Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор данных литературы 8
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
Глава 3. Результаты исследования 58
Глава 4. Обсуждение результатов 101
Заключение 115
Выводы 116
Благодарности 118
Библиография 119
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Одной из ключевых стадий повреждения нейронов при ряде патологий центральной нервной системы является токсическое действие нейромедиатора глутамата, избыточно выделяющегося и накапливающегося в межклеточном пространстве (Duchen, 2004;Nicholls, 2004). Исследования причин глутаматной нейротоксичности показали, что вход Са через NMDA подтип глутаматных каналов и последующее накопление Са2+ в митохондриях являются основными факторами, приводящими к клеточной гибели (обзоры (Khodorov, 2004;Nicholls and Budd, 2000)).
В исследованиях, проведенных на первичных культурах нейронов, было обнаружено, что гибель нейронов после глутаматного шока тесно связана с развитием вторичного подъема внутриклеточной концентрации Са ([Са ];). Это вторичное увеличение [Са \{ получило название отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) (Tymianski et al., 1993). В последующих исследованиях было продемонстрировано, что ОКД сопровождается синхронной митохондриальной деполяризацией (МД) (Vergun et al., 1999). Было также показано, что МД играет решающую роль в механизме глутамат-индуцированного нарушения Са2+ гомеостаза (Khodorov et al., 1996;Ходоров и др., 2001) и что циклоспорин А (ЦсА) и некоторые его производные замедляют или предотвращают развитие сильной МД и вторичного повышения [Са ]; в культивируемых нейронах центральной нервной системы (Vergun et al., 1999;Alano et al., 2002). Принимая во внимание способность этих веществ противодействовать формированию митохондриальной поры (МП) в изолированных митохондриях, было сделано заключение о том, что открывание МП приводит к коллапсу митохондриального потенциала (Д*РМ) во время глутаматного воздействия. Однако этот вывод в настоящее время поставлен под сомнение рядом других исследований, в которых не удалось воспроизвести защитный эффект ЦсА (Isaev et al., 1996;Castilho et al., 1998;Chinopoulos et al., 2004;Pivovarova et al., 2004). Эти противоречия и некоторые
5 ограничения, связанные с применением ЦсА даже на изолированных митохондриях
(Brustovetsky and Dubinsky, 2000) побудили нас использовать для изучения этой проблемы
новый экспериментальный подход, основанный на сравнительном анализе изменений
митохондриального и цитозольного рН (рНм и рНц, соответственно). Хорошо известно, что
глутамат вызывает закисление цитозоля (Пинелис и др., 1992; Hartley and Dubinsky, 1993).
Однако влияние глутаматного воздействия на динамику нейронального рНм in situ до сих пор
не изучалось. Между тем, заманчиво было предположить, что открывание
митохондриальной поры вызовет снижение рНм (поскольку рНц меньше рНм), в то время как
блокада открывания МП предотвратит развитие этого митохондриального подкисления.
Чтобы проверить это предположение мы исследовали изменения рНц и рНм во время
длительного глутаматного воздействия, используя рН-чувствительные флуоресцентные
белки, селективно экспрессированные в цитозоле и митохондриях (cytYFP, mtYFP, и
экспрессируемый в митохондриях перикам 2mtRP (Porcelli et al., 2005;Nagai et al., 2001). Эти
измерения мы проводили в сочетании с одновременным мониторингом изменений [Ca2+]j. В
параллельных экспериментах мы регистрировали изменения [Ca2+]j и AW». Измерения
проводились как в контрольных условиях, так и после воздействий, которые препятствуют
открыванию МП в изолированных митохондриях. К числу таких воздействий, как известно,
относятся замена внеклеточного Са2+ на Sr24 замена или применение ЦсА (Bernardi et al.,
1992).
В результате всех проведенных исследований мы пришли к заключению о существовании двух альтернативных механизмов глутамат-индуцированной отсроченной МД: открывание поры и беспоровый механизм, при котором происходит подщелачивание митохондриального матрикса.
Научная новизна
В нашей работе впервые использован новый прием для изучения роли митохондриальной поры в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов
при длительном действии глутамата - измерения рН митохондриального матрикса (рНм). Измерения рН„ in situ в сочетании с другими подходами были использованы для демонстрации роли митохондриальной поры в развитии МД.
