Содержание к диссертации
Введение
1 Общая характеристика работы. 6
1.1 Актуальность проблемы 6
1.2 Цель и задачи исследования 7
1.3 Научная новизна результатов исследования 8
1.4 Практическая ценность 9
1.5 Апробация работы 9
1.6 Структура и объем работы 9
2. Обзор литературы 10
2.1 РНК интерференция 10
2.1.1 Современные представления о механизме РНК-интерференции 10
2.1.2 Малые и длинные некодирующие РНК 13
2.1.3 Биогенез малых РНК 18
2.1.4 Сборка комплекса РНК-сайленсинга 22
2.1.5 Расщепление мРНК-мишени и трансляционная репрессия 27
2.1.6 Регуляция РНК-интерференции 29
2.2. Биология ВИЧ-1 30
2.2.1 Строение ВИЧ-1 30
2.2.2 Жизненный цикл ВИЧ-1 32
2.3 Использование РНК интерференции в терапии СПИДа 40
2.3.1. Основные принципы разрабатываемой генотерапии с использованием
генетических конструкций, запускающих РНК-интерференцию 40
2.3.2 Поиск мишеней в геноме ВИЧ-1 для РНК интерференции 42
2.3.3 Доставка генетических конструкций в организм 43
2.3.4 Неспецифические эффекты терапии с использованием РНК-интерференции 46
3. Материалы и методы 48
3.1 Биологические материалы 48
3.1.1. Используемые векторы 48
3.1.2. Олигонуклеотиды 50
3.1.3. Культуры клеток 51
3.2. Создание генетических конструкций 52
3.2.1. Вставки для экспересии отдельных siPHK и вставки-домены 52
3.2.2. Кассетные вставки 52
3.2.3. Клонирование 55
3.3. Испытание созданных конструкций в невирусной системе 60
3.3.1. Очистка и нормализация препаратов плазмидной ДНК 60
3.3.2. Трансфекция 60
3.3.3. Измерение люминесценции люцифераз 3.4 Выделение тотальной РНК 63
3.5 Детекция siPHK методом защиты отРНКазы 63
3.4.1. Приготовление меченной РНК 64
3.4.3 Детекция siPHK 64
3.6 Детекция активации интерферон-зависимого ответа методом ОТ-ПЦР 65
3.6.1 Синтез кДНК 65
3.6.2 Праймер-специфичная амплификация 66
3.7. Испытание генетических конструкций в псевдолентивирусной системе 66
3.7.1. Получение рекомбинантных псевдолентивирусов и подавление их продукции интерферирующими РНК 66
3.7.2. Определение вирусного титра и эффективности ингибирования продукции лентивирусов с помощью анти-ВИЧ siRNA 67
4. Результаты и обсуждение 68
4.1 Выбор мишеней РНК-интерференции в геноме ВИЧ-1 68
4.2 Эффективность РНК-интерференции, вызываемой генетической конструкцией, зависит от силы промотора 71
4.3 Генетические конструкции, экспрессирующие удлинённые шпильки, запускают более эффективную РНК-интерференцию 74
4.4 Новый метод создания кассетных генетических конструкций с использованием олигонуклеотидов, не образующих шпильки 78
4.5 Испытание кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK, в невирусной системе 82
4.6 Испытание генетических конструкций, экспрессирующих siPHK, в псевдолентивирус-клеточной системе 88
4.6.1 Расположение и структура сайтов-мишеней для анти-ВИЧ siPHK в последовательностях транскриптов системы лентивирусной экспрессии in vitro 89
4.6.2 Подавление продукции псевдолентивирусов в клетках линии НЕК-293Т путем коэкспрессии siPHK, направленных против разных мишеней в лентивирусном геноме .90
4.7 Генетические конструкции, экспрессирующие siPHK, не вызывают активации
неспецифического интерферон-зависимого ответа 96
4.7.1 Анализ возможной активации интерферонового пути 97
4.7.2 Гены, использованные в детекции активации интерферонового пути 97
4.7.3 Вариабельность неспецифического интерферонового ответа 98
Выводы 100
Список литературы
- Научная новизна результатов исследования
- Малые и длинные некодирующие РНК
- Создание генетических конструкций
- Новый метод создания кассетных генетических конструкций с использованием олигонуклеотидов, не образующих шпильки
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является причиной неизлечимого и опасного заболевания (СПИДа), в настоящее время имеющего во многих странах мира статус эпидемии. На начало 2013 года по оценкам ВОЗ число инфицированных людей по всему миру превышало 35 миллионов человек и имеет многолетнюю устойчивую тенденцию к росту. Инфекция, вызываемая ВИЧ, неизлечима но, несмотря на это, в странах с доступом к современным лечениям пациенты имеют хорошее ожидание продолжительности и качества жизни. Ухудшающуюся эпидемиологическую ситуацию омрачают многократные безуспешные попытки создать вакцину от ВИЧ.
Для лечения СПИДа в мире зарегистрировано около пятидесяти антиретровирусных препаратов. По механизму действия и особенностям химического строения они разделяются на пять групп: нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеазы, ингибиторы слияния/проникновения, ингибиторы интегразы. На сегодняшний день наиболее эффективно лечение с использованием комбинации нескольких препаратов - высокоактивная антиретровирусная терапия (ВАРТ). ВАРТ позволяет остановить прогрессию ВИЧ инфекции, уменьшить смертность, увеличить продолжительность жизни больного. К сожалению, из-за зачастую высокой стоимости, большая часть пациентов из 35,3 миллионов по всему миру (2012 год) не имеют доступ к современной антиретровирусной терапии. Кроме того, из-за возникновения резистентности ВИЧ к антиретровирусному препарату и индивидуальной непереносимости приходится выбирать новую комбинацию препаратов, способную предотвратить размножение мутировавшего вируса. Распространение резистентных вариантов ВИЧ сужает арсенал эффективных препаратов и толкает на затратные поиски и изучение новых антиретровирусных препаратов, к которым чувствительны резистентные варианты.
Благодаря успехам в изучении механизмов регуляции экспрессии генов, достигнутых в последние пятнадцать лет, появилась возможность создания нового класса лекарственных средств против ВИЧ, использующих РНК-интерференцию. Феномен РНК-интерференции заключается в избирательном подавлении экспрессии гена с помощью коротких интерферирующих РНК (siPHK), которые комплементарны транскриптам гена-мишени (Fire, 1998; Elbashir et al., 2001). В сравнении с нокаутом, РНК-интерференция быстрый и более экономичный инструмент обратной генетики (reverse genetics), ускоривший функциональное изучение секвенированных геномов, позволяющий проводить полногеномные скрининги, анализ биохимических путей и отдельных генов (Cullen and Arndt, 2005; Aagard and Rossi, 2007). Показана принципиальная возможность использовать РНК-интерфернцию в лечении вирусных, онкологических и генетических заболеваний (Aagard and Rossi, 2007; Gavrilov and Saltzman, 2012). Препараты, использующие РНК-интерференцию, уже проходят клинические исследования. Обещающие результаты в лабораторных условиях показала индукция РНК-интерференции против смертельного вируса Эбола, для которого пока не существует специфического лечения (Geisbert et al., 2010).
РНК-интерференция в качестве лечения ВИЧ-инфекции имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционной терапией. При лечении с помощью РНК-интерференции можно использовать несколько siPHK, направленных против разных мишеней (Anderson et al., 2003). При использовании высоко консервативных мишеней это замедлит возникновение резистентных форм (ter Brake, 2006). При возникновении резистентных форм вируса, имеющих мутации в мишени, последовательность siPHK к этой мишени может быть с легкостью изменена, что восстановит эффективность специфической РНК-интерференции. В качестве мишени может быть использована и мРНК гена человека CCR5, белковый продукт которого важен в развитии ВИЧ-инфекции, и, насколько известно, не имеет какой либо значимой физиологической функции.
Цель и задачи исследования
Цель диссертации - выявить новые мишени в транскриптах ВИЧ-1 субтипа А, которые будут поражаться биологически активными siPHK, а также создать и испытать генетические конструкции, экспрессирующие одну или несколько siPHK, эффективно поражающие эти мишени в вирусных РНК и в мРНК гена CCR5.
Для достижения цели исследования необходимо было решить следующие задачи:
1. Выбрать критерии отбора и провести отбор мишеней siPHK в транскриптах вируса и в мРНК
гена CCR5.
-
Создать генетические конструкции, экспрессирующие одиночные siPHK, направленные на мишени в транскриптах вируса и в мРНК гена CCR5 человека.
-
Создать невирусную систему для количественной оценки эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями.
-
Разработать надежный метод создания кассетных генетических конструкций, которые одновременно экспрессируют три siPHK, атакующие мишени в геноме ВИЧ-1 и в мРНК гена-рецептора CCR5, необходимого для внедрения вируса в клетки хозяина.
-
Выяснить зависимость эффективности РНК-интерференции от силы используемого в конструкциях промотора и от длины шпильки РНК.
-
Провести испытание эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями, и молекулярный анализ РНК, доказывающий образование молекул siPHK при введении конструкций в клетки человека.
Научная новизна результатов исследования
Получены новые данные об искусственно вызываемой РНК-интерференции. Созданы генетические конструкции, кодирующие новые биологически активные siPHK, направленные на мишени в вирусе и в мРНК гена CCR5 человека. Для количественной оценки эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями, разработана и испытана невирусная система. В ходе исследования мы столкнулись с трудностями при создании кассетных генетических конструкций, содержащих несколько палиндромов и экспрессирующих несколько siPHK. Проблема связана с образованием нескольких стабильных шпилек в исходных олигонуклеотидах. Поэтому был предложен и апробирован новый удобный и быстрый метод для создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK. Обнаружено, что экспрессия созданных генетических конструкций приводит к эффективной атаке выбранных мишеней. При молекулярном анализе препаратов РНК обнаружены молекулы siPHK, имеющие длину в 21 нуклеотид. Ранее считалось, что даже небольшие количества двуспиральной РНК могут вызывать мощную РНК-интерференцию и что 27-нуклеотидные шпильки РНК усиливают РНК-интерференцию в десятки раз. Нами показано, что для эффективной РНК-интерференции в клетках человека необходимо достаточно большое количество экспрессируемой РНК, т.к. сила РНК-интерференции зависит от силы промотора, использованного при создании конструкции. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что 27-нуклеотидные шпильки РНК лишь ненамного усиливают РНК-интерференцию. Обнаружено, что созданные генетические конструкции, экспрессирующие 19-27-нуклеотидные шпильки РНК, не вызывают неспецифический интерферон-подобный ответ.
Практическая ценность
Генотерапия с помощью РНК-интерференции является одной из наиболее перспективных стратегий лечения вирусных инфекций и других заболеваний. В данной работе мы выявили новые эффективные мишени РНК-интерференции в ВИЧ-1, которые могут быть важны для разработки технологии генотерапии СПИДа. Результаты данной работы могут использоваться для разработки технологии генотерапии и других вирусных инфекций, а также для других ее задач. Метод быстрого создания кассетных генетических конструкций является универсальным и может использоваться как в фундаментальных исследованиях для создания составных генетических конструкций, так и для целей генотерапии с помощью РНК-интерференции, использующей наборы siPHK. Важными с практической точки зрения являются и полученные в данной работе результаты сравнения эффективности РНК-интерференции, которая запускается короткими и длинными шпильками РНК, а также вывод о важности выбора промотора при создании генетических конструкций.
Апробация работы
Данная работа апробирована на лабораторном семинаре в Лаборатории эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов ИМБ РАН им. В._А._Энгельгардта. Результаты работы были представлены: на 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010); на трёх итоговых конференциях приоритетного направления "Живые системы" ФЦП "Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса на 2007-2012 годы" (Москва 2007,2008).
