Введение к работе
Актуальность проблемы.
Процесс транспорта многих вирусов в растениях тесно сопряжен со способностью специфических вирусных белков, обозначаемых как транспортные белки (ТБ), формировать невирионные рибонуклеопротеидные комплексы (РНП-комплексы) с геномными РНК. Образуемая транспортная форма взаимодействует с другими вирус-специфическими белками и белками растения-хозяина, участвующими во внутриклеточном, межклеточном, а в ряде случаев и в дальнем (по проводящей системе растения - флоэме) транспорте вирусного генома. ТБ обеспечивают отбор специфических РНК и правильную структурную организацию РНП-комплекса, определяющую такие его функции, как внутриклеточный транспорт трансляционно неактивного РНП-комплекса к плазмодесмам клеточных стенок и транслокация РНП-комплексов через модифицированные плазмодесмы в соседнюю клетку, сопровождающаяся трансляционной активацией РНК в составе комплекса.
Несмотря на интенсивное изучение транспорта вирусов растений, принадлежащих к различным группам, в настоящее время данные о возможной структуре и принципах образования транспортной формы вирусного генома (невирионного РНП-комплекса) весьма ограничены. До настоящего времени нет не только данных рентгеноструктурного анализа ни для одного из изученных ТБ вирусов растений, но и фактически отсутствуют сведения о структуре ТБ. В связи с этим, изучение структуры ТБ и транспортного РНП-комплекса представляется важным для понимания механизмов, вовлеченных в процессы распространения в растениях не только вирусной инфекции, но и, возможно, клеточных РНП-комплексов, регулирующих рост и развитие растений.
Объектом настоящей работы является ТБ, кодируемый первым геном тройного блока транспортных генов (ТБГ) - белок ТБГ1 полулатентного гордеивируса мятлика (ПЛВМ). Этот белок является основным, если не единственным, компонентом, который формирует транспортные РНП-комплексы с геномными и субгеномными РНК гордеивирусов (Brakke et al., 1988; Lim et al., 2009; Jackson et al., 2009). В отличие от многих других вирусов с ТБГ невирионные РНП-комплексы, сформированные белком ТБГ1 гордеивирусов, участвуют как в межклеточном, так и в дальнем транспорте вирусной инфекции (Morozov and Solovyev, 2003). Участие в этих процессах предполагает наличие в данном белке нескольких различных активностей, в том числе и активности/активностей, замещающей белок оболочки, который в случае большинства вирусов с ТБГ необходим для дальнего транспорта. Белки ТБГ1 гордеивирусов содержат в своем составе НТФазно/хеликазный домен, который характерен для всех белков ТБГ1 (с потекс-подобным и гордеи-подобным ТБГ), и отличаются самым протяженным N-концевым районом среди вирусов с гордеи-подобным ТБГ (Morozov and Solovyev, 2003). В нашей лаборатории ранее было показано, что два кластера положительно заряженных аминокислотных остатков в составе N-концевого района белка ТБГ1 ПЛВМ отвечают как за связывание РНК in vitro, так и за дальний транспорт вирусной инфекции in vivo, но не требуются для ближнего транспорта вируса (Kalinina et al., 2001). Вместе с тем в целом N-концевой район необходим и для ближнего транспорта вируса (Solovyev et al., 1999). Эти данные позволили высказать предположение о том, что белок ТБГ1 способен формировать два разных типа РНП-комплексов, компетентных для ближнего и для дальнего транспорта (Solovyev et al., 1999, Kalinina et al., 2001).
Цели и задачи исследования:
Целью настоящей работы было изучение доменной организации N-концевой половины белка ТБГ1 ПЛВМ, структурных и биохимических харатеристик доменов, а также их возможной роли в формировании транспортной формы вируса.
В ходе работы решали следующие основные задачи: предсказание доменной организации белка ТБГ1 ПЛВМ с использованием компьютерных сервисов и стереохимического метода, получение делеционных мутантов, соответствующих предсказанным доменам; определение вторичной структуры этих доменов методами кругового дихроизма и ИК-Фурье спектроскопии; изучение РНК-связывающих свойств с использованием различных типов нуклеиновых кислот; изучение олигомеризации доменов с применением методов динамического лазерного светорассеяния и атомно-силовой микроскопии; изучение оптическими методами физико-химических свойств доменов, составляющих N-концевую половину белка ТБГ1, и влияние на их структуру нуклеиновых кислот; исследование роли отдельных доменов в формировании невирионных нуклеопротеидных комплексов.
Научная новизна работы и практическая ценность работы:
Впервые показано, что в составе N-концевой половины белка ТБГ1 ПЛВМ существуют два функционально и структурно различных домена: N-концевой домен NTD и внутренний домен ID. Показано, что оба домена, входящие в состав N-концевой половины белка ТБГ1 ПЛВМ, представляют собой белки с неупорядоченными участками, причем NTD является полностью неупорядоченным доменом, а для ID характерно значительное содержание р-структуры (до 40%) и наличие спиральных участков (10-15%) при отсутствии четко выраженной третичной структуры. Показано, что и NTD, и ID взаимодействуют с оцРНК и дцРНК, причем NTD некооперативно, a ID - кооперативно. Обнаружено, что домены белка ТБГ1 ПЛВМ способны образовывать гомоолигомеры различных размеров. Показана способность домена ID, N63K и полноразмерного белка ТБГ1 к образованию нитевидных структур. Предположено, что молекулы РНК инициируют формирование подобных комплексов. Продемонстрировано влияние РНК на структуру ID и белка ТБГ1. Предложен возможный механизм формирования транспортной формы вируса.
Работа имеет существенное значение для понимания молекулярных механизмов транспорта макромолекул в растениях. Материалы работы используются при чтении курсов на Биологическом факультете МГУ имени М.В. Ломоносова.
Апробация работы:
Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии Биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова от 11 мая 2010 года. Результаты работы были доложены на международных конференциях: XIV Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Современные достижения бионаноскопии
(Москва, 2008), XIV International Congress of Virology (Istanbul, 2008), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано семь печатных работ.
Структура работы:
