Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор-литературы 8
1.1. Предполагаемый кинетический механизм механохимического цикла мостика 8
1.2. Регуляция работы миозиновых мостиков в сократительной системе мышцы ...19
Глава 2. Методики «38
Глава 3. Исследование элементарного механохимического процесса в мышце с помощью ванадата - аналога неорганического фосфата 46
3.1. Взаимодействие ванадата с сократительной системой в активном, релансированном и ригорном состояниях .46
3.2. Обсуждение результатов ...52
Глава 4. Исследование некоторых аспектов кальциевой регуляции механохимического процесса в мышце ...38
4.1. Исследование роли структурной подвижности актина в механизме кальциевой регуляции с помощью фаллотоксинов .58
4.1.1. Изучение действия фаллотоксинов на механику сокращения волокон при разных степенях активации 61
4.1.2. Исследование влияния фаллотоксинов на конформацию актина в теневых волокнах ...71
4.1.3. Исследование влияния фаллоидина на белковый состав миофибрилл 76
4.1.4. Исследование взаимодействия волокон с флуоресцентными аналогами фаллоидина ..79
4.2. Исследование механизма кальциевой активации с помощью ванадата ...89
4.3. Обсуждение результатов 95
Заключение 108
Выводы 111
Список цитируемой литературы ...114
- Регуляция работы миозиновых мостиков в сократительной системе мышцы
- Взаимодействие ванадата с сократительной системой в активном, релансированном и ригорном состояниях
- Изучение действия фаллотоксинов на механику сокращения волокон при разных степенях активации
- Исследование взаимодействия волокон с флуоресцентными аналогами фаллоидина
Регуляция работы миозиновых мостиков в сократительной системе мышцы
Переход поперечно-полосатой мышцы из расслабленного в активное состояние происходит в результате вызванного деполяризацией мембраны выброса кальция из саркоплазматического ретикулу-ма. После окончания стимуляции концентрация кальция понижается до величин, меньших порогового значения (порядка 10 М) за счет работы кальциевого насоса ретикулума и происходит расслабление мышцы си.
При физиологических условиях активность изолированной сократительной системы и ее фрагментов (сокращение и АТФ-азная активность) также регулируется изменением [Ьа2+] в диапазоне Ю"7 - Ю"5 M&2,"/tf2/W& Как теперь хорошо известно,чувствительность к кальцию возникает только при наличии регуляторного тропонин-тропомиозинового комплекса. Очищенные актин и миозин взаимодействуют независимо от [Са2 3 Добавление тропомиозина, тро понина-1 и тропонина-Т ингибирует активность актомиозина при всех [са2+]. При добавлении тропонина-С ингибирование снимается при наличии кальция [173.
Первоначально была предложена стерическая модель кальциевой регуляции 150,58] . Согласно этой модели в отсутствие кальция тропомиозин занимает положение, которое блокирует места связывания миозиновых мостиков на актине. При связывании кальция тропо-нином-С тропомирзин сдвигается в направлении канавки актинового филамента, открывая миозин-связывающие центры актина. В этой схеме кальциевой регуляции не содержалось каких-либо предположений о кояформационных изменениях в актине.
Однако известно, что при малых концентрациях М АТФ АТФ-аз-ная активность миозина и его фрагментов активируется актином независимо от присутствия ионов кальция P3J . Ингибирование этой активности в отсутствии кальция наступает с повышением концентрации МоАТФ. Поскольку акто-субфрагмент-1 содержит один субстрат-связывающий центр Р Л, то ингибирование высокими концентрациями МдАТФ не могло быть объяснено взаимодействием между двумя связывающими центрами миозиновой молекулы. Для объяснения зависимости скорости реакции от концентрации субстрата было предположено, что ингибирующее действие тропонин-тропомио-зинового комплекса может блокироваться не только кальцием, но и ригорными (не содержащими нуклеотида) комплексами. Поскольку один тропонин-тропомиозиновый комплекс может контролировать участок тонкой нити, содержащий семь актиновых мономеров 33] $ было предположено, что, если в такой функциональной единице образуется несколько ригорных комплексов, то остальные ее актиновые мономеры оказываются включенными для взаимодействия [2 , благодаря сдвигу тропомиозина под их влиянием; Такая точка зрения была подтверждена опытами, показавшими, что флуоресценция меченого флуорофором тропонина-1 уменьшается, как при связывании кальция, так и субфрагмента-1 Pll . Для объяснения всех экспериментальных данных по исследованию стационарной кинетики АТФ-азной реакции, катализируемой акто-субфрагмент-1, пришлось ввести еще одно состояние актина с повышенной кофакторной активностью ("потенциированное состояние"). Таким состоянием обладают свободные мономеры актина в блоке, содержащем связанный кальций и ригорные комплексы p3;-f04]# Включение функциональной единицы ригорными комплексами можно было объяснить без привлечения представлений о конформационных изменениях в актине, предположив, что миозин в разных состояниях в ходе АТФ-азного цикла взаимодействует с различными участками актиновой глобулы. Однако потенциацию актина трудно было объяснить без изменений в актине.
В связи с этим необходимо отметить, что сам факт наличия потенциированного состояния актина, постулированный для объяснения кинетических данных, не доказан. Возможно объяснение по-тенциации при высоких кнцентрациях субфрагмента-1 без изменения кофакторных свойств глобул [3J. суть этого объяснения заключается в том, что два положения тропомиозина на актиновой нити не фиксированы, а только наиболее вероятны. Кальций сдвигает равновесие между положениями недостаточно для полного "включения" актина. Поэтому потенциация объясняется не изменением свойств глобул, а увеличением числа "включенных" функциональных единиц.
Исследования последних лет, однако, привели к новым фактам, которые кажутся трудно совместимыми с представлениями сте-рической схемы регуляции. Речь идет об исследовании стадии АТФ азного цикла, на которой он останавливается при отсутствии иона кальция в регуляторном комплексе. Согласно первоначальной схеме при ингибировании АТФ-азной активности субфрагмент-1 не может присоединиться к актину, т.е. белковый комплекс должен быть диссоциирован. В то же время было показано, что при низких ионных силах в условиях почти полного ингибирования АТФ-азной активности субфрагмент-І в ходе АТФ-азной реакции оказывается связанным с регулируемым актинон почти независимо от концентрации кальция С29] # кроме того, было показано, что один из продуктных комплексов субфрагмент-1-АДФ также может связываться с регулируемым актином и вызывать"включение" регуляторного комплекса С 4011 . Таким образом,реакция останавливается, хотя все промежуточные комплексы миозинового субфрагмента-1 , по-видимому, связываются с актином. Поэтому естественно предположение, что присутствие регуляторного комплекса уменьшает скорость одного из переходов на стадии ассоциированного акто-суб-фрагмент-I LZ9], по-видимому, стадию перехода от слабо связанных состояний миозиновых интермедиатов (схема 4) к прочно свя-занным, которая сопровождается наклоном мостика и развитием силы [2 . Эксперименты по исследованию жесткости мышцы на временах 0,1 мс показали, что, хотя при физиологических ионных силах в расслабленной мышце регуляторний комплекс ингибирует стадию присоединения мостиков к актину Г26] f ПрИ очень низких ионных силах расслабление в сократительной системе может быть вызвано ингибированием перехода на стадии замкнутого мостика [26 3 Возможность такого изменения хода реакции удалением кальция из регуляторного комплекса трудно себе представить без аллостерического изменения свойств актина.
Взаимодействие ванадата с сократительной системой в активном, релансированном и ригорном состояниях
Исследовано действие ванадата на активированную сократительную систему волокон, приготовленных по 2-ому способу (глава 2), при Са +- активированном сокращении в растворах с высокими концентрациями Мо -АТФ и Са2+ - растворы II (глава 2) или при ригор-активированном сокращении в растворах без Са + и с малыми концентрациями АТФ - растворы ІУ (глава 2). Показано, что в обоих этих случаях добавление 0,1 - 0,3 ЖЫа Оц сильно уменьшало их изометрическое натяжение и жесткость (рис.3) 0,3 мМ ванадата в обоих случаях вызывало практически полное расслабление волокон. Вызванные ванадатом изменения были обратимы: в активирующих растворах без ванадата волокна вновь развивали силу (рис.3), хотя повторная активация в слу- 7л. чае Са т-активирозанного сокращения приводила, как правило, к разрушению волокон. После переноса волокон, предварительно расслабленных АТФ (50 мкМ) без ванадата,в активирующий раствор (5 мкМ АТФ) с ванадатом наблюдалось временное развитие натяжения перед вызванной ванадатом релаксацией (рис.ЗБ,а). Аналогичное временное повышение натяжения наблюдалось после переноса волокон в такой же активирующий раствор, если ванадат в той же j - добавки Ы&эУО до указанных концентраций, мМ. Цифры под кривыми - значения кошлекснои жесткости 1/2 саркомера, измеренной при 70 Гц , КГ5 Н/нм. А. Результаты опытов с кадьций акхизирдоанным сокра щением. Цифры над стрелками Т указывают перенос в растворы с рСа а 5,71: I - II; 2 III; 3 - III с 0,3 мМ HaBVO# ; 4 - II с 0,3 иШ NajVO . Слева опыт с добавлением ванадата» справа - контроль. Б. Результаты опыта с ригор-активированным сокращением, ( Продолжение подписи к рис.3 ) рСа 9.