Структура и объем работы
Научная новизна результатов исследования
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является причиной неизлечимого и опасного заболевания (СПИДа), в настоящее время имеющего во многих странах мира статус эпидемии. На начало 2013 года по оценкам ВОЗ число инфицированных людей по всему миру превышало 35 миллионов человек и имеет многолетнюю устойчивую тенденцию к росту. Инфекция, вызываемая ВИЧ неизлечима, но, несмотря на это, в странах с доступом к современным лечениям пациенты имеют хорошее ожидание продолжительности и качества жизни. Ухудшающуюся эпидемиологическую ситуацию омрачают многократные безуспешные попытки создать вакцину от ВИЧ.
Для лечения СПИДа в мире зарегистрировано около пятидесяти антиретровирусных препаратов. По механизму действия и особенностям химического строения они разделяются на пять групп: нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ингибиторы протеазы, ингибиторы слияния/проникновения, ингибиторы интегразы. На сегодняшний день наиболее эффективно лечение с использованием комбинации нескольких препаратов, - высокоактивная антиретровирусная терапия (ВАРТ). ВАРТ позволяет остановить прогрессию ВИЧ инфекции, уменьшить смертность, увеличить продолжительность жизни больного. К сожалению, из-за зачастую высокой стоимости, большая часть пациентов из 35,3 миллионов по всему миру (2012 год) не имеют доступ к современной антиретровирусной терапии. Кроме того, из-за возникновения резистентности ВИЧ к антиретровирусному препарату и индивидуальной непереносимости, приходится выбирать новую комбинацию препаратов, способную предотвратить размножение мутировавшего вируса. Распространение резистентных вариантов ВИЧ сужает арсенал эффективных препаратов, и толкает на затратные поиски и изучение новых антиретровирусных препаратов, к которым чувствительны резистентные варианты.
Благодаря успехам в изучении механизмов регуляции экспрессии генов, достигнутых в последние пятнадцать лет, появилась возможность создания нового класса лекарственных средств против ВИЧ, использующих РНК-интерференцию. Феномен РНК-интерференции заключается в избирательном подавлении экспрессии гена с помощью коротких интерферирующих РНК (siPHK), которые комплементарны транскриптам гена-мишени (Fire, 1998; Elbashir et al., 2001). В сравнении с нокаутом, РНК-интерференция быстрый и более экономичный инструмент обратной генетики (reverse genetics), ускоривший функциональное изучение секвенированных геномов, позволяющий проводить полногеномные скрининги, анализ биохимических путей и отдельных генов (Cullen and Arndt, 2005; Aagard and Rossi, 2007). Показана принципиальная возможность использовать РНК-интерфернцию в лечении вирусных, онкологических и генетических заболеваний (Aagard and Rossi, 2007; Gavrilov and Saltzman, 2012). Препараты, использующие РНК-интерференцию, уже проходят клинические исследования. Обещающие результаты в лабораторных условиях показана эффективность РНК-интерференции против смертельного вируса Эбола, для которого пока не существует специфического лечения (Geisbert et al., 2010).
РНК-интерференция в качестве лечения ВИЧ-инфекции имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционной терапией. При лечении с помощью РНК-интерференции можно использовать несколько siPHK, направленных против разных мишеней (Anderson et al., 2003). При использовании высоко консервативных мишеней это замедлит возникновение резистентных форм (ter Brake, 2006). При возникновении резистентных форм вируса, имеющих мутации в мишени, последовательность siPHK к этой мишени может быть с лёгкостью изменена, что восстановит эффективность специфической РНК-интерференции. В качестве мишени может быть использована и мРНК гена человека CCR5, белковый продукт которого важен в развитии ВИЧ-инфекции, и, насколько известно, не имеет какой либо значимой физиологической функции.
Цель диссертации - выявить новые мишени в транскриптах ВИЧ-1 субтипа А, которые будут поражаться биологически активными siPHK, а также создать и испытать генетические конструкции, экспрессирующие одну или несколько siPHK, эффективно поражающие эти мишени в вирусных РНК и в мРНК гена CCR5.
Получены новые данные изучения искусственно вызываемой РНК-интерференции. Созданы генетические конструкции, кодирующие новые биологически активные siPHK, направленные на мишени в вирусе и в мРНК гена CCR5 человека. Для количественной оценки эффективности РНК-интерференции, запускаемой генетическими конструкциями, была разработана и испытана невирусная система. В ходе исследования мы столкнулись с трудностями при создании кассетных генетических конструкций, содержащих несколько палиндромов и экспрессирующих несколько siPHK. Проблема связана с образованием нескольких стабильных шпилек в исходных олигонуклеотидах. Поэтому был предложен и апробирован новый удобный и быстрый метод для создания кассетных генетических конструкций, экспрессирующих несколько siPHK. Обнаружено, что экспрессия созданных генетических конструкций приводит к эффективной атаке выбранных мишеней. При молекулярном анализе препаратов РНК обнаружены молекулы siPHK, имеющие длину в 21 нуклеотид. Ранее считалось, что даже небольшие количества двуспиральной РНК могут вызывать мощную РНК-интерференцию и что 27-нуклеотидные шпильки РНК усиливают РНК-интерференцию в десятки раз. Нам удалось показать, что для эффективной РНК-интерференции в клетках человека необходимо достаточно большое количество экспрессируемой РНК, т.к. сила РНК-интерференции зависит от силы промотора, использованного при создании конструкции. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что 27-нуклеотидные шпильки РНК лишь ненамного усиливают РНК-интерференцию. Обнаружено, что созданные генетические конструкции, экспрессирующие 19-27-нуклеотидные шпильки РНК, не вызывают неспецифический интерферон-подобный ответ.
Малые и длинные некодирующие РНК
Поиск мишеней для РНК интерференции должен учитывать несколько факторов. Во-первых, последовательность мишени должна быть консервативна, поскольку даже одиночные замены в последовательности мишени могу значительно снижать эффективность ее подавления. Так, при генотерапии вируса, если мишени недостаточно консервативны, любая мутация позволяет вирусу ускользнуть от РНК интерференции (Das et al, 2004). Подбор последовательности для сайленсинга, как правило, осуществляется компьютерными методами, на основе содержащихся в базе секвенированных последовательностей, которые также могут содержать ошибки. Несоответствие предсказанных мишеней и физически взаимодействующих с эффекторным комплексом мишеней (Gottwein et al., 2011), указывает на недостаточную разработанность алгоритмов предсказания мишеней и необходимости учёта доступности мишени для комплексов РНК-сайленсинга (Das, 2004). Также, при выборе мишени необходимо учитывать возможность возникновения неспецифических эффектов, таких как offarget эффект и интерферон-зависимый ответ. Подробнее этот вопрос будет рассмотрен ниже, в пункте 2.4.4 литобзора.
Кроме того, выбор мишеней для РНК интерференции в первую очередь должен базироваться на термодинамических свойствах последовательности РНК. Так последовательность РНК мишени должна содержать от 30 до 50% GC пар, область мишени с 15 по 19 нуклеотиды должна содержать более трех оснований AU. Также, последовательность не должна образовывать вторичные структуры, а направленная против мишени siPHK должна быть стабильна, и иметь температуру плавления ниже 20С. Эти ограничения связаны с особенностями работы комплексов РНК интерференции (Reynolds et al., 2004)
При подборе мишеней также необходимо учитывать вторичные структуры, которые может образовывать РНК-молекула, поскольку любые вторичные структуры могут значительно понизить эффективность сайленсинга (Shao et al, 1999; Bohula et al., 2003; Kretschmer-Kazemi and Sczakiel, 2003).