Нами впервые проведено сопоставление динамики [Са ]j и рН в цитозоле (рНц) и митохондриях при длительном глутаматном воздействии. Впервые показано, что снижение рН„ во время глутаматного воздействия имеет двухфазный характер, причем вторая фаза падения рНм возникает с некоторой задержкой после начала ОКД. Мы также впервые обнаружили, что антагонисты митохондриальной поры (циклоспорин А и ионы Sr2"*") не предотвращают развитие ОКД и сильной МД, но существенно изменяют динамику рНм во время развития ОКД. Результаты этих экспериментов свидетельствуют в пользу того, что митохондриальная пора участвует в развитии ОКД и МД при глутаматном воздействии.
Впервые проведено сопоставление изменений морфологии митохондрий и динамики [Са ]і и рНм во время глутаматного воздействия. Мы показали, что начало вторичного митохондриального подкисления сопровождается изменениями митохондриальной формы, которые, согласно имеющейся литературе, можно рассматривать как митохондриальное набухание. Впервые показано, что в Si* -содержащей среде глутаматное воздействие не вызывает никаких изменений митохондриальной морфологии. На основании того, что митохондриальное набухание является характерной чертой формирования митохондриальной поры и того, что во время глутаматного воздействия оно возникает лишь в Са -содержащей среде было сделано заключение о том, что вторичное митохондриальное подкисление и сопровождающее его митохондриальное набухание являются следствием открывания митохондриальной поры.
Впервые показано, что сильная МД, развивающаяся во время глутаматного воздействия в присутствии цианида, обусловлена снижением активности митохондриальной АТФ-синтазы вследствие глутамат-индуцированного уменьшения внутриклеточного уровня АТФ.
7 Положения, выносимые на защиту
Вторичное митохондриальное подкисление, сопровождающее отсроченную кальциевую дизрегуляцию (ОКД) во время глутаматного воздействия, является следствием открывания митохондриальной поры.
В присутствии ингибиторов классической митохондриальной поры (ионов Sr2* или циклоспорина А) развитие сильной митохондриальной деполяризации (МД), сопровождающей ОКД, происходит по «беспоровому» механизму.
Существует два альтернативных механизма МД, сопровождающей ОКД: (1) открывание митохондриальной поры, ведущее к коллапсу митохондриального потенциала и закисленню матрикса, и (2) беспоровая МД, сочетающаяся с митохондриальным защелачиванием. В отсутствии блокаторов митохондриальной поры глутамат-индуцированная МД в большинстве нейронов возникает только при активации митохондриальной поры.
В основе развития сильной МД, наблюдающейся во время глутаматного воздействия в присутствии цианидов, лежит быстрое истощение АТФ, необходимого для поддержания митохондриального потенциала в условиях, когда этот потенциал генерируется реверсированной митохондриальной АТФ-синтазой.
Обзор данных литературы
Глутамат (или глутаминовая кислота) является одним из основных возбуждающих нейромедиаторов в различных структурах головного мозга человека и животных. Наибольший пул глутамата находится в нервных окончаниях: около 100 мМ в синаптических везикулах и 10 мМ в цитозоле (Nicholls and Attwell, 1990). Во внеклеточном пространстве концентрация глутамата колеблется от 1 до 10 мкМ. Глутамат не проникает через гематоэнцефалический барьер и синтезируется в митохондриях нейронов из глюкозы (через а-кетоглутарат) или глутамина (Agranoff et al., 1999). Глутаматные рецепторы делятся на два больших класса: ионотропные и метаботропные. Ионотропные глутаматные рецепторы функционируют как ионные каналы и, в свою очередь, в зависимости от фармакологических и электрофизиологических свойств подразделяются на три подтипа: 1) АМРА рецепторы (синтетический агонист ОЬ-а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксалолпропионовая кислота); 2) каинатные рецепторы (каиновая кислота), которые проводят преимущественно одновалентные катионы (Na+ и К+); 3) NMDA рецепторы (синтетический агонист N-Meran-D-acnapTar), обладающие высокой проводимостью для Са . Первые два подтипа часто объединяют в один, называемые не-НМДА рецепторами. Эндогенный глутамат активирует и NMDA, и не-NMDA рецепторы. NMDA обладают высокой проводимостью для ионов Са , но пропускают не только Са , но и одновалентные катионы, такие как К+ и Na+. Высокая проницаемость NMDA каналов для двухвалентных ионов имеет большое значение для клеточного функционирования. В покое концентрация Са в цитозоле составляет около 100 нМ.
Повышение внутриклеточной концентрации Са2+ ([Ca2+]j) при открывании NMDA каналов может привести к активации множества Са -активируемых ерментов, таких как Са2+/кальмодулин-зависимая протеинкиназа II, кальцинейрин, протеинкиназа С, фосфолипаза А2, синтаза оксида азота и ряд эндонуклеаз (Agranoff et al., 1999). Сам по себе глутамат не может проникать через мембраны, поэтому регуляция концентрации глутамата во внеклеточном пространстве осуществляется рядом механизмов. Известны, по крайней мере, два семейства глутаматных транспортеров, локализованных в плазматической мембране нейронов и астроцитов. Одним из них является Ыа+-зависимый глутаматный транспортер, способный транспортировать не только глутамат, но и аспартат (Agranoff etal., 1999). На сегодняшний день известны три члена этого семейства: глутамат-аспартатный транспортер (GLAST), глутаматный транспортер-1 (GLT-1) и переносчик возбуждающих аминокислот -1 (ЕААС-1). GLT-1 и GLAST экспрессируются в основном в глиальных клетках ЦНС. Напротив, ЕААС-1 экспрессируется главным образом в нейронах, причем наиболее существенно в гиппокампе. Паттерн экспрессии этих трех транспортеров говорит о том, что первые два осуществляют захват глутамата глиальными клетками, в то время как ЕААС-1 опосредует нейрональный захват глутамата и аспартата. За один цикл эти транспортеры осуществляют перенос двух ионов Na+ вместе с глутаматом, при этом во внеклеточное пространство выбрасывается ион К+ в сопровождении ОН либо НСОз (Agranoff et al., 1999). Основной функцией глутаматных транспортеров является поддержание низкой концентрации возбуждающих аминокислот во внеклеточном пространстве. Однако деполяризация мембраны при ишемическом инсульте обращает транспорт глутамата или аспартата (Nicholls and Attwell, 1990). Последующее накопление этих медиаторов в межклеточном пространстве приводит к избыточной активации глутаматных рецепторов, что может вести к развитию ряда патологических состояний и, в конечном итоге, клеточной смерти. В настоящее время не вызывает сомнения факт, что клеточные механизмы, которые при нормальных условиях участвуют в передаче сигналов в ЦНС, при патологических условиях превращаются в механизмы, разрушающие клетки. В частности, глутамат играет важную роль в гибели нейронов при острых поражениях головного мозга, таких как инсульт, ишемия/ гипоксия, а также различных нейродегенеративных процесссах (Choi, 1988;Agranoff et al., 1999). Как говорилось выше, межклеточная концентрация глутамата в мозге составляет от 1 до 10 мкМ и поддерживается примерно постоянной. Увеличение этой концентрации выше нормы включает компенсаторные механизмы. Однако при патологических процессах, например при ишемии, недостаток кислорода и энергетических субстратов нарушает работу АТФ-зависимых ионных насосов, тем самым лишая клетку способности поддерживать потенциал покоя плазматической мембраны. В результате деполяризации плазматической мембраны происходит реверсия глутаматных транспортеров, и глутамат выходит из глии и/или нейронов во внеклеточное пространство. Таким образом, массивное выделение глутамата во время ишемии в основном обусловлено реверсией нейрональных глутаматных транспортеров: вместо удаления внеклеточного глутамата и защиты нейронов, транспортеры выделяют глутамат, тем самым запускают механизмы, инициирующие смерть нейронов (Rossi et al., 2000).
Материалы и методы исследования
У 6-8 дневных крысят линии Wistar извлекали мозжечки в соответствии с этическими требованиями по работе с животными, промывали в бескальциевом и безмагниевом растворе Хенкса ("Gibco", США), измельчали и помещали на 15 мин в 0.05% раствор трипсина с 0.02% ЭДТА (36С). После инкубации трипсин двукратно отмывали стандартным раствором Хенкса ("Gibco", США) с феноловым красным, а затем культуральной средой MEM (Minimal Essential Medium, "Gibco", США) на растворе Игла, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Затем клетки диспергировали в свежей среде MEM до получения однородной суспензии, которую затем центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Осаждённые клетки ресуспендировали в соответствующем объёме свежей MEM (примерная концентрация 106 клеток/мл) и переносили (100-150 мкл) на находящиеся в чашках Петри ("Costar") покровные стерильные стекла, покрытые поли-О-лизином (10 мкг/мл). Через 2 часа после нанесения клеток на стекла в чашки
Петри добавляли по 1 мл Neurobasal Medium ("Gibco", США), содержащей В-27 ("Gibco", США), глутамакс ("Gibco", США) и 25 мМ КС1. Клетки содержались в течение 7-Ю дней в инкубаторе (95% воздуха + 5% СОг, относительная влажность 98%) в среде Neurobasal Medium с добавлением В-27 ("Gibco", США), глутамакс ("Gibco", США) и 25 мМ КС1. Получали смешанную нейроглиальную культуру с подавляющим большинством зернистых клеток. Нейроны были легко отличимы от клеток глии: они были контрастно очерчены, с большим ядром, имели гладкую округлую форму и лежали в фокальной плоскости над глией. У 1-2 дневных крысят линии Wistar извлекали кору головного мозга в соответствии с этическими требованиями по работе с животными, промывали в растворе Кребса, одержавшем (мМ): 130 NaCl, 5.4 КС1, 20 HEPES, 0.4 КН2Р04, 15 Glucose, 0.5 MgS04 и 3mg/ml бычий сывороточный альбумин (BSA, Sigma), pH 7.4. Затем кору измельчали и помещали на 15 мин (36С) в раствор Кребса, содержащий трипсин 1-300 (0.8 мг/мл, ICN). После инкубации трипсин двукратно отмывали стандартным раствором Кребса, содержащим 0.08 мг/мл ингибитора трипсина ("Sigma", США) и 0.01 мг/мл ДНКазы ("Roche"). Клетки диспергировали в среде Кребса с ингибитором трипсина (0.5 мг/мл) и ДНКазой (0.08 мг/мл) до получения однородной суспензии, которую затем центрифугировали 1 мин при 3000 об/мин. Осаждённые клетки ресуспендировали в соответствующем объёме Neurobasal Medium с добавлением В-27, GlutaMax (Gibco) и penicilline/streptomycine (Gibco) и переносили (100-150 мкл) на находящиеся в чашках Петри ("Costar") покровные стерильные стекла, покрытые поли-D-лизином (10 мкг/мл). Через 2 часа после нанесения клеток на стекла в чашки Петри добавляли по 1 мл Neurobasal Medium с добавлением В-27, и глутамакс. Клетки содержались в течение 7-Ю дней в инкубаторе (95% воздуха + 5% СОг, относительная влажность 98%) в указанной среде.
Гиппокампы выделяли из мозга 1-2-дневных крысят линии Спрэг-Доули (Sprague-Dawley) и промывали в растворе L-15 с добавлением 0.2 мг/мл BSA. Затем гиппокампы измельчали и помещали на 30 мин (36С) в L-15 с добавлением 0.2 мг/мл BSA и 3 мг/мл папаина ("Sigma"). Затем клетки диспергировали в культуральной среде, содержащей Minimum Essential Medium, 10% (BD Biosciences, San Diego, CA) и 27 мМ глюкозы, и переносили в раствор, содержащий L-15 с добавлением 40 мг/мл BSA. Суспензию центрифугировали 5 мин при 1800 об/мин. Осажденные клетки ресуспендировали в соответсвующем объеме культуральной среды LoGlu и переносили в стерильные чашки Петри со стеклянным дном, покрытые коллагеном (5 мг/мл) и поли-Ь-лизином (0.1 мг/мл). Клетки содержались в течение 7-Ю дней в инкубаторе (95% воздуха + 5% СОг, относительная влажность 98%) в указанной среде. Культуры кортикальных нейронов трансфецировались плазмидами, кодирующими cytYFP, mtYFP, или mtRP, на 5-7 день культивирования с помощью реагента Lipofectamine 2000 ("Invitrogen", США) согласно протоколу производителя. Суспензия гиппокампальных нейронов трансфецировались плазмидой mtYFP с помощью электропорации (электропоратор ВТХ 630 ЕСМ, "Harvard Apparatus") согласно протоколу производителя электропоратора. Затем суспензия переносилась в чашки Петри, и культура выращивалась как описано выше. Измерения [Ca2+]i проводили с помощью флуоресцентного Са2+ индикатора fura-2FF (или fura-2), позволяющего адекватно регистрировать изменения в микромолярной области [Ca2+]i. Индикатор вводили культуральную среду к клеткам в форме ацетоксиметилового эфира (TefLabs, Austin, ТХ). После 50 мин инкубации при комнатной температуре клетки краситель отмывали. Для оценки изменений трансмембранного потенциала митохондрий (ДЧ щ) использовали потенциал-чувствительный флуоресцентный зонд родамин 123 (rhl23, 3-4 мкг/мл, 15-17 мин), которым клетки окрашивали после того, как они уже были нагружены Са2+ индикатором.
Результаты исследования
В кортикальных (рис. 3.1 А, Б) и гиппокампальных нейронах (рис. 3.1 В, Г) длительное (15-20 мин) воздействие глутамата (100 мкМ + 10 мкМ глицина) приводит к развитию двухфазного подъема [Ca2+]j и митохондриальной деполяризации. Динамику [Ca2+]i и ДЧ м во время глутаматного воздействия можно условно подразделить на две фазы. Первая фаза охватывает период от начала глутаматного воздействия до начала вторичного подъема [Са ]І И включает в себя начальный пик [Са ]j и латентный период, предшествующий вторичному подъему [Са ]{. Длительность латентного периода может меняться среди клеток от секунд до минут. В эту фазу [Ca2+]j ответа митохондрии обычно претерпевают лишь сравнительно слабую деполяризацию. Вторая фаза нейронального ответа, так называемая отсроченная кальциевая дизрегуляция (ОКД), включает в себя быстрый подъем [Са ]j до высокого уровня квазиплато. Развитие ОКД сопровождается сильной практически синхронной митохондриальной деполяризацией (МД) и в кортикальных (рис. 3.2 А, Б) и в гипппокампальных нейронах (рис. 3.2 В, Г). В одной части нейронов (44 ± 12%, 6 экспериментов) высокое [Са ]j плато в постглутаматный период было устойчиво к удалению внешнего Са (рис. 3.2), что говорило о нарушении работы механизмов плазматической мембраны, ответственных за выведение Са2+ из нейронов (Khodorov et al., 1993;Khodorov et al., 1996c;Bano et al., 2005). В другой же части нейронов восстановление [Са ]j в первые минуты постглутаматного периода все же наблюдалось.
Процесс восстановления [Са2+]( (сплошная стрелка на рис. 3.3А) практически во всех клетках начинался раньше восстановления A PM (пунктирная стрелка на рис. З.ЗА). Синхронное восстановление [Са ]j и Д РМ наблюдалось только в некоторых нейронах, где ОКД начиналась за несколько минут до окончания глутаматного воздействия (рис. З.ЗБ). В отдельной серии экспериментов на кортикальных нейронах мы исследовали устойчивость высокого [Са ]; плато и сильной МД, возникающих при глутаматном воздействии, к удалению Са из внешней среды. Оказалось, что уборка Са из глутамат содержащего раствора при продолжающемся действии глутамата в момент, когда [Са ]І достигал высокого уровня плато приводит к достаточно быстрому восстановлению [Са ]j и A4V Необходимо отметить, что в данных условиях восстановление [Са ]І могло быть как синхронным с восстановлением Д РМ (рис. 3.4А) так и опережать его (рис. 3.4Б). Последующее возвращение нейронов в Са -содержащую среду приводило к подъему [Са ]І до высокого уровня плато и синхронному коллапсу A FW В работе Bano et al (2005) было выдвинуто предположение, что восстановление [Ca2+]i после длительного глутаматного воздействия опосредовано работой Na+/Ca2+ обменника плазматической мембраны.
Однако, в наших опытах на кортикальных и і Лі гиппокампальных нейронах выключение прямой моды функционирования Na /Са обменника в постглутаматный период с помощью замены Na+ на Li+ (Blaustein and Lederer, 1999;DiPolo and Beauge, 2006) не предотвратило восстановления [Ca2+]i. (рис. 3.5). Этот результат находится в противоречии с гипотезой о ведущей роли Na /Са обменника плазматической мембраны в восстановлении [Са ]j. Присутствие же ионов La (1мМ) во время отмывки глутамата значительно ослабило восстановление [СаПі (рис. 3.6). Ионы La3+ являются эффективным ингибитором Са2+/Н+-АТФазы (Herscher and Rega, 1997) и Na+/Ca2+ обменника плазматической мембраны (Blaustein and Lederer, 1999). На основании того, что ингибирование №+/Са2+-обменника не влияет на восстановление [Ca2+]j после глутаматного воздействия, а ингибирование и №+/Са2+-обменника и Са /ЬҐ-АТФазьі предотвращает восстановление [Са2+]ь мы пришли к выводу о том, что восстановление [Са2+]і в постглутаматный период опосредовано именно Са2+/Н+-АТФазой (Khodorov et al., 1995). Известно, что Са2+-индуцированная МД в изолированных митохондриях может быть вызвана повышением проводимости митохондриальной мембраны либо являться следствием повышения градиента рН на внутренней митохондриальной мембране (Nicholls and Fergusson, 2002;Nicholls and Budd, 2000). МД, в зависимости от механизма, может сопровождаться различными изменениями рН митохондриального матрикса (рНм): при повышении проводимости - подкислением матрикса, при увеличении градиента рН -подщелачиванием митохондрий. Поэтому для выяснения механизма МД необходимо изучить динамику рНм во время глутаматного воздействия и сравнить ее с динамикой A4V Для исследования рН в различных компартментах нейронов мы использовали селективную экспрессию рН-чувствительного флуоресцентного белка YFP (желтый флуоресцентный белок). Однако, одновременные измерения рНм и ДЧ м было невозможно выполнить вследствие перекрытия спектров возбуждения и эмиссии YFP и Rhl23. Тем не 7+ менее, поразительное сходство изменений [Са ]j и Д РМ во время глутаматного воздействия можно использовать для того, чтобы рассматривать изменения [Ca2+]i как очень близкий аналог изменений Д РМ. Поэтому вместо взаимосвязи A4VpHM мы исследовали взаимосвязь [Са ],-рНм.
Обсуждение результатов
Эта работа посвящена исследованию механизмов глутамат-индуцированной митохондриальной деполяризации (МД), возникающей во время отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) в культивируемых нейронах (Khodorov, 2004;Nicholls and Budd, 2000). Целью наших исследований было прояснить роль митохондриальной поры (МП) в механизме сильной митохондриальной деполяризации (МД), возникающей во время ОКД. Для этого мы провели сравнительный анализ изменений цитозольного и митохондриального рН с изменениями [Са ]j и ATM во время и после глутаматного воздействия. Мы обнаружили, что: 1) первичный [Ca2+]i подъем и слабая МД во время глутаматного воздействия сопровождаются первичным митохондриальным подкислением, которому предшествует кратковременное повышение рНм. Мы предположили, что первичное подщелачивание митохондриального матрикса является следствием входа Са2+ в митохондриальный матрикс, поскольку на изолированных митохондриях вход Са2+ также вызывает повышение рНм (Addanki et al., 1968;Bernardi, 1992;Petronilli et al., 1993).
Последующее снижение pHM могло быть обусловлено работой двух механизмов. Во-первых, это вход неорганического фосфата (Pj) в митохондрии, который может компенсировать изменения рНм, возникающие при митохондриальном захвате Са2+ (Petronilli et al., 1993;Bernardi, 1992). Во-вторых, хорошо известно, что рН митохондриального матрикса может отслеживать изменения рН внемитохондриальной среды (Addanki et al., 1968;Kristian et al., 2001), поэтому снижение митохондриального рН могло быть лишь отражением падения цитозольного рН во время глутаматного воздействия. По всей видимости, второй механизм играет ведущую роль, поскольку в экспериментах на выделенных митохондриях было показано, что компенсаторный вход Pj приводит лишь к восстановлению рНм до базального уровня, но не к понижению рНм (Beraardi, 1992). На изолированных митохондриях кардиомиоцитов было показано, что рНм отслеживает рН внемитохондриальной среды за счет митохондриального К+/Н+ обмена (Gursahani and Schaefer, 2004). Можно предположить, что в нейронах взаимосвязь между рНц и рНм также опосредована К+/Н+-обменником митохондрий. 2) Вторичное повышение [Ca2+]i (ОКД) и, следовательно, синхронная МД во всех нейронах сопровождалась усилением митохондриального подкисления (вторичным снижением рНм). Необходимо отметить, что в 30% кортикальных нейронов этому митохондриальному подкислению предшествовало кратковременное митохондриальное подщелачивание.
Поскольку в интактных митохондриях рНм больше рНц (эта работа и (Porcelli et al., 2005)), то открывание в митохондриальной мембране канала, проницаемого для протонов, должно приводить к понижению рНм. Мы же наблюдали в ряде нейронов повышение рНм, т.е. не выравнивание, но даже увеличение градиента рН на митохондриальной мембране. Необходимо отметить, что это повышение рНм не являлось следствием повышения цитозольного рН, поскольку в этот временной период не наблюдалось никаких изменений рНц либо продолжалось усиление цитозольного ацидоза. Следовательно, на основании того, что ОКД и синхронная МД развивались во время митохондриального подщелачивания можно сделать заключение о том, что МД и ОКД не сопровождаются повышением проводимости митохондриальной мембраны, в частности, открыванием митохондриальной поры. 3) Динамика рНм, [Ca2+]j и АЧ1 , в период после развития ОКД тесно взаимосвязаны. Это заключение сделано на основе двух наших находок. Во-первых, высокое [Ca2+]i плато, а, следовательно, и сильная МД в постглутаматный период всегда сопровождаются низким рНм плато. Во-вторых, восстановление [Са ]j (и A4 M) при удалении глутамата после развития ОКД всегда сопровождается восстановлением рНм. Теоретически, открывание МП во время развития ОКД должно значительно усиливать поток протонов из цитозоля в митохондриальный матрикс. Это должно приводить к сильному снижению рНм и, возможно, повышению рНц. Ингибирование же МП (Ca /Sr2 заменой или с помощью ЦсА) должно предотвратить или отсрочить это перераспределение протонов между митохондриями и цитозолем. Мы обнаружили, что развитие в контроле ОКД сопровождается снижением рНм и повышением рНц, причем эти изменения рН возникали только после начала ОКД. Оба антагониста МП (ЦсА и ионы стронция) значительно отсрочили появление подъема рНц. Эта находка согласуется с теоретическими предсказаниями о перераспределении протонов при открывании МП и говорит в пользу того, что ослабление цитозольного ацидоза связано с переходом протонов из цитозоля в митохондриальный матрикс. Влияние же митохондриальных антагонистов на динамику рН„ при глутаматном воздействии оказалось не столь однозначным. Прежде всего рассмотрим эффект замены Са2+ на Sr2"1". Мы обнаружили, что при воздействии глутамата в Si -содержащей среде вторичный подъем [Sr]j сопровождается митохондриальным подщелачиванием, в отличие от митохондриального подкисления, наблюдавшегося во время ОКД в Са2+-содержащейся среде. Однако это подщелачивание через некоторое время сменялось митохондриальным подкислением. Тот факт, что при замене Са2+ на ST2" " вторичное митохондриальное подкисление заменялось митохондриальным подщелачиванием говорит о том, что это подкисление (индуцированное Са ) являлось следствием некоего процесса, который может быть инициирован Са2+, но ингибируется ионами Sr2+. Как известно, одним из процессов, который активируется Са2+ и ингибируется Sr2 , является МП (Bernardi et al., 1992). Следовательно, обнаруженный нами эффект замены Са2+ на Si свидетельствует в пользу того, что вторичное митохондриальное подкисление во время