Все записи получены на одном волокне. Исходно волокно слегка подтянуто и находилось в растворе ІУ без АТФ. J - добавки АТФ до указанных концентраций, мкМ. Цифры над стрелками Т указывают перенос в растворы: 5 - ІУ с 5 мкМ АТФ и 0,3 мМ No Vfy ; 6 - У с 0,3 мМ Na3V0 ; 7 - ІУ без АТФ; 8 - У; 9 - ІУ с 5 мкМ АТФ; 10 - ІУ с 50 мкМ АТФ. Вставки: а - исходно волокно в растворе ІУ с 50 мкМ АТФ, б - до переноса волокно инкубировано 12 минут в растворе ІУ с 50 мкМ АТФ и 0,3 мМ Ha VO/, , в - до первого переноса волокно в растворе ІУ с 5 мкМ АТФ и 0,3 мМ Ma3VOi, . Перенос волокна из одного раствора в другой мог приводить к смещению нуля в записи силы до З Ю Н , что важно при малых силах. Поэтому в этих случаях информативна только кинетика изменения натяжения после переноса. концентрации был предварительно добавлен к волокнам в расслабляющем растворе с 50 мкМ АТФ.(рис.ЗБ,б) Однако, если ригор-активированные волокна расслаблялись ванадатом, а затем отмывались от ванадата в расслабляющем, то последующий перенос волокон в сокращающий раствор с ванадатом не вызывал такого переходного процесса (рис.ЗБ,в). Следовательно, если ванадат и включается в сократительную систему в условиях релаксации, т.е. без взаимодействия актина и миозина, то много медленнее, чем при сокращении.
Однако включившийся в сократительную систему ванадат не десорбируется в условиях релаксации. Таким образом, и сорбция и десорбция ванадата происходит только при взаимодействия актина и миозина. Аналогичные результаты были получены для Са2 -активированного сокращения. Добавление ванадата к ригорным волокнам не изменяло их механических свойств, как в случае Са-ригора - волокна риго-ризовались раствором, содержащим Са без: АТФ после Са-акти-вированного сокращения (рис ЗА), так и в случае ЭГТА-ригора - волокна ригоризовались без Са у и АТФ после релаксации , вызванной АТФ (рис.4а). Ванадат не изменял также силу и жесткость комплексов волокон с Mg-АДФ или Мо -имидо-АТФ (рис.4б,в). Образование этих комплексов ясно видно по снижению силы волокон при добавлении АДФ или имидо-АТФ. Снижение силы волокон при образовании комплексов сократительной системы с Мо,-АДФ или Ма-имидо-АТФ обусловлено тем, что при связывании в активном центре миозина они вызывают изменения формы белкового комплекса [Tfl. Не было отмечено также никаких изменений механических свойств при добавлении ванадата к волокнам при неполном их насыщении Мо -АДФ или МдгИМіїдо-АТФ, что говорит о том, что ванадат не влияет на константу связывания этих
Изучение действия фаллотоксинов на механику сокращения волокон при разных степенях активации
Волокна закреплялись в установке, как описано в главе 2. После закрепления волокно отпускалось (сдвигались пинцеты) так, чтобы при активации длина саркомера могла установиться равной 2,1 - 2,2 мкм. Затем волокно из раствора І, в котором оно находилось во время закрепления, переносилось в активирующий раствор II с подпороговой концентрацией кальция. Необходимая степень активации достигалась добавлением раствора II с 4,5 мМ СаСбр» После установления стационарного уровня изометрического натяжения ( Р ) проводились измерения частотных характеристик (глава 2). Для этих экспериментов использовались волокна, приготовленные по первому способу (глава 2). Характеристики волокон, полученных разными способами, на ранних и средних степенях активации не отличались, однако волокна приготовленные по первому способу не всегда удавалось довести до максимального уровня активации. Они не обладали достаточной прочностью и, как о правило, разрывались при Р»1 кг/смс (0,7 - 0,8 Рмакс). Изменение свойств волокон в ходе кальциевой активации. По мере возрастания натяжения под влиянием кальция форма релаксационного спектра волокон изменялась (рис. 7 и 8). При высо- Механические свойства контрольного волокна при двух степенях активации. фазово-частотные характеристики (А) и графики Найквиста (С) приведены для промежуточной активации волокна (& ) и при насыщении по кальцию (о ). Символы див, соответствующие графикам частоты и;Найквиста, указывают на кривой натяжения (В) условия, т.е.; значения рСа и Р/Р0, при которых были сделаны соответствующие измерения. Частоты, при которых делались записи, видны на графике А. На диаграммах Найквиста (С) выделены частоты: 6,06 Гц () иД,2 ГЦ (и); на осях абсцисс и ординат соответственно действительная и мнимая части комплексного модуля упругости 10" Н/волокно. ких концентрациях кальция спектр можно было описать суммой трех экспоненциальных процессов с константами скорости" К-г, К2 и К,. Предэкспоненты двух из них Cj и С -больше нуля (на самых низких и высоких частотах), а третий процесс (на средних частотах) с предэкспонентой С2 - меньше нуля.
Этот процесс определяет способность волокон.поддерживать автоколебания и развивать запаздывающее натяжение после скачка длины. Ему соответствует петля на диаграммах Найквиста (рис. 7С и.8С). Частота, при которой Уп{&(и )} имеет минимальное значение, соответствует К2 ( К2 Омин - 2Kf мин ) По мере увеличения степени активации эта константа скорости увеличивается, что видно по смещению -f мин в область более высоких частот: с 1 Гц до б - 8 Гц (рис. 7С,8С ). Это также видно по смещению главного минимума на фазово-частотных характеристиках (рис. 7А и 8А). Однако такое описание изменений релаксационных свойств является приближенным, поскольку в действительности при низких степенях активации спектр более сложный. Ясно видно, по крайней мере, еще два дополнительных процесса: один с Ср 0 на частотах 30 Гц (петля на рис. 7С) и другой с СІ 0 на частотах Ю Гц - соответственно константы КІ и К? . Но амплитуда на 30 Гц очень мала и, как правило, в этой области наблюдается лишь минимум диаграммы Найквиста (рис. 8С). Однако определить параметры всех этих процессов не удавалось, поскольку ошибки оценок параметров превышали их средние значения во много раз. При низких степенях активации определялись параметры четырех процессов Kj, К2, К и К,.
Влияние фаллоидина на свойства волокон при разных степенях активации. Добавление фаллоидина (РА ) к активированным волок- нам приводило к изменениям изометрического натяжения, которые легко разделяются на три фазы: I - небольшое начальное повышение, 2 - падение, 3 - возрастание (рис.9). Величины изменений натяжения и соотношение этих изменений в разных фазах зависели от концентрации кальция. При начальной степени активации (рис. 9,У) фаза 3 отсутствовала даже при оченьдлительном наблюдении (до 1,5 ч). Наиболее сильно эффект добавки фаллоидина проявлялся при большей, но еще низкой степени активации (рис.9,1У). Во второй фазе натяжение падало до нуля, а затем возрастало до величины, значительно превышающей исходный уровень. С ростом степени активации относительные изменения становились меньше (рис.9,III - I). При добавлении фаплоидина к предобработанным волокнам (не менее 20 мин), а затем отмытым от фаллоидина волокнам (рис.9,У1), возникало только повышение натяжения. Эффект от повторных добавок фаллоидина был сравним с эффектом от добавления воды. Добавление фаллоидина к волокнам при малых степенях активации изменяло также их релаксационные свойства. В этом случае после достижения нового стационарного уровня изометрического натяжения петля на диаграммах Намквиста смещалась в область высоких частот, таких же (или даже выше), как у контрольных волокон при высоких концентрациях кальция. Эти изменения не были вызваны изменением величины изометрического натяжения под влиянием фаллоидина, поскольку форма спектра не менялась при возвращении натяжения к прежнему уровню изменением концентрации кальция. Добавление же фаллоидина к волокнам при высоких концентрациях кальция не приводило к существенным изменениям формы спектра, хотя было уменьшение всех предэкспонент, что по-видимому связано с уменьшением натяжения.
Исследование взаимодействия волокон с флуоресцентными аналогами фаллоидина
Эта часть исследований была предпринята с целью установления места действия фаллотоксинов в мышце и выяснения причины необратимости действия фаллоидина. Исследовалось взаимодействие с волокнами флуоресцеинового и родаминового производных фаллоидина (W-PA и Rh-Vh ). Было показано, что релаксационные свойства волокон, предобработанных этими производными, похожи на свойства волокон, предобработанных фаллоидином: в таких волокнах не удалось обнаружить способности к низкочастотным осцилляциям. После добавления фаллоидина к таким волокнам наблюдалось только повышение натяжения (рис.17,5 и б), как и в случае волокон, предобработанных фаллоидином (рис.17,4), Аналогичный характер изменения натяжения наблюдался и в случае добавления флуоресцентных аналогов фаллоидина к волокнам, лре-добработанным фаллоидином (рис.17, 7 и 8). Однако добавление этих производных к контрольным волокнам (рис.17, 2 и 3) приводило, в отличие от действия фаллоидина (рис.17, I), только к падению натяжения. Таким образом, действие фаллоидина и его флуоресцентных аналогов на механические свойства волокон не было идентичным, хотя вероятно обусловлено связыванием в одних и тех же центрах, поскольку предобработка одним из агентов делала волокна нечувствительными к действию других. Для проверки этого предположения было исследовано влияние фаллоидина на кинетику отмывания флуоресцеин-фаллоидина и рода-мин-фаллоидина и предобработки волокон фаллоидином на связывание флуоресцеин-фаллоидина.
Все опыты проводились на волокнах Цифры в начале каждой кривой указывают исходную величину изометрического натяжения волокна ( 10 Н). 4 - момент добавления фаллотоксина. I, 2, 3 - добавление РЬ ,R - РЬ и Rh - РЬ,соответственно,к контрольным волокнам. 4, 5, б - добавление Ph к волокнам, предобработанным PA , F РЬ и-Rk-P соответственно. 7, 8 - добавление соответственно, FI- РЬ и Rh PH к волокнам, предобработанным Ph . диаметром 70 - 90 мкм в растворе I (глава2). Количество связанных красителей оценивалось по интенсивности флуоресценции окрашенных волокон. Интенсивность и спектры флуоресценции измерялись на микроспектрофлуориметре, сконструированном на базе микроскопа МЛ-4 и спектрофотометрической насадки СФН-Ю [7] , источником возбуждения служила ртутная лампа ДРШ -250/2 со светофильтром ФС-І-6, пропускающим 405 и 4-36 нм. Интенсивность флуоресцеции родамин-фаллоидина измерялась на 575 нм, а флуоресцеин-фаллоидина - на 522 нм. На каждом волокне измеряли интенсивность флуоресценции в 10 - 30 точках вдоль волокна и по ним определялось среднее арифметическое. Вымывание флуоресцентных производных фаллоидина из волокон в растворе I происходил очень медленно, однако этот процесс сильно ускорялся фаллоидином (рис. 18 и 19). Поэтому можно думать, что они связываются по тем же центрам, что и фаллоидин. Было проверено также влияние предобработки фаллоидином на связывание флуоресцеин-фаллоидина. Обработанные фаллоидином волокна были отмыты 4- раза по несколько минут при комнатной температуре, после чего отмывались в течение суток при температуре +5 С с непрерывным размешиванием. В течение этого времени раствор менялся три раза, каждый раз по 2,5 мл на I см дл. волокна. Контрольные волокна подвергались такой же отмывке. Затем волокна окрашивались флуоресцеин-фаллоидином 30 минут при 18 С. Результаты приведены в таблице I. При большой степени окраски, когда существенно количество свободных центров, предобработанные фаллоидином волокна связывают существенно меньше флуоресцеин-фаллоидина, что свидетельствует о том, что часть центров занята фаллоидином. В то же время при малых степенях окраски, где более существенна ско- —о без фаллоидина, «о - в присутствии фаллоидина. По оси ординат отношение интенсивности флуоресценции отмываемых волокон к интенсивности их флуоресценции в начальный момент, измеренный через несколько минут после окраски. Точки соответствуют средним результатам по пяти опытам. Стандартные отклонения во всех точках меньше размера символа, обозначающего средний .результат. Обозначения такие же как на рис.18. Точки соответствуют средним результатам по шести опытам. Стандартные отклонения во всех точках меньше размера символа, обозначающего средний результат. Таким образом, из этого опыта можно заключить, что при применяемых способах отмывки значительная часть фаллоидина остается связанной в волокне, что может объяснить причину необратимости его действия. Однако, поскольку его выход из волокна мог ускоряться в ходе окраски флуоресцёин-фаллоидином, количество оставшегося связанным фаллоидина оценить трудно. Для исследования локализации связанных флуоресцеин-фалло.--идина и родамин-фаллоидина были сделаны микрофотографии мио-фибрилл окрашенных и отмытых волокон, полученных гомогенизацией. Волокна окрашивались в растворе I с 50 мкМ флуоресцеин-фаллоидина или родамин-фаллоидина при 18 С один час и отмывались несколько часов. Микрофотографии были получены на микроскопе Ftuovat (ГДР, Карл Цейс). Источник возбуждающего света такой же, как и при измерении интенсивности флуоресценции..
