Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Объект и методы исследования 29
ГЛАВА 2. Исследование силогенерирующего процесса в мышечных волокнах кролика с помощью быстрых изменений длины и температуры 48
ГЛАВА 3. Сравнение переходных процессов напряжения, вызванных изменениями длины и температуры 65
ГЛАВА 4. Исследование реакции напряжения на быстрые изменения длины и температуры в мышечных волокнах кролика, обработанных ЭДК 85
ГЛАВА 5. Генерация силы и производство работы ковалентно пришитыми поперечными мостиками в мышечных волокнах кролика 107
ГЛАВА 6. Рентгенодифракционные исследования структурных изменений, сопровождающих силогенерирующий процесс в мышце 118
ГЛАВА 7. Кинетика структурных изменений при развитии напряжения в мышечных волокнах кролика в ответ на скачок температуры 128
ГЛАВА 8. Интерпретация результатов: структурно-кинетическая модель двухшагового механизма работы поперечного мостика 141
Выводы 156
Список литературы 158
- Исследование силогенерирующего процесса в мышечных волокнах кролика с помощью быстрых изменений длины и температуры
- Исследование реакции напряжения на быстрые изменения длины и температуры в мышечных волокнах кролика, обработанных ЭДК
- Рентгенодифракционные исследования структурных изменений, сопровождающих силогенерирующий процесс в мышце
- Интерпретация результатов: структурно-кинетическая модель двухшагового механизма работы поперечного мостика
Введение к работе
Скелетная мышца в силу своей почти идеально правильной организации на всех структурных уровнях - от волокна до саркомера - является излюбленным объектом исследователей как собственно механизма мышечного сокращения, так и взаимодействия актина и миозина, которое лежит в основе многих видов немышечной подвижности. На рис. В.1 показана иерархическая схема организации сократительного аппарата скелетной мышцы. Мышца состоит из мышечных клеток, или волокон, лежащих параллельно друг другу, каждое волокно заканчивается на обоих концах сухожилиями. Диаметр волокон у разных видов животных находится в диапазоне 50 -200 мкм, число волокон в мышце составляет от нескольких сот до нескольких тысяч. Каждое волокно в свою очередь состоит из «нескольких тысяч миофибрилл диаметром ~1 мкм. Вдоль длины миофибриллы разделены на регулярные сегменты - саркомеры, ограниченные Z-линиями, длина покоя которых составляет в мышцах лягушки 2,2 мкм, а в мышцах теплокровных - 2,4 мкм. От Z-линий внутрь саркомера идут тонкие нити, или тонкие филаменты, представляющие собой спираль белка актина. В пространстве между тонкими нитями лежат толстые нити, или толстые филаменты, состоящие из моторного белка миозина. В участке перекрытия эти нити упакованы в гексагональную решетку, тогда как вне перекрытия актиновые нити имеют квадратную упаковку. Перекрывающиеся и неперекрывающиеся участки называются А- и I-зонами (анизотропная и изотропная), соответственно, по ориентации двулучепреломления в них (Briicke, 1858; Kiihne, 1864). Миофибриллы в волокне и волокна в мышце лежат в
регистре, так что их Z-линии, а также А- и I-зоны совпадают и представляют собой чередующиеся тёмные и светлые полосы, идущие поперёк мышцы, что и определило название мышц - поперечно-полосатые, в отличие от гладких, не имеющих такой упорядоченной организации клеток. Поперечную исчерченность мышц можно видеть в световой микроскоп, предпочтительно интерференционный или фазово-контрастный. В силу регулярности саркомеров, их длину можно также измерять дифракционными методами, наиболее часто для этого используются гелий-неоновые или полупроводниковые лазеры.
Строение скелетной мышцы. В основе сокращения всех типов мышц и подвижности немышечных клеток лежит взаимодействие двух белков - актина и миозина. Актин - весьма консервативный белок с молекулярной массой 42 кД. В присутствии АТФ глобулярный актин (G-актин) полимеризуется с образованием нитей F-актина длина которых может достигать 20 мкм. Актиновая нить представляют собой левую спираль (~6 оборотов на 13 субъединиц ) с осевым шагом между мономерами 2,75 нм (Holmes и др., 1990). Моторный белок миозин обладает большим разнообразием. В настоящее время описано более 15 видов миозинов и определены аминокислотные последовательности более чем 100 представителей этого супер-семейства белков (Соре и др., 1996). Все миозины содержат одну или две тяжелых полипептидных цепи и несколько легких цепей. На N-конце каждой тяжелой цепи находится глобулярная головка миозина или субфрагмент-1 (S1), которая способна связываться с актином и гидролизовать АТФ. В результате гидролиза АТФ выделяется свободная химическая энергия, которая в ходе актин-миозинового взаимодействия
превращается в механическую работу (Энгельгардт и Любимова, 1939). Миозиновая головка переходит в 'шейку' - длинный сс-спиральный участок тяжелой цепи, с которым ассоциированы легкие цепи. Их количество в миозинах разного типа варьирует в широких пределах. Мышечный миозин или миозин II содержит две тяжелые и четыре легких цепи. С-терминали каждой из тяжелых цепей соединены в супер-сс-спиральный субфрагмент-2 (S2), переходящий в длинный стволовой и также супер-а-спиральный участок молекулы, называемый легким меромиозином (ЛММ). При физиологической ионной силе окружающего раствора (250 мМ) стволовые участки молекул миозина агрегируют и образуют миозиновые нити. В скелетных мышцах эти нити обладают спиральной симметрией и представляют собой трехзаходную правую спираль с периодом около 43 нм и осевым расстоянием между ярусами выступающих миозиновых головок ~14,3 нм. На один период миозиновой спирали приходится 9 молекул миозина или 18 миозиновых головок. Длинные суперспирализованные части молекул миозина (ЛММ) образуют ствол толстой миозиновой нити диаметром около 15 нм. Схема строения скелетной мышцы, ее клетки или волокна и основной структурной единицы - саркомера показана на рис. В.1.
Z-диск
Миофиламенты внутри саркомера
Тонкие филаменты (актиновые нити)
филаменты нити)
Рис.В.1. Структура скелетной мышцы.
Исследование молекулярного механизма, лежащего в основе генерации мышечного сокращения - одна из важнейших и интереснейших проблем биофизики и физиологии мышц. Начало современной истории этих исследований восходит к концу XIX века, но реальный прогресс в понимании механизма сокращения мышцы начался в 30-50-х годах XX века и связан с именами таких выдающихся учёных как A.V. Hill, A. Huxley и Н. Huxley (Gasser, Hill, 1924; Hill, 1938; A. Huxley, 1957; H. Huxley, 1952, 1953, 1957; A. Huxley,
Simmons, 1971). Сначала на целых мышцах, а затем на одиночных интактных волокнах скелетных мышц был обнаружен целый спектр механических и энергетических феноменов сокращающейся мышцы. Всё детальней исследуется структура мышечной клетки и организация её сократительного аппарата, для чего привлекаются методы фазовой и интерференционной оптической микроскопии, электронной микроскопии и рентгеновской дифракции. Анализ накопленых к тому времени данные позволил сформулировать в середине 50-х годов так называемую "мостиковую" теорию мышечного сокращения. В основе этой теории лежит циклическое взаимодействие "поперечных мостиков" -головок молекул миозина, выступающих из ствола толстой нити и взаимодействующих во время сокращения с тонкими, актиновыми, нитями. В 1971 году, была предложена механическая модель поворачивающегося, или катящегося, мостика, позволявшая описать большинство известных к тому времени экспериментальных феноменов мышечного сокращения (A. Huxley и Simmons, 1971). Использовавшийся авторами метод состоял в том, что к сокращающемуся одиночному мышечному волокну прикладывали быстрые (~0,2 мс) продольные деформации и регистрировали ответ силы в волокне на такое воздействие. Смысл такого подхода состоит в том, чтобы, нарушив равновесные условия, в данном случае микроскопических механических событий в отдельных мостиках, синхронизовать эти события в макроскопически измеримый ответ силы целого волокна и интерпретировать этот ответ в терминах «среднего» мостика. Из предположений, что мостик, соединённый с толстой нитью упругим элементом (по умолчанию предполагалось,
субфрагментом 2), катится по поверхности тонкой нити через ряд дискретных состояний не меняя при этом формы и что жёсткость как толстых, так и тонких нитей много выше жёсткости мостиков, авторы получили модель, которая вполне удовлетворительно описывала результаты механических экспериментов.
Реакция напряжения сокращающегося мышечного волокна в ответ на ступенчатое укорочение на величину <0,5% состоит из следующих компонентов (рис. В.2): упругое падение напряжения (фаза 1), быстрое частичное его восстановление (фаза 2), временное «плато» (фаза 3) и, наконец, относительно медленное восстановление напряжения к исходному уровню (фаза 4). В модели Huxley и Simmons'a субфрагмент-1 (S1) миозина, присоединившись к тонкой нити, может находиться в нескольких дискретных состояниях. Поворот S1 и его переход из одного состояния в другое ведёт к растяжению упругого элемента (в модели — субфрагмент 2, или S2), соединяющего S1 со стволом толстой нити. Энергия перехода сохраняется в виде растяжения упругого элемента. Кинетика этого перехода соответствует кинетике быстрого частичного восстановления напряжения в ответ на ступенчатое укорочение.
Позднее в механических экспериментах с одновременной регистрацией рентгеновской дифракции в целой мьшще (Н. Huxley и др., 1983) и в одиночных мышечных волокнах (Irving и др., 1992) были получены данные в пользу осевого движения мостиков во время фазы 2 механического ответа, подтверждающие модель Huxley и Simmons'a. Доказательством этого служило преходящее падение интенсивности меридионального рефлекса МЗ,
соответствующего периоду 14,3 нм, то есть осевому периоду мостиков, синхронное с фазой быстрого частичного восстановления напряжения после ступенчатого изменения длины. Модель, объясняющая этот результат (Irving и др., 1992; Piazzesi и др., 1995), состоит в следующем: мостик, длина которого больше его ширины, после укорочения волокна оказывается в менее перпендикулярном по отношению к оси волокна положении и, соответственно, его вклад в дифракцию уменьшается. Во время силогенерирующего шага мостик опять принимает перпендикулярное положение и интенсивность рефлекса восстанавливается. Проблема такой интерпретации заключается, однако, в том, она основана на изменении интенсивности одного единственного рефлекса, и такое её поведение может объясняться также изменением формы мостика во время силогенерирующего шага (Dobbie и др., 1998; Irving и др., 2000).
Другой аргумент в пользу изменения положения S1 во время переходного процесса силы после деформации волокна был получен в экспериментах с использованием флуоресцентно-меченых лёгких цепей S1 миозина (Irving и др., 1995). Положение ковалентно присоединённых к лёгким цепям бифункциональных меток, зарегистрированное в поляризованном свете, также показывает изменение их углового положения, синхронное с быстрым восстановлением напряжения. Угол, однако, меняется всего примерно на 3, что при длине S1 ~18 нм никак не соответствует требуемой по данным механических измерений величине шага мостика в 12-15 нм. Авторы объясняют
Length
XX) и»
Тег» ion
Length
>
Tendon
5тмс
—— Phase 1
Ptwne 2
—— —— Phase 3
— — —Яии 4
Рис. B.2. Ответ напряжения одиночного интактного волокна скелетной мышцы лягушки во время тетанического сокращения на ступенчатое укорочение (из A. Huxley и Simmons, 1970). На А и В показаны изменения длины и напряжения при двух временных масштабах. Т0, Ті и Тг на А обозначают уровни напряжения: начальный, в конце фазы 1 и в фазе 2, соответственно. Линии разного типа на В соответствуют фазам 1-4.
такое несоответствие малым, порядка 5%, числом мостиков, участвующих в силогенерирующем шаге. Такое объяснение, в свою очередь, противоречит данным механических и рентгеновских измерений. Следует отметить однако, что та же группа исследователей нашла изменение угла поляризации вплоть до 45 вдоль оси тонких филаментов с такими же флуоресцентными метками на лёгких цепях
SI в экспериментах на in vitro подвижной системе с миозином V (Forkey и др., 2003). Это, скорей всего, указывает на то, что в мышечном волокне, в отличие от in vitro подвижной системы, существуют какие-то не обнаруженные ещё условия, препятствующие корректному измерению движения флуоресцентных меток. Однако даже этот результат не отвечает на вопрос, каким образом происходит силогенерирующий шаг мостика, так как разрешение метода не позволяет отличить движение S1 как целого от изменения относительного положения хвостового и моторного доменов (см. ниже).
В начале 90х годов были получены кристаллы глобулярного актина (Kabsch и др., 1990) и субфрагмента-1 миозина в "ригорной" конфигурации (Rayment и др., 1993 а) и сняты их рентгенограммы высокого пространственного разрешения (2,8 А). На основе этих рентгенограмм были сделаны реконструкции глобулярного (Kabsch и др., 1990) и филаментарного актина (Holmes и др., 1990; Mendelson и Morris, 1994), субфрагмента-1 (Rayment и др., 1993а) и акто-миозинового комплекса (Rayment и др., 1993b; Mendelson и Morris 1997). Впоследствии были получены кристаллы гладкомышечного миозина (Dominguez и др., 1998) и миозина моллюска (Houdusse и Cohen, 1996; Houdusse и др., 1999; Houdusse и др., 2000), а также ряд комплексов миозина с АДФ и негидролизуемыми аналогами нуклеотида, которые показывают разные конформации миозина, соответствующие, по мнению авторов, разным стадиям силогенерирующего шага (Houdusse и Sweeney, 2001). Реконструкции миозина показывают существование "шейного" домена (остатки 770-843 первичной последовательности миозина цыплёнка) в структуре S1, который и является
упругим элементом мостика, постулированным в модели Huxley и Simmons'а 1971 г.
На основе этих реконструкций миозина и акто-миозинового комплекса была выдвинута гипотеза (Uyeda и др., 1996; Howard и Spudich, 1996; Anson и др., 1996; Holmes, 1997), согласно которой 'шейка' играет роль 'рычага', приводимого в действие 'конверторным' доменом (остатки 711-781 в аминокислотной последовательности миозина Dictyostelium discoideum; Holmes, 1997). В соответствии с этой гипотезой актин-связывающий, или моторный, домен миозина к моменту силогенерирующего шага прочно и неподвижно связан с актином, а всё движение производится только "шейным" доменом. Например, было экспериментально показано (Uyeda и др., 1996), что скорость движения филаментарного актина по поверхности, покрытой миозином, линейно связана с числом IQ мотивов а-спирального «хвостового» участка субфрагмента 1 миозина, иначе говоря, его длиной.
В настоящее время результаты изменения интенсивности рефлекса МЗ рентгеновской дифракции на мышечном волокне, синхронные с фазой быстрого частичного всстановления напряжения после ступенчатой деформации, также интерпретируются в рамках этой гипотезы (Irving и др., 2000).
Движение хвостового домена субфрагмента 1 молекулы миозина относительно моторного домена было также показано с помощью резонансного переноса флуоресценции (Suzuki и др., 1998). Для этого в аминотерминаль моторного домена был встроен GFP (зелёный флуоресцентный белок),
возбуждаемый источником света, а в его карбоксильную терминаль - BFP (голубой флуоресцентный белок), возбуждаемый флуоресценцией GFP. По интенсивности вторичной флуоресценции BFP было обнаружено, что карбоксильная терминаль меняет угол относительно аминотерминали в шаге изомеризации цикла гидролиза АТФ, а затем возвращается назад предположительно в момент сброса неорганического фосфата.
Разработанная в 80-х годах акто-миозиновая in vitro подвижная система (motility assay; Sheetz и Spudich, 1983; Harada и др., 1987) позволила визуализовать движение одиночных флуоресцентно меченых нитей актина по поверхности, покрытой миозином, с помощью флуоресцентной микроскопии и измерять скорость движения при различных экспериментальных условиях, но не исследовать механизм взаимодействия. В середине 90 годов на основе in vitro подвижной системы был создан метод оптической ловушки, который позволил с помощью флуоресцентной микроскопии в комбинации с достаточно мощным инфракрасным лазером регистрировать величину и силу шага одиночных взаимодействий актина и миозина (Finer и др., 1994; Molloy и др., 1995). Однако, измеренные таким методом параметры взаимодействия белков противоречивы и не дают величин, согласующихся с результатами механических измерений на волокне. Это, видимо, объясняется некоторой неопределённостью механических характеристик, присущих самой методике, в частности, наличием неучтённой податливости при фиксации молекул миозина к подложке и нитей актина в манипуляторе. Кроме того, результаты, полученные методом оптической ловушки, позволяют получать количественные характеристики механических
параметрах силогенерирующего шага мостика, но не дают детальных представлений о механизме взаимодействия актина и миозина. Следует, однако, заметить, что методика исследования взаимодействия актина и миозина на уровне одиночных молекул весьма активно развивается и совершенствуется в последние годы и результаты таких измерений становятся всё более ясными и определёнными (см., например, Veigel и др., 2003). Кроме того, такой подход не ограничивает исследователя в выборе объекта и позволяет использовать как нативные миозины различных классов, так и модифицированные молекулы со свойствами, не встречающимися в природе, но удобными для тех или иных экспериментальных целей.
Томограммы электронно-микроскопических срезов летательных мышц насекомых, полученных быстрым замораживанием (Taylor и др., 1999), показывают серьёзные отличия в конфигурации моторного домена по сравнению с реконструкциями акто-Sl комплекса (Rayment и др., 1993b; Mendelson и Morris, 1997).
Таким образом, из всего сказанного следует очевидный вывод: несмотря на огромный прогресс в изучении механизма мышечного сокращения, на целый ряд гениальных догадок, развитие и разработку уникальных методов исследования, природа генерации силы в мышце остается в значительной мере неизвестной. Сама модель Huxley и Simmons'a 1971 года, а также экспериментальный подход, на результатах которого она была основана, стимулировали развитие целого ряда подходов к изучению механизма
мышечного сокращения, так называемых методов нестационарной кинетики. Кроме упомянутого метода быстрых деформаций, для исследования силогенерирующего процесса были разработаны метод скачка давления с целью повлиять на термодинамические параметры в сокращающейся мышце; метод импульсного фотолиза искусственно инактивированных участников биохимического цикла мостика, таких как АТФ, АДФ, неорганического фосфата и свободного кальция. Был также разработан и использован метод лазерного скачка температуры, который позволяет увеличивать температуру в экспериментальной камере объёмом в несколько десятков микролитров на 4-8С за время порядка долей миллисекунды.
Нами был разработан метод джоулева скачка температуры для одиночного скинированного волокна скелетной мышцы. Принцип метода состоит в следующем: через волокно, подвешенное в воздухе на одну-две секунды, пропускается импульс переменного электрического тока и это ведёт к выделению в волокне джоулева тепла. Метод позволяет увеличить температуру волокна с ~5С (то есть, от температуры воздуха в экспериментальной камере) вплоть до 35-40С за десятые доли миллисекунды. Быстрое повышение температуры сокращающегося волокна ведёт к значительному росту силы, зависящему от величины скачка температуры. Такой подход позволяет исследовать силогенерирующий процесс в мышце и сравнивать его с переходным процессом, вызванным ступенчатыми деформациями.
Используя метод скачка температуры мы зарегистрировали и исследовали механические характеристики вызванного им переходного процесса напряжения в одиночных мышечных волокнах лягушки и кролика. Механические эксперименты были сделаны с параллельной регистрацией длины саркомеров по дифракции света He-Ne лазера на волокне, что несомненно повышает возможности контроля качества волокна и достоверности результатов, так как даёт возможность судить о влиянии укорочения саркомеров на силу и, главным образом, на кинетику переходных процессов силы. В некоторых экспериментах длина саркомеров поддерживалась постоянной при помощи обратной связи по положению первого максимума дифракции, что позволяет исключить неоднородность укорочения саркомеров вдоль волокна, которая может влиять на результаты измерений. Действительно, было найдено, что неоднородность укорочения саркомеров замедляет кинетику переходного процесса силы после скачка температуры, практически не влияя при этом на максимальное напряжение. С использованием обратной связи по длине саркомеров была зарегистрирована температурная зависимость максимального изометрического напряжения в мышце кролика. С коррекцией на увеличение площади поперечного сечения мышечных волокон в результате разрушения наружной мембраны (скинирования), максимальное напряжение при физиологической температуре достигает 400 кН м".
Было показано, что рост напряжения в ответ на скачок температуры не сопровождается сколь-либо заметным увеличением жёсткости волокон и, стало быть, рост силы с повышением температуры связан не с увеличением числа
миозиновых мостиков, присоединённых к тонким нитям, а с увеличением силогенерирующей способности мостиков.
Переходный процесс напряжения в ответ на скачок температуры сравнивали с механическим, вызванным ступенчатым изменением длины в одних и тех же волокнах. Оказалось, что кинетика температурного ответа даже при скачках температуры в 30-35С всегда медленнее кинетики механического ответа даже при нулевой температуре.
Позднее метод скачка температуры был адаптирован для одновременной
регистрации рентгеноструктурных событий, происходящих во время
силогенерирующего процесса, вызванного быстрым повышением температуры.
С помощью такого подхода на дифракционной рентгенограмме
сокращающегося мышечного волокна были обнаружены изменения, не наблюдавшиеся ранее, а именно: рост напряжения, вызванный скачком температуры, сопровождается значительным повышением интенсивности первой актиновой слоевой линии, причём это повышение, как нам удалось показать, происходит синхронно с ростом напряжения. Такой результат противоречит чисто «рычажному» механизму силогенерации в молекуле миозина, где только поворот «хвостового» домена относительно моторного полагается активным процессом. Найденные изменения интенсивности 1-й и ряда других слоевых линий актина, как показано в настоящей работе, свидетельствуют о том, что взаимодействие молекулы миозина с поверхностью актина является не менее важной фазой силогенерирующего процесса.
Исследование силогенерирующего процесса в мышечных волокнах кролика с помощью быстрых изменений длины и температуры
Сила в активно сокращающейся мышце генерируется поперечными мостиками -глобулярными молекулами миозина, простирающимися из толстых нитей и формирующими временные связи с соседними нитями актина. Предполагается, что мостики действуют независимо друг от друга и асинхронно (A. F. Huxley, 1957). Huxley и Simmons (1971) использовали быстрые изменения длины одиночного сокращающегося мышечного волокна для синхронизации механических событий значительной доли мостиков, присоединённых к тонким нитям. Быстрое высвобождение длины сокращающегося волокна на величину 0,1-0,5% ведёт к мгновенному упругому падению напряжения, за которым следует быстрое частичное его восстановление до некоторого промежуточного уровня (фаза 2 по Huxley и Simmons у), после чего напряжение относительно медленно восстанавливается к начальному уровню. Согласно теории Huxley и Simmons a фаза 2 есть результат силогенерирующего перехода, или шага, в мостиках. Этот переход происходит на миллисекундной временной шкале и рассматривается как универсальный механизм генерации силы в мышце. Однако, как подчёркивал A. F. Huxley (1981), необходимы независимые доказательства такого шагового перехода, чтобы предложенная им теория могла быть принята. С тех пор был разработан целый ряд методов исследования механизма силогенерации, основанных на кинетическом подходе, то есть нарушении равновесного распределения состояний мостиков в сокращающейся мышце. Скачок температуры позволяет увеличить температуру одиночногомьппечного волокна за доли миллисекунды, что достигается либо с помощью импульса мощного инфракрасного лазера (Goldman и др., 1987; Davis, Harrington, 1987а, 1987b, 1993; Davis, Rodgers, 1995a, b; Ranatunga, 1996), либо джоулевым нагревом (Bershitsky, Tsaturyan, 1985, 1992, 1995, 2002). Сокращающееся волокно отвечает на скачок температуры значительным увеличением напряжения. Амплитуда и временной ход переходного процесса напряжения зависят при этом от значений начальной и конечной температур. Временной ход прироста напряжения обычно аппроксимируют суммой двух экспоненциальных слагаемых. Быстрый из этих компонентов рассматривался как соответствующий фазе 2 механического переходного процесса Huxley и Simmons a (Goldman и др., 1987; Бершицкий, Цатурян, 1988, 1992; Davis, Harrington, 1993; Davis, Rodgers, 1995a; Ranatunga, 1996). Кинетика фазы 2 переходного процесса, вызванного механическим укорочением, как было показано (Ford и др., 1977; Linari и др. 1993), зависит от амплитуды изменения длины саркомеров, поэтому существенным является поддержание длины саркомеров постоянной во время переходного процесса или, по крайней мере, отслеживать её изменения. Однако во всех предыдущих исследованиях со скачком температуры такой контроль не применялся и, следовательно, не существовало представлений о том, что происходит с саркомерами во время вызванного изменением температуры переходного процесса напряжения.
В контрольных экспериментах был изучен эффект обратной связи по длине саркомеров на характеристики переходного процесса напряжения, вызванного скачком температуры. На рис. 2.1 показаны две экспериментальные записи переходных процессов напряжения, вызванных 30С скачками температуры. В том случае, где локальные изменения длины саркомеров были умеренными и, что существенно, медленными, обратная связь по длине саркомеров практически не влияла на амплитуду и временной ход роста напряжения по сравнению с контролем по полной длине (рис. 2. L4). В случае же больших и быстрых изменений в длинах саркомеров, обратная связь, поддерживающая их постоянными, оказывала серьёзный эффект на временной ход переходного процесса напряжения (рис. 2.1Б). Быстрые изменения длин саркомеров центрального участка волокна указывают на неоднородность их механических свойств. Возможно, они вызываются повреждением концевых сегментов волокна из-за скачка температуры. Следует отметить при этом, что в отличие от временного хода, конечное напряжение практически не зависит от изменений в длинах саркомеров. В экспериментах, представленных здесь, использовались только те волокна, в которых изменения длины саркомеров после скачка температуры не превышали 15 нм и не содержали при этом быстрого компонента.
Поскольку локальные изменения длин саркомеров влияют на ответы напряжения при быстром изменении температуры (рис. 2.1), была сделана серия экспериментов, где скачки температуры разной величины прикладывали к полностью активированным мьппечным волокнам в условиях постоянства длины саркомеров с помощью обратной связи. Конечное напряжение и временной ход переходных процессов зависели от амплитуды скачка температуры и были хорошо воспроизводимы. На рис. 2.2 показана серия переходников напряжения в мышечном волокне, вызванных скачками температуры. Видно, что записи, полученные во время второй и шестнадцатой активаций, где финальные температуры были 32,1С и 33,2С, соответственно, практически неразличимы. Небольшое падение напряжения во время самого скачка температуры, фактически, предшествующее росту напряжения (см. также рис. 3.L4) происходит, как было показано (Бершицкий, Цатурян, 1985; Bershitsky, Tsaturyan, 1989, 1992; Goldman и др., 1987), из-за температурного расширения волокна.
Исследование реакции напряжения на быстрые изменения длины и температуры в мышечных волокнах кролика, обработанных ЭДК
Для того, чтобы отделить долю миозиновых мостиков, которые присоединены к актину и участвуют в механическом ответе мышцы, мышечные волокна в состоянии ритора обрабатывали 1-(-3-диметиламинопропил)-3 этилкарбодиимидом (ЭДК) - нульмерным молекулярным линкером, чтобы ковалентно «пришить» к актину часть миозиновых головок, присоединённых к тонким нитям (поперечных мостиков), а затем заменяли раствор на высокосолевой расслабляющий (ВСРР) с ионной силой 0,6 М для того, чтобы отсоединить от актина все непришитые головки. Механические свойства пришитых мостиков и их способность генерировать силу исследовалась быстрыми ступенчатыми изменениями длины волокна и скачками температуры с 6-9С до 30-40С. После частичной сшивки, когда мгновенная жёсткость волокон в ВСРР была 25-40% ригорной, механическое поведение волокон было похоже на то, что имеет место в нормальном сокращении. Кинетика ответов напряжения, вызванных скачком температуры, так же как и фаза быстрого частичного восстановления напряжения после ступенчатого изменения длины волокна, была близка тому, что наблюдается в нормальных скинированных сокращающихся волокнах. Под контролем обратной связи по силе, волокна укорачивались на величину вплоть до 4нм-(п.с.)-1 в ответ на скачок температуры. Работа, производимая пришитым мостиком в ответ на скачок температуры, составила 30x10" Дж. Если степень сшивки увеличивали и жёсткость волокна в ВСРР приближалась к ригорной, волокна теряли вязкоупругие свойства и способность генерировать силу в ответ на повышение температуры. Общепринято, что миозиновые мостики мышечных клеток генерируют силу, взаимодействуя с актином. Однако отделить силогенерирующий процесс присоединённых мостиков от эффектов их присоединения во время мышечного сокращения достаточно трудно. Доказательства быстрого присоединения мостиков после ступенчатого изменения длины сокращающегося мышечного волокна получены как из механических (Lombardi и др., 1992), так и ренттено-дифракционных (Piazzesi и др., 1995) экспериментов. Известна процедура, которая позволяет предотвратить присоединение и отсоединение мостиков от актина (Tawada и Kimura, 1986).
Головки миозина в скинированных мышечных волокнах ковалентно пришиваются к актину нульмерным линкером, 1-(-3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид (ЭДК), а непришитые головки отсоединяют от актина с помощью высокосолевого (0,6 М) расслабляющего раствора (ВСРР). В таком растворе только пришитые головки дают вклад в механические свойства волокна. Tawada и Kimura (1986) показали, что ЭДК сначала сшивает ствол миозиновои нити, так что ионная сила раствора вплоть до 1 М не ведёт к их растворению. Было показано (Tawada и Kawai, 1990), что сшитые волокна производят работу в ВСРР при приложении малоамплитудных изменений длины. Когда такие волокна переносят из ВСРР в ригорный раствор, они развивают напряжение (Tawada и др., 1989). Однако, изучать силогенерацию сшитых волокон в чисто механических экспериментах достаточно непросто. Метод джоулева скачка температуры позволяет увеличить температуру волокна с 5С вплоть до 40С за 0,15 мс (Бершицкий и Цатурян, 1989; Bershitsky, Tsaturyan, 1992, 2002). Такой подъём температуры ведёт к увеличению напряжения в изометрически сокращающемся мышечном волокне в несколько раз. Это показывает, что силогенерирующий процесс(ы) участвует в ответе мышцы на скачок температуры и, следовательно, скачок температуры может быть использован для возбуждения шага в пришитых мостиках. Для измерения жёсткости и оценки вязкоупругих характеристик пришитых мостиков, исследовались ответы напряжения на ступенчатые изменения длины волокон после сшивки и сравнивались с ответами до обработки ЭДК. Процедура, описанная Tawada и Kimura (1986) использовалась с некоторыми модификациями. Мышечное волокно вводили в состояние ритора при 0С в экспериментальной камере. Ригорный раствор (таблица 4.1) был заменён два-три раза, в этом растворе волокно выдерживали по крайней мере в течение 10 минут, после чего температуру в камере поднимали до 15С.
Ригорный раствор заменяли ещё раз и выдерживали в нём волокно ещё в течение 10 минут. Такая процедура ригоризации минимизировала разброс длины саркомеров. Ригорный раствор заменяли на буферный (таблица 4.1) на 10-15 минут, а затем на сшивающий (тот же буфер с 15 мМ ЭДК) на 15-120 минут. Во время этой процедуры волокно периодически растягивали и отпускали примерно на 0,5% длины каждые 3 секунды для того, чтобы предотвратить возможность сшивки других (не мостиковых) структур. Процесс сшивки останавливали двух-трёхкратным промыванием камеры буферным раствором. Большая часть экспериментов со сшитыми волокнами бьша сделана с ригорным и расслабляющим растворами, ионная сила которых бьша поднята до 0,6 М. Какодиловая кислота использовалась как рН буфер из-за её низкой температурной чувствительности (АрКа-АТ-1 = -0,0045-К-1; Bershitsky, Tsaturyan, 1992). Степень сшивки оценивали по жёсткости волокна в ВСРР по сравнению с жёсткостью в риторе.
Рентгенодифракционные исследования структурных изменений, сопровождающих силогенерирующий процесс в мышце
Малоугловая рентгеновская дифракция является одним из наиболее старых и в то же время, пожалуй, наиболее эффективным методом изучения молекулярной структуры мышцы и её изменений в различных физиологических и экспериментальных условиях (Н. Huxley, 1996, 2000). Наряду с данными световой (A. Huxley, Niedergerke, 1954; Н. Huxley, Hanson, 1954) и электронной микроскопии (Н. Huxley, 1953; Н. Huxley, 1957) результаты, полученные с помощью рентгеновской дифракции (Н. Huxley, 1952; Н. Huxley, Brown, 1967), дали структурную основу «мостиковой» теории мышечного сокращения. С появлением и развитием синхротронов - источников интенсивного и высококоллимированного рентгеновского луча - и быстрых двумерных электронных детекторов стало возможным использовать этот метод для изучения структурных событий, которые сопровождают силогенерирующий процесс в одиночных мышечных волокнах. Однако, первые эксперименты по исследованию структурных событий, сопровождающих переходный процесс напряжения, были сделаны на целой изолированной мышце лягушки (Н. Huxley и др., 1983). Авторы обнаружили, что единственным структурным признаком на дифракционной рентгенограмме, сопровождающим переходный процесс напряжения, вызванный быстрой деформацией во время тетанического сокращения, было преходящее падение интенсивности меридионального рефлекса МЗ, соответствующего осевому периоду миозина в 145 А. Полученное в этой работе временное разрешение в 1 мс не позволило, однако, утверждать,что найденное изменение интенсивности непременно связано с реакцией напряжения на деформацию. Почти через 10 лет блестящие эксперименты были сделаны с таким же протоколом на одиночных интактных волокнах скелетной мышцы лягушки (Irving и др., 1992) и авторы этой работы, получив временное разрешение в 0,1 мс, смогли уверенно заявить, что изменение интенсивности МЗ происходит синхронно с силогенерирующим процессом в мышце. Первая интерпретация результатов состояла в том, что падение интенсивности рефлекса МЗ происходит из-за изменения ориентации головки миозина, S1 (рис. 6.1), присоединённой к тонкой нити, как целого: от почти перпендикулярной в изометрии к наклонённой после быстрого укорочения саркомера. Восстановление интенсивности МЗ, происходящее практически синхронно с переходным процессом напряжения, отражает восстановление ориентации S1.
Однако позднее интерпретация изменений интенсивности МЗ в ответ на деформацию мышцы изменилась, и те же авторы (Piazzesi и др., 1999; Irving и др., 2000) теперь настаивают на том, что эти изменения отражают внутреннюю конформацию в S1, состоящую в изменении угла «хвостового» домена S1 по отношению к каталитическому домену. Действительно, в кристаллографических исследованиях найдены различные углы ориентации хвостового домена в зависимости от того, с каким аналогом нуклеотида был кристаллизован S1 (Dominguez и др., 1998; Houdusse и др., 1999; Houdusse и др., 2000) и это, несомненно, даёт право на интерпретацию конформационных изменений интенсивности МЗпри ступенчатых деформациях. Следует, однако, обратить внимание на то, что одни и те же авторы дают разное толкование найденному ими феномену и это объясняется тем фактом, что на основании изменения интенсивности одного лишь рефлекса очень трудно судить о природе явления, порождающего это изменение, тем более в такой сложно организованной структуре, как мышечная клетка.
Несколько лет назад мы начали исследовать с помощью рентгеновской дифракции структурные изменения, сопровождающие развитие напряжения в активно сокращающемся мышечном волокне в ответ на скачок температуры. Первые эксперименты были сделаны на одиночных скинированных волокнах скелетной мышцы лягушки, частично «подшитых» с помощью ЭДК (см. главу4) для стабилизации структуры саркомеров и возможности поддержания волокон в активированном состоянии в течение длительного, до нескольких часов, времени, необходимого по условиям экспериментов на синхротроне (Bershitsky и др., 1996). Первый экспериментальный протокол был устроен следующим образом: на плато напряжения до и после скачка температуры от 5С до 17С к сокращающемуся волокну прикладывали ступеньки укорочения (высвобождение) и удлинения (рывок) величиной 3 нм-(п.с) 1 для того, чтобы проверить воспроизводятся ли в скинированных подшитых волокнах и при разных температурах те феномены, что имеют место в интактных волокнах (Bershitsky и др., 1997). Было найдено, что как при низкой, так и при высокой температуре и высвобождение волокна, и рывок ведут к падению интенсивности рефлекса МЗ, то есть результаты, полученные в интактных волокнах, полностью воспроизводятся в подшитых скинированных волокнах. В то же время рост напряжения в ответ на скачок температуры сопровождается подъёмом интенсивности рефлекса МЗ, но никак не её падением. Наиболее важным результатом, полученным в этих экспериментах, было обнаружение увеличения интенсивности актинового компонента первой слоевой линии (А1, рис. 6.2, 6.3) с ростом напряжения в волокне при повышении температуры. Следует напомнить, что рост напряжения в ответ на скачок температуры происходит без сколь-либо существенного увеличения жёсткости волокна (см. главу 2), а следовательно, без увеличения числа присоединённых к актину миозиновых
Интерпретация результатов: структурно-кинетическая модель двухшагового механизма работы поперечного мостика
Основные результаты экспериментов по исследованию рентгеноструктурных событий, сопровождающих силогенерирующии процесс в сокращающихся мышечных волокнах, можно суммировать в виде следующих трёх пунктов. 1. Рост интенсивности первой актиновои слоевой линии, /дь И рост напряжения в ответ на скачок температуры происходят одновременно (рис. 7.5-7.7). Независимость жёсткости волокна от температуры (Tsaturyan и др., 1999; Bershitsky, Tsaturyan, 2002; Piazzesi и др., 2003) и отсутствие изменений интенсивности рефлекса 1,1 после скачка температуры (рис. 7.6) указывают на то, что рост напряжения с температурой происходит при постоянстве числа миозиновых мостиков, присоединённых к тонким нитям. Это означает, что рост интенсивности актиновых и актин-миозиновых слоевых линий после скачка температуры (рис. 7.2, 7.3А) вызывается изменением конфигурации взаимодействия мостиков с актином, а именно, их переходом из нестереоспецифического присоединения в стереоспецифическое связывание. Синхронный рост напряжения и контрастирования актиновои спирали головками миозина показывает, что стереоспецифическое "застегивание" головок на актине является необходимой фазой силогенерации мостика.
Падение I\to при относительном постоянстве I\f\ также свидетельствует в пользу перехода нестереоспецифически присоединённых головок в стереоспецифически 141 связанное состояние, поскольку когда каталитический домен нестереоспецифически присоединённой головки встраивается в спираль актина, то хвостовой домен головки миозина отходит от ствола толстой нити, снижая тем самым I\to, хотя общая масса, связанная с тонкой нитью, а следовательно и 1\г\, не меняется (Tsaturyan и др., 1999). 2. Интенсивность первой актиновои слоевой линии, /АЬ зависит от механического напряжения (рис. 7.2,7.4Б, 7.5, 7.7). 3. Изменение интенсивности рефлекса МЗ, /мз при росте напряжения в ответ на скачок температуры носит двухфазный характер (рис. 7.7). Быстрое падение /мз начинается в момент 1 мс скачка температуры, то есть происходит на той же временной шкале, что и в ответ на ступенчатую деформацию мышечного волокна. Кажется неожиданным, что это падение интенсивности не сопровождается реакцией силы. Это наблюдение предполагает, что часть ответа /мз связана со структурными переходами в присоединённых головках миозина, которые находятся в пре-силогенерирующем состоянии или состояниях. Вклад неприсоединённых головок в /мз кажется несущественным (Linari и др., 2000), хотя и не может быть полностью исключён. Кинетика роста напряжения и изменений /Ai и /1,0 в мышечном волокне в ответ на скачок температуры (рис. 7.5, 7.7) в несколько раз медленнее, чем изменения напряжения, /А1 и /мз5 наблюдаемые в ответ на быстрые изменения длины (рис. ЗЛА, З.ЗА; Irving и др., 1992, 2000; Lombardi и др., 1995). Кроме того, кинетика переходного процесса напряжения, вызванного ступенчатыми изменениями длины является зависимой от напряжения (Huxley, Simmons, 1971), тогда как переходный процесс в ответ на скачок температуры выглядит не зависящим от напряжения (гл. 4; Bershitsky, Tsaturyan, 1995, 2002). В то же время силогенерирующий переход обязан зависеть от напряжения в силу вклада упругой энергии в энергию активации такого перехода (Huxley, Simmons, 1971).
Ответы на скачок темепратуры кажутся не зависящими от напряжения, хотя увеличение силы при высокой температуре и постоянство числа присоединённых мостиков явно указывает на то, что средняя сила, приходящаяся на один мостик, растёт. Такие наблюдения заставляют полагать, что время-лимитирующие шаги в молекулярных событиях, вызванных быстрыми изменениями температуры и длины, различны. Это различие может быть объяснено тем, что в ответ на скачок температуры быстрый, зависящий от напряжения силогенерирующий процесс маскируется более медленным скорость-лимитирующим и не зависящим от напряжения кинетическим шагом (или несколькими шагами), предшествующим силогенерации. Для интерпретации полученных результатов мы предлагаем структурно-кинетическую модель, показанную на рис. 8.1 и основанную на следующих предположениях: 1. Силогенерирующий процесс миозиновых головок просходит в два отдельных шага: а) вращение нестереоспецифически присоединённых головок с их застегиванием как целого в стереоспецифически связанное состояние (переход 3 - 4 на рис. 8.1) и б) последующий поворот шейного домена вокруг моторного домена (переход 4 -»5). Первый шаг не сопровождается изменениями в субфрагменте-1, тогда как второй связан с открытием фосфат-связывающего кармана (сопряжённого с движением рычага, то есть шейного домена), способствующего высвобождению фосфата и АДФ (Geeves, Holmes, 1999). 2. Оба шага силогенерирации быстрые ( 1,000 с"1), обратимы и зависят от механического напряжения, как предполагается моделями типамодели Huxley и Simmons a (Huxley, Simmons, 1971; Piazzesi, Lombardi, 1995). При низкой нагрузке каждый из этих шагов может переместить толстые и тонкие нити на 4-5 нм друг относительно друга. Если скольжение нитей невозможно, механическая энергия сохраняется в виде упругой энергии изгиба шейного домена субфрагмента-1 (рис. 8.1; Dobbie и др., 1998). 3. Переход вращение-застегивание (3- 4 на рис. 8.1) может происходить только после гидролиза АТФ. 4. Как показывают недавние кинетические эксперименты (Malnasi-Csizmadia и др., 2001; Urbanke, Wray, 2001), гидролиз АТФ происходит в две стадии: быстрого перехода (Г —» 2 ) из открытой в закрытую конформацию (закрытие АТФ-связывающего кармана и движения конвертора и хвостового домена в направлении, противоположном силогенерирующему шагу), за которым следует собственно гидролиз АТФ, более медленный и емпературо-зависимый (2 - 3,2 - 3 ). 5. Открытый и закрытый М-АТФ и пре-силогенерирующий М-АДФ-Pj комплексы связывают актин слабо, обратимо и нестереоспецмфически, видимо через электростатические контакты между лизин-содержащей петлёй 2 на субфрагменте-1 и положительно заряженой N-терминалью актина (Rayment и др., 1993). Эти комплексы обладают существенной осевой, или продольной, жёсткостью, но головки в таких комплексах присоединены к актину под разными азимутальными и осевыми углами, как предполагалось в ряде публикаций (Bershitsky и др., 1997; Tsaturyan и др., 1999; Huxley, 2000) и наблюдалось с помощью электронной микроскопии в сокращающихся летательных мышцах насекомых (Taylor и др., 1999) и в растворе актин-субфрамент-1 (Walker и др., 1999). Вклад нестереоспецифически присоединённых головок в актиновые и актин-миозиновые слоевые линии низок, поскольку распределение их дифрагирующей массы в пространстве саркомера примерно однородно и не следует спиральной симметрии актина. 6. Обращение силогенерирующего шага (переход из открытого в закрытое состояние; 1 -» 2 ) может происходить только в отсоединённой от актина головке миозина. Такое предположение исключает отрицательный шаг, то есть обратный шаг головки. В соответствии с кинетической схемой (рис. 8.15) система обыкновенных дифференциальных уравнений, описывающих изменение относительных концентраций с\ (т.е. вероятностей пребывания миозиновых головок в состоянии і) имеет вид:
