Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Общее представление о системах рестрикции-модификации 8
1.2. Разнообразие эндонуклеаз рестрикции типа II 13
1.3. Взаимодействие эндонуклеаз типа П с узнаваемой последовательностью 15
1.4. Пространственная структура эндонуклеаз рестрикции типа Я 25
1.5. Биологическая роль систем рестрикции-модификации 33
1.6. Никующие зндонуклеазы 36
1.6.1. Искусственные никазы 39
Получение никаз с нарушенным димеризациоиным интерфейсом 39
Получение никаз путем инактивации одного из каталитически сайтов 42
Никование ДНК с использованием пептидных олигопуклеотидое 43
1.6.2. Практическое применение сайт-специфических никаз 44
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 50
2.1. Материалы 50
2,3 Методы 57
Рассчет значений индекса кодонового соответствия 57
Выделение пяатидной ДНК из E.coli 58
НИР-амплификация 58
Очистка ДНК на Silica 59
Выделение двухцепочечпой формы ДНК фага на основе М13 (мини-преп) 59
Выделение двухцепочечпой формы ДНК фага на основе МП (макси-преп) 60
Выделение одноцепочечгюй формы ДНК фага на основе МП 60
Скрининг рекомбинантных клонов при помощи ПНР с колоний 61
Электрофорез белков в ПААГ 61
Получение компетентных клеток Е. coli 61
Трансформация компетентных клеток Е. coli 62
Индукция экспрессии генов в клетках Е. coli 63
Получение фага ХСЕ6 64
Определение титра фага 64
Проверка способности фага 1СЕ6 активировать транскрипцию с промотора фага Т7 64
Получение клеток BL2J, не чувствительных к присутствию метилаз 65
Выделение ииказы N.BspD6I 65
Определение активности никазы 61
Метод NMB-анализа 68
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 69
3.1 Получение суперпродуцента никазы 69
3.1.1.1 Іолучсние продуцента ииказы на основе ішеток Е. co/ZTOPlOF' 69
3.1.2. Определение влияния кодоиового состава на уровень экспрессии белка 71
3.1.3.Создание генетической конструкции, несущей одновременно гены редких транспортных РНК и ДНК-метиптрансферазы SscLH 76
3.1.4, Конструирование продуцента никазы на основе клеток c0/(BL21(DE3) 80
3.2. Выделение никазы 83
3.3. Определение пространственной структуры никазы 86
3.3.1, Кристаллизация никазы 86
3.3.2, Определение пространственной структуры никазы 88
3.4. Анализ пространственной структуры никазы 89
3.4.1. Субдомен 1 N-концевого домена никазы 90
3.4.2. Субдомен 2N-концевого домена никазы 91
3.4.3. Динкерный домен 92
3.4.4. С-концевой домен 93
3.4.5. Каталитический центр никазы 94
3.4.6. Моделирование комплекса никазы с ДНК 96
3.5. Метод детекции нуклеиновых кислот с помощью молекулярных биконов и никазы 102
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109
5. ВЫВОДЫ 113
6. Список публикаций по материалам диссертационной работы 114
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
- Общее представление о системах рестрикции-модификации
- Рассчет значений индекса кодонового соответствия
- Получение суперпродуцента никазы
Введение к работе
Никование двуспиральной ДНК, т.е. внесение разрыва (ника - nick) только в одну цепь ДНК, вовлечено во многие биологические процессы, такие как инициация репликации ДНК, ДНК-рекомбинация, репарация, коиъюгативная мобилизация некоторых плазмид. Никующие эндонуклеазы, участвующие в биологических процессах, действую']' либо в комплексе с другими белками, либо узнают сложные последовательности ДНК и поэтому не могут использоваться для практических целей. Недавно никующие эндонуклеазы (никазы), которые узнают короткую специфическую последовательность, вносят разрыв в ДНК в фиксированном положении относительно этой последовательности и действуют в виде мономеров, были выделены из бактерий. Эти никазы быстро нашли практическое применение. 11а их основе уже создан ряд новых биотехнологических методов, таких как изотермическая реакция для амплификации олигонуклеотидов, амплификация геномной ДНК, построение простейшего линейного мотора. Новый метод детектирования ДНК-мшненей на основе никазы предложен ;s настоящей работе. Предполагается, что никазы могут заменить эндонуклеазы рестрикции в к.::;Чїйрппачии ДНК и что некоторые проблемы нанотехнологий на основе ДНК могут быть решены с применением этих ферментом. Таким образом, никующие эндонуклеазы становятся ещё одни?.' инструментом мол скуля рн^й бшл^'ми Ограниченное количество природных никующих сайт-специфических эидонуклеаз стимулирует интенсивное конструирование на основе эндонуклеаз рестрикции искусственных никаз с новыми специфичностями. Информация о пространствен у ой структуре ннкующ.чх зіідоііуклеаз необходима как для выяснения механизма йііеоекия ра";р:>ша н одну шли. rIJHK, так и r-jm рационального конструирования никааз с новыми специфичностями.
Никаза N.BspD6I (70.8 кДа) ранее была найдена в штамме Bacillus species D6. Она узнает на двухспиральной ДНК последовательность (сайт) 5'-GAGTC-375'-GACTC-3' и расщепляет только цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4 н.п. от сайта узнавания в сторону З'-конца. На сегодняшний день решена пространственная структура лишь одной нуклеазы, расщепляющей ДНК в стороне от сайта узнавания - эндоиуклеазы рестрикции Fold. Этот фермент, как и никаза, узнает иентануклеотидный сайт, однако место расщепления ДНК у Fokl находится гораздо дальше от сайта узнавания (9/13).
Недавно было показано, что никаза N.BspD6I, которой посвящена настоящая работа, сама является субъединицей гетеродимерной эндоиуклеазы R.BspD6I типа II. В то время как подавляющее большинство эндонуклеаз рестрикции типа II требует димеризации для расщепления ДНК, N.BspD6I способна без участия второй субъединицы связываться с узнаваемой последовательностью и разрезать одну цепь ДНК. Поэтому рассмотрение структуры никазы целесообразно проводить в стравнении с эндопуклеазами рестрикции типа II.
Целью настоящей работы было определение пространственной структуры пикующєй эндоиуклеазы N.BspD6I и разработка на основе никазы нового метода детектирования ДНК-мишеней. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: сконструировать штамм-сулерподуцент никазы; отработать технику выделения никазы с чистотой не менее 95%; найти условия концентрирования (не менее 20 мг/мл) и кристаллизации никазы; получить набор дифракционных данных, достаточный для определения пространственной структуры; - разработать метод гибридизационного анализа ДНК с использованием никазы.
Общее представление о системах рестрикции-модификации
Явление рестрикции-модификации, или контролируемой хозяином модификации (host controlled variation), впервые было описано более полувека назад - в 50-х годах XX века на примере фага X. [Luria el а/., 1952; Bertani el al., 1953]. Подобный эффект был позже обнаружен и при размножении фага ТІ в бактерии Shigella dysenteriae [Drexler et ah, 1961]. Суть этого явления заюиочался в том, что при пересеве фага из одного штамма в другой наблюдалось резкое снижение эффективности инфекции, однако после первого цикла размножения инфекциоиность бактериофага восстанавливалась. В 1962 году Арбером с сотрудниками бьша предложена модель, согласно которой ограничение осуществляется эндопуклеазами, которые расщепляют молекулы ДНК, не защищенные специфической модификацией [Arber et ah, 1962]. Модификацию производит метилтрансфераза, которая метилирует основания ДНК (адении или цитозин). От английского слова restriction - ограничение - эндонуклеазы рестрикции получили своё название.
В конце шестидесятых годов прошлого века из Е.соЫ и Haemophilus influenzae были выделены первые ферменты рестрикции. [Linn and Arber, 1968; Meselson and Yuan 1968; Smith and Wilcox, 1970]. Это послужило толчком к развитию молекулярной биологии, так как эндонуклеазы рестрикции стали использоваться при создании рекомбииантных молекул ДНК [Smith et al, 1976, Rougeon el al, 1975, AHkhanian et al, 1975]. В настоящее время сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции П-го типа являются одним из основных инструментов при манипуляциях с молекулами ДНК. Системы рестрикции-модификации очень распространены у бактерий. Среди трех десятков бактериальных геномов, секвенированых на сегодняшний день, 80% содержат системы рестрикции-модификации, а около 75% из них имеют более одной системы. Больше всего систем рестрикции-модификации обнаружено у Helicobacter pylori J99: этот штамм содержит 23 системы (Tomb et al, 1997). Большое разнообразие систем рестрикции-модификации вызвало необходимость их классификации. Классификация систем Р-М основана на сходстве или различии в молекулярной организации ферментов, необходимых кофакторах реакции, симметрии узнаваемой последовательности и положении точек расщепления ДНК [Kessler et al, 1990]. В настоящее время выделяют три основных типа систем рестрикции-модификации -1, II и III (Рис.1). [Wilson and Murray et al, 1991, Roberts et al, 2003].
Системы рестрикции-модификации типа I представляют собой мультимерные комммлексы (440-770 кДа), образованные тремя типами субъединиц - HsdM, HsdR и HsdS - в соотношении HsdM2 HsdR2 HsdSi. Субъединица HsdM обладает метилазной активностью, HsdR - эндонуклеазной, a HsdS ответственна за узнавание сайта (например, сайт ЕсоВ - TGA8NTGCT). HsdM всех систем метилирует аденины в обеих цепях сайта; метилазной активностью обладает
комплекс HsdM2 HsdS] и для ее проявления необходимы AdoMet, Mg2+ и АТФ. HsdR активна только в комплексе HsdM2 HsdR2 HsdS 1, и ее активность проявляется также в присутствии всех трех кофакторов, которые необходимы для проявления метилазной активности. Расщепление ДНК происходит на расстоянии от 40 н.п. до нескольких т.н.п. примерно по середине между двумя сайтами узнавания [Murray, 2000].
Рассчет значений индекса кодонового соответствия
Данные о кодоновом составе геномов Е. coli К12, Bacillus subtilis, Bacillus
halodurans и Bacillus slearothermophilus взяты из базы данных Codon Usage Database
Института ДНК г. Казуса (Япония) fht1p://www.kazusa. or.jp/codon). Подсчеты
количества кодонов в гене производились с помощью on-line-программы,
размещенной на сайте этой же базы данных
(http://www.ka2usa.or.jp/codon/countcodon.html ).
Для расчета значения индекса кодоиового соответствия (codon adaptation index - CAI) сначала определяли значение индекса относительного использования родственных кодонов (Relative Synonymous Codon Usage - RSCU) для каждого кодона в гене по формуле, предложенной Шарпом и Ли для предсказывания уровня экспрессии белков [Sharp and Li, 1986] где щ - встречаемость jo кодона для г-й аминокислоты, я; - количество (от 1 до 6) альтернативных кодонов для і-й аминокислоты.
Затем рассчитывали САІ индекс как произведение значений величин RSCU для каждого из кодонов, используемых в дашюм гене, деленное на произведение максимально возможных величин RSCU для гена того же аминокислотного состава где RSCUk- значение RSCU для к-го кодона в гене, RSCUmax -максимальное значение RSCU для аминокислоты, кодируемой &-м кодоном в гене, L - количество кодонов в гене.
Определение значений CAI по последовательности гена проводили аналогично, для отдельных сегментов гена по 15 кодонов каждый, согласно Балмеру [Bulmer, 1990]. На основании полученных данных строили график распределения значений CAI по последовательности гена. Расчеты проводили с помощью MS Excel.
Мини-препаративное выделение плазмидной ДНК, проводили по методике Маниатиса [Маниатис и др., 1984]. Для этого клетки Exoli, несущие необходимые плазмиды, осаждали центрифугированием в 1.5 мл пластиковых пробирках (1 мин 12000 об/мин) из 1.5 мл ночной культуры. Осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл буфера, содержащего 50 мМ TrisCl рН 8.0, 10 мМ ЭДТА, 100 мкг/мл рибонуклеазы А. После этого добавляли 200 мкл буфера для лизиса клеток (200 мМ NaOH, 1% SDS), перемешивали встряхиванием и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Затем к лизированым клеткам добавляли 200 мкл холодного 3 М раствора ацетата калия рН 5.3, перемешивали встряхиванием, инкубировали на льду в течение 15 минут и центрифугировали в настольной центрифуге при 12000 об/мин 10 минут. Супернатант обрабатывали фенол/хлороформом с последующим спиртовым осаждением. Полученный осадок растворяли в ТЕ.
Полимеразную цепную реакцию проводили в 20-50 мкл раствора, приготовленного на основе десятикратного буфера для Taq полимеразы, который содержал: 200 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов, 0.5мкМ праймеров, 2 мМ MgS04, 10 иг матрицы, 2 единицы Taq ДНК-полимеразы и 0.1 единицы Pfu ДНК-полимеразы. Температуру отжига олигонуклеотидов рассчитывали по эмпирической формуле Tm=67,5+34[%GC]-395/n, где %GC=(G+C)/n, п - число нуклеотидов. Анализ продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 1% геле агарозы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При создании продуцентов сайт-специфических эядонуклеаз необходимо учитывать, что эти белки токсичны для клеток, так как их ДНК является мишенью для этих ферментов. Защиту клеточной ДНК, как правило, обеспечивает введение гена соответствующей ДНК-метилтрансферазы на отдельной плазмиде, узнающей тот же сайт, что и синтезирующаяся эидоиуклеаза. Плазмиды, несущие эндонуклеазу и метилтрансферазу, должны отличаться, во-первых, по генам резистентности к антибиотику, а во-вторых, участки начала репликации (сайты огг) у этих плазмид также должны быть разные.
Необходимость введения метилтрансферазы значительно сужает список штаммов, пригодных для получения продуцента никазы BspD6I. Клетки большинства современных штаммов Е. coli содержат систему ограничения метилированной ДНК (генотип гшт+ mcr4). Если в такие клетки попадает плазмида, содержащей ген метилтрансферазы (например, при трансформации), то она расщепляется соответствующими ферментами, поскольку ее ДНК содержит метилированные этой метилтрансферазой сайты. Если же ферменты ограничения метилированной ДНК не успеют расщепить плазмиду до того, как она сумеет пройти цикл репликации и начать экспрессию гена метилтрансферазы, то клетка может погибнуть. Для гибели клетки бывает достаточно одного двунитевого разрыва геномной ДНК, и если образовавшаяся метилтрансфераза прометилирует сайты геномной ДНК, это может спровоцировать гибель клетки от собственной системы ограничения метющрованной ДНК, поскольку рестрикции может подвергнуться геномная ДНК клетки.
Ранее при создании продуцента никазы на основе Е. coli нами были использованы две генетические конструкции [Перевязова и др., 2003]. Одна из них -pET28Nick - несла ген никазы, клонированный в экспрессиониый вектор рЕТ28Ь под промотор РНК-полимеразы фага Т7. Другая - pMSsc - представляла собой плазмиду pl5SK с геном адениновой метилтрансферазы M.SscIJ I под собственным промотором [Васильева и др., 2000]. Метилтрансфераза M.SscLlI, узнающая сайт GANTC, защищает ДНК от расщепления никазой [Перевязова и др., 2003]. Векторы рЕТ28Ь и p!5SK используют разные сайты on и разную резистентность к антибиотикам, поэтому они способны свободно сосуществовать в одной клетке.
Штамм Е. coli TOPI OF не содержит системы расщепления метилированной чужеродной ДНК (генотип mrr" тег"), поэтому в качестве продуцента в работе первоначально был использован именно этот штамм. Клетки, несущие две плазмиды - pMSsc и pET28Nick, — получили название TOPlO/MSsc/Nick. Однако выход белка после индукции этих клеток был очень низким: удалось обнаружить лишь следовые количества активности никазы в лизате. Было сделано предположение, что слабая экспрессия никазы в клетках Е. coli обусловлена высоким содержанием редких кодонов в гене никазы BspD6i.