репопуляции клетками реципиента.
В биопротезировании аортального и других клапанов сердца главным образом используются свиные АК. Они подходят по размерам, толщина их створок сравнима с толщиной створок АК человека, а структура фиброзного кольца, в отличие, например, от бычьего клапана, позволяет как помещение на каркас, так и бескаркасный тип биопротеза. Однако, существует и значительная разница между человеческим и свиным АК. Так, в человеческом клапане левая коронарная створка (ЛКС) короче двух других створок, а в свином - некоронарная (НКС) короче и её круговая длина чуть больше (рис.6). Кроме того, мышечная часть межжелудочковой перегородки свиного АК вклинивается в фиброзное кольцо ПКС, в отличие от АК человека, а кольцо аортального клапана свиньи на 1/3 состоит из хряща (Sands etai, 1969).
Наличие мышечного компонента, который из-за неудовлетворительных прочностных свойств должен быть толще других частей клапана, вызывает сужение просвета клапана, особенно при помещении на каркас. Мышечная часть, изменяя внутриклапанную гемодинамику, приводит также к неполному открытию ПКС каркасного БП (Зайцев, 1988). Кроме того, некротизация мышечной ткани может послужить инициатором кальцификации протеза (Ferraris, 1980). Однако удаление этого мышечного массива необратимо повреждает ПКС.
Схема АК свиньи. Пунктиром показана граница мышечной части клапана. ЛКС, ПКС и НКС - соответственно левая, правая и некоронарная створки. (Зайцев, 1988).
Считается, что протезы из бычьего перикарда по многим показателям хуже свиных АК (Зайцев, 1988). Структура коллагена в перикарде хаотична и не может перераспределять между структурами биопротеза напряжения, возникающие при его функционировании в течение сердечного цикла. В клинике перикардиальные биопротезы в аортальной позиции показывают более раннюю дегенерацию, чем при имплантации комплексов с нативными створками (Goffin е! а!., 1984). После дегенерации и связанной с ней кальцификации другой важной причиной дисфункции перикардиальных клапанов являются вертикальные разрывы в местах прикрепления створок к каркасу (Maxwell, 1989).
Каркасные биопротезы состоят из нативного (цельного или композитного) свиного аортального клапана или створок, изготовленных из бычьего перикарда, прошедших процесс химической фиксации и помещённых на жесткий или гибкий каркас (рис. 7). Каркас покрывается тканью - например, дакроном или тефлоном, тканью также покрывается и опорное кольцо. Такая конструкция позволяет при имплантации обходиться одним рядом швов и уменьшает время искусственного кровообращения. Гемодинамика каркасных биопротезов является промежуточной между механическими и бескаркасными протезами (Rashtian et al, 1990). Поток крови через них центральный, но обструктивное влияние манжеты приводит к нарушению ламинарности потока. Биоткань, нагрузка на которую не смягчается другими структурами сердца, испытывает ненормальные нагрузки. Даже модели на гибких каркасах, в какой-то мере моделирующие изменения геометрии аорты, показывают неустранимо высокие напряжения в местах крепления биоткани к каркасу (Thubnkax et а!., 1983; Jamieson, 1995).
Биологические клапаны на каркасе в большинстве случаев не требуют антикоагулянтной терапии, однако их основным недостатком является риск первичной дегенерации ткани и кальциноза, который возрастает у молодых пациентов. Долговечность каркасных БП значительно ограничена, особенно при имплантации в аортальную позицию. Средний срок службы каркасных БП достигает 15 лет (Зайцев, 1988). На рисунке 8 показаны эксплантированные каркасные БП и бескаркасные аллографты.
Бескаркасные клапаны отличаются отсутствием у них опорного каркаса при возможном наличии обшитой тканью манжеты, и также бывают нативными или сшитыми из различных биологических тканей. Бескаркасные биопротезы практически свободны от многих недостатков каркасных биопротезов. Снятие напряжений, возникающих при помещении АК на каркас, в сочетании с положительным эффектом фиксации на сохранность морфологической структуры и механических свойств ткани створок и ламинарным необструктивным потоком крови дают предпосылки к повышению их долговечности, а также сопротивляемости к инфекции. При отсутствии манжеты БКП можно использовать при эндокардите, тогда как имплантация механического или биологического протезов, содержащих элементы обшивки синтетической тканью, довольно опасна. Развитие протезного эндокардита в большой мере связано с проникновением бактерий в манжету протеза.
Физико-химические механизмы образования кристаллов гидроксиапатита в растворе
Как показали исследования E.D. Eanes и соавторов (Eanes et al., 1965), проведенные с целью найти отличия между физико-химическими и физиологическими факторами, лежащими в основе образования биологических гидроксиапатитов и описывающие закономерности преципитации фосфатов кальция в водных растворах при высоком рН (10,5) и высоких начальных концентрациях реагентов, при смешивании которых образуется 0.15 М фосфата кальция, в процессе преципитации фосфатов кальция в растворе выделяется 3 стадии:
Первая стадия начинается непосредственно при смешивании растворов с образования твердых частиц и продолжается около 5 часов. Сразу после смешивания солей в осадке обнаруживается 90 % добавленного кальция и 100 % фосфатов. Частицы осадка в этот период характеризуются, в основном, аморфно-подобной дифракционной структурой. Соотношение Са/Р в образовавшемся осадке аморфного фосфата кальция составляло 1,46. К 5 часу после смешивания в осадке было уже 92 % кальция (происходит медленное встраивание кальция в осадок) и 15 % осадка, согласно рентгеноструктурному анализу, имело кристаллическую структуру. В последующие 2 часа (вторая стадия) происходило образование кристаллической структуры во всем осадке и исчезновение аморфной фазы. В это время наблюдается ускорение связывания кальция осадком с 92 до 97 %. В дальнейшем наступала 3 стадия, когда структура осадка оставалась кристаллической, но происходило включение оставшегося кальция из раствора в осадок (с 97 до 98,5 %), повышение соотношения Са/Р в кристаллах апатита до 1,67, снижение рН раствора с 10.5 до 9.5 (обусловленное, по-видимому, тем, что ионы гидроксила включаются в структуру кристаллов ГАп), укрупнение кристаллов ГАп (процесс перекристаллизации). Таким образом, в пересыщенном растворе фосфатов кальция быстро образуется их аморфный осадок. В аморфном осадке в течение около 5 часов (in vitro) образуются центры кристаллизации, на которых в течение последующих 2 часов происходит кристаллизация всего осадка. Такое ускорение кристаллизации указывает на то, что процесс имеет аутокаталитический характер. После этого происходит медленный, в течение нескольких недель, процесс перекристаллизации осадка. Этот процесс, известный как Оствальд-созревание, обычно считается характерным признаком растворения более мелких и более растворимых кристаллов и реосаждения растворенного материала на растущей грани более крупных, менее растворимых кристаллов (Termine, Posner, 1966).
Время первой стадии зависит от содержания в растворе органических примесей, рН, вязкости, ионной силы раствора и температуры (Eanes et al., 1965). При увеличении температуры от 20С до 30С скорость кристаллизации при одном и том же пересыщении возрастает вдвое. В среднем с повышением температуры на 10С скорость кристаллизации возрастает в 2,87 раза. Это может объясняться повышением вероятности преодоления потенциального барьера кристаллической структуры за счет тепловых флуктуации в аморфном фосфате кальция. Это, конечно, справедливо в области температур ниже температуры плавления кристалла.
Важную роль в зарождении отложений аморфного осадка фосфатов кальция могут играть ассоциаты, или, по другому, дозародышевые комплексы (Хамский и др., 1969). В насыщенных и ненасыщенных растворах ассоциаты различной величины и отдельные молекулы находятся между собой в стационарном равновесии. В условиях такого равновесия идут процессы взаимного превращения частиц, но число комплексов данного размера при этом не меняется. Распределение по размерам остается постоянным. В пересыщенном растворе происходит быстрый рост ассоциатов (дозародышей) до размеров осаждающихся частиц, то есть до образования зародышей аморфных отложений. Поэтому пересыщенный раствор становится неустойчивым, метастабильным.
Что касается вопроса о природе образования центров кристаллизации в аморфном фосфате кальция, то для объяснения этого явления представляет интерес гипотеза о спонтанной кристаллизации, согласно которой ниже температуры плавления среди беспорядочно перестраивающихся молекул могут образовываться и небольшие, правильно ориентированные группы (Кобеко, 1933). Для образования таких групп необходимо преодоление барьера свободной энергии, чему способствует тепловое движение молекул. Поэтому возникновение центров кристаллизации ускоряется с ростом температуры в области ниже температуры плавления кристалла. После образования кристаллической структуры работа, требующаяся для разрушения ориентированного участка, или скрытая теплота плавления зародыша больше величины тепловых флуктуации, и он не разрушается и продолжает расти. Преодоление потенциального барьера центров кристаллизации объясняет большое время их образования. Выше температуры плавления величина тепловых флуктуации достаточно велика и не позволяет образовываться подобным центрам (Хамский, 1971).
Однако теория самопроизвольной кристаллизации встречает ряд трудностей. Самопроизвольное зарождение ничтожных по объему центров кристаллизации так же маловероятно, как и самопроизвольная конденсация пересыщенного пара. Мельчайшие кристаллические зародыши со скрытой теплотой плавления, близкой к величине тепловых флуктуации, неустойчивы (Кобеко, 1933). Начало образования кристаллических зародышей облегчается посторонними центрами кристаллизации. Известно, что вещества кристаллизуются тем труднее, чем лучше они очищены от посторонней взвеси. По всей видимости, центрами кристаллизации могут служить не только кристаллы того же самого вещества, но и другие твердые тела, находящиеся в соприкосновении с жидкостью (Мейер, 1972). Опыты с введением затравок различных веществ показали, что их инициирующее действие тем сильнее, чем больше развита их поверхность (Tung and Brown, 1983). Механизм образования зародышевых центров на посторонних твердых примесях может быть связан с адсорбцией на их поверхности молекул жидкости. Адсорбционные мономолекулярные слои строго ориентированы и могут оказывать ориентирующее действие на ближайшие несколько слоев молекул жидкости. Подобные образования могут ориентировать фосфаты кальция и служить начальными центрами кристаллизации в тех участках, где такая ориентированность выше. Часто кристаллизацию ускоряет даже царапание стенок сосуда, так как благодаря шероховатости создаются центры кристаллизации (Мейер, 1972). Механизм действия примесей может заключаться и в том, что их поверхности адсорбируют молекулы или ионы кристаллизующегося вещества. В результате образуется адсорбционный слой, который, постепенно уплотняясь, превращается в слой кристаллического вещества. Образование зародышей на готовой поверхности происходит легче, чем в объеме раствора, потому что работа их образования на границе раздела фаз, по всей видимости, меньше работы, требующейся для возникновения зародыша в объеме раствора. Если в растворе имеются частицы самого кристаллизующегося вещества, то они действуют как затравка. При небольших пересыщениях они вырастают в более крупные кристаллы, и образования новых центров кристаллизации вообще не происходит. Если же пересыщение велико, то и рост и образование новых зародышей могут происходить одновременно. Близко к действию затравки влияние примесей, изоморфных с кристаллическим веществом. Чем ближе кристаллическая структура примеси и основного вещества, тем эффективнее ее действие. Центрами кристаллизации могут стать и вещества, совсем не похожие по своей природе на кристаллизующиеся. Можно предположить, что в качестве таких веществ могут быть структуры тканевого матрикса, погибших клеток. Вместе с тем следует отметить, что примеси, особенно сложные органические вещества, могут вызывать не только ускорение, но и замедление роста кристаллов в зависимости от их гидрофобности/гидрофильности, афинности к фосфатам кальция и т.д.
Использование клеточных технологий для уменьшения кальцификации трансплантатов клапанов сердца
Одним из перспективных направлений в области создания протезов для сердечно-сосудистой хирургии считается использование клеточных технологий. Можно выделить два подхода в этом направлении: создание биоинженерных конструкций с использованием клеток сосудов и гидрогелей (а) и модификация тканевого матрикса трансплантатов клетками реципиента (б).
В первой группе работ предлагается желировать суспензию клеток (гладкомышечные, миофибробласты) в растворе, содержащем полигликолиевую кислоту (Shinoka et al, 1995; Zund et al, 1997; Ye et al, 2000, 6; Hoerstrup et al, 2001; Jockenhoevel et al, 2001; Schnell et al, 2001; Watanabe et al, 2001) коллаген (Rothenburger et al, 2001), или фибрин (Ye et al, 2000, а). В результате культивирования миофибробластов в указанных биодеградируемых гелях, согласно этим работам, формируется трехмерная структура, сходная с тканевым матриксом, которую можно использовать после посева на них эндотелиальных клеток для создания сосудов и клапанов сердца.
Другой подход предполагает разрушение клеток донора (девитализацию или децеллуларизацию - decellularisation) и последующий посев на трансплантат полученных от реципиента культуральными методами миофибробластов (Steinhoff et al, 2000; Акатов и др., 2001), эндотелиальных клеток (Eberl et al, 1992; Loose et al, 1993; Lehner et al, 1997; Bader et al, 1998), либо миофибробластов с эндотелиальными клетками (Curtil et al, 1997; Schmidt et al, 2000; Teebken et al, 2000). Схема этого подхода показана на рис.11. Предполагается, что разрушение клеток донора будет предотвращать иммунную реакцию на трансплантат, а посев и внедрение клеток реципиента ускорит репопуляцию и ремоделирование тканевого матрикса трансплантата. Считается, что внедрение клеток реципиента и репопуляция трансплантатов будут также способствовать предотвращению кальциноза трансплантатов путем снижения рН тканевой жидкости, за счет секреции веществ, ингибирующих отложение солей кальция (полифосфаты, фосфонаты), фагоцитоза некротизированных клеток, которые могли бы стать центрами кальцификации (Valente et а/., 1985; Розанова, Васин, 1999).
Кроме того, наличие функционирующих клеток будет способствовать поддержанию нативнои, некальцинирующеися структуры ткани за счет синтеза компонентов тканевого матрикса, включая коллаген, эластин, гликозаминогликаны (Dahm et al., 1996; Stock et a/., 2002). Известно также, что ГАп становится более растворимым при увеличении концентрации СО? в ткани, что связано с повышением кислотности среды за счет образования угольной кислоты (Розанова, Васин, 1999). Необходимость замены клеток донора на клетки реципиента выглядит очевидной с позиций иммунологии, тем не менее, еще 20 лет назад были попытки добиваться максимальной жизнеспособности клеток донора в трансплантатах (Wheatley et al, 1977; Van Der Kamp et al, 1981; O Brien et al., 1987). В этом был определенный смысл. Суть его в том, чтобы до замены клеток донора в имплантированной ткани клетками реципиента первые обеспечивали бы поддержание структуры матрикса трансплантатов. Исследования O Brien и коллег (1987) свидетельствовали о сохранении жизнеспособности фибробластов донора (по данным хромосомного анализа) в створках аллографтов после 9 лет имплантации. В связи с этим были разработаны новые методы изготовления гомографтов, позволяющие максимально сохранить жизнеспособность фибробластов в створках клапана (Angell, 1987). Однако это не предотвращало кальциноз трансплантатов и, соответственно, не повышало их биосовместимость. Исследования других групп показали, что клетки донора не сохраняются после аллотрансплантации (Barratt-Boyes et al., 1987; Wheatley et al., 1977). Согласно нашим данным (Акатов, неопубликованные данные), в аллографтах клапанов сердца человека, эксплантированных в НЦ ССХ РАМН в результате реоперации через 4 и 12 лет после имплантации, на поверхности створок обнаруживаются живые эндотелиальные клетки, а в тканевом матриксе - фибробласты. Живые фибробласты и эндотелиальные клетки обнаруживаются не только в створках, но и в зоне анастомоза створок. Причем до имплантации ткани аллографтов не содержали живых клеток.
В дальнейшем были проведены исследования возможности репопуляции аллографтов клапанов сердца клетками реципиента после имплантации. Было обнаружено, что в ряде случаев в артериальной стенке аллографтов через 1-2 года после имплантации обнаруживаются фибробласты хозяина, а клетки донора отсутствовали (Koolbergen et al, 1998). В других случаях в стенках аорты и в створках обнаруживались одновремненно клетки хозяина и донора. В дальнейших исследованиях в этой же группе было показано, что в 40 клинических случаях эксплантатов число клеточных элементов сильно уменьшилось на 1 году после имплантации до почти полного их исчезнования после 1-2 года (Koolbergen et ah, 2002). При гибридизации in situ во всех графтах определены клетки реципиента, а клетки донора заметно уменьшены или отсутствовали. Число клеток реципиента было очень ограниченным, особенно в створках клапана, и основная часть мигрировавших в трансплантат клеток реципиента были лимфоциты. Уменьшение клеточных компонентов наблюдалось в аллографтах, извлеченных как по техническим причинам, так и из-за дегенерации. Потеря трехслойного строения клапана через 1 год была более выраженной в графтах с дегенерацией, по сравнению с клапанами, репротезированными по техническим причинам.
Митчел и соавторы (Mitchell et al, 1995) обнаружили раннюю потерю клеточных элементов (первые 1-2 года), но относительно хорошее сохранение коллагенового скелета и других составляющих внеклеточного матрикса. При рассмотрении иммуно-обусловленных повреждений трансплантатов отмечался приток макрофагов и Т - лимфоцитов почти во всех аллографтах, хотя донорские клетки исчезали, и структура ткани была повреждена (Koolbergen, 2002). Такая воспалительная инфильтрация была достоверной, хотя и менее выраженной, чем в случаях острого отторжения органа. Раннее появление макрофагов, предшествущее притоку Т - клеток, свидетельствует о предстоящем устранении остатков органических веществ, но участие их в процессе уменьшения числа клеточных компонентов остается неустановленным. Отсутствие нейтрофильных гранулоцитов, поздний прилив Т-лимфоцитов указывают на умеренный характер имунного ответа на трансплантат. Макрофаги, проникая в тканевой матрикс и поглощая остатки погибших клеток донора, презентировали антигены, антитела к которым вызывали в дальнейшем апоптоз клеток донора (Plissonier et al, 2000). Роль антигенности и иммуногенности ткани аллографтов в их дисфункции исследовалась многими авторами (Gonzales-Lavin et al, 1988, 1990; Cochran, Kunzelman, 1989; Lupinetti et al, 1991; Valente et al, 1995; Johnson et al, 1997; Kosuga Т., 2000). В целом литературные данные показывают, что существует иммунный ответ на клетки донора в аллографтах клапанов сердца. Проведенные исследования показали, что при сохранении жизнеспособности клеток донора до имплантации кальцификация трансплантатов остается высокой. Поэтому надежды на то, что клетки донора могут способствовать ремоделированию ткани в процессе их замены на клетки реципиента, выглядят неоправданными.
Было показано также, что существует незначительная способность эндотелиальных клеток донора регенерировать после имплантации клапана без замещения их эндотелиальными клетками хозяина (Koolbergen, 2002). Некоторые авторы считают, что потеря эндотелия аллографтом ведет к притоку белков в ткань и соответствующим изменениям во внеклеточном матриксе, таким, как атеросклеротическим, проявляющимся дисфункцией протеза, воспалительным поражением -макрофагальной и Т-лимфоцитарной инфильтрацией и стенозом с кальцификацией (Lupinetti et al, 1993; Elkins et al, 2001). Изменения состава внеклеточного матрикса, его повреждение могут быть включены в процесс инициации апоптозной смерти клеток (Hilbert et al, 1999; Plissonier et al, 2000). Выживает лишь малое число клеточных элементов аллографта, поэтому их участие в структуре и функции клапана -минимальное (Koolbergen, 2002).