Помимо мишеней непосредственно в геноме вируса, генотерапия может быть направлена на рецепторы клеточных мембран, которые взаимодействуют с вирусом и облегчают его проникновение в клетку. Так было обнаружено, что ВИЧ-1 связывается с рецепторным белком CCR5 на поверхности лимфоцитов (Wilkinson, 1997). При этом, люди, несущие мутацию по гену CCR5, не восприимчивы к вирусу. Таким образом, если с помощью генотерапии значительно снизить транскрипцию гена CCR5, то можно добиться снижения концентрации вируса в клетке и облегчения симптомов заболевания (Anderson and Akkina, 2007)
Ключевой проблемой в осуществлении терапии посредством РНК-интерференции является разработка безопасных и эффективных методов доставки. Для доставки экспрессирующих конструкций в клетку могут использоваться различные материалы, такие как полимеры (Singha et al., 2011), липиды (Akinc et al., 2008), пептиды, антитела и аптамеры (Alexis et al., 2008).
Для того чтобы активировать механизм РНК интерференции, генетические конструкции должны проникнуть внутрь клетки. Кроме того, также необходимо чтобы синтезируемые РНК распознавались белковыми комплексами РНК-интерференции. Поскольку ДНК-конструкции гидрофильны, они не могут сами по себе преодолеть клеточную мембрану, требуются специальные модификации или материалы, которые помогут препарату попасть в цитоплазму. Кроме того, в организме содержится большое количество ДНКаз, которые могут расщеплять конструкции. Итак, эффективная система доставки должна: 1) Защищать препарат от ферментов сыворотки крови (РНКаз, в случае прямой доставки синтетических siPHK, и ДНКаз в случае доставки экспрессирующих siPHK конструкций); 2) Минимизировать вероятность развития иммунного ответа; 3) Избегать неспецифического взаимодействия с белками сыворотки, а также проникновения в иной тип клеток, отличный от того, для которого эта терапия была разработана;
4) Препятствовать быстрому выведению препарата посредством почечной фильтрации;
Для преодоления деградации нуклеазами, а также для предотвращения неспецифического иммунного ответа используют такие химические модификации, как добавление 2 -0-метил или 2 -фтор групп, "закрытые" или "открытые" нуклеиновые кислоты, замещение кислорода в фосфатных мостиках на серу с образованием фосфотиоатной связи. Кроме химических модификаций, также разработаны методы доставки, которые защищают экспрессирующие конструкции от деградации или распознавания иммунной системой за счет заключения их внутрь наночастиц (Wang et al., 2012). Далее мы рассмотрим особенности систем доставки посредством наночастиц.
Взаимодействия с компонентами сыворотки может помешать доставке различными способами. Так, например, наночастицы, несущие на своей поверхности положительный заряд могут образовывать агрегаты с эритроцитами (Malek et al., 2009). С другой стороны, взаимодействие с определенными белками может обеспечивать направленную доставку в определенный тип клеток. Так, например, многие липосомные системы доставки, в которых препараты конструкций коньюгированы с липофильными молекулами, могут взаимодействовать с липопротеинами сыворотки, и обеспечивать доставку в гепатоциты (Wolfrum et al., 2007). В другом случае, белок опсонин в сыворотке крови может адсорбироваться на поверхности наночастиц и помечать их для атаки фагоцитарной системы крови. Стоит отметить, что именно действие фагоцитарной системы является основным препятствием для доставки препаратов в клетки-мишени (Romberg et al., 2008; Akinc et al., 2008). Наиболее распространенный способ предотвратить взаимодействие с белками крови предполагает покрытие поверхности наночастиц гидрофильными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (Bazile et al., 1995).
Для избегания раннего выведения препарата через почки, используют увеличение размера гранул, поскольку только молекулы размером меньше 8 нм могут подвергаться фильтрации в почечных канальцах. Молекулы размером больше 8нм, продолжают циркулировать в крови, поэтому многие системы доставки используют наночастицы более 20 нм (Jarad and Miner, 2009). Кроме того, наночастицы также могут разрушаться в почечных канальцах. Так наночастицы, формируемые за счет электростатических взаимодействий, могут контактировать с негативно-заряженными протеогликанами в мембране гломерулярных клеток. В результате частицы разрушаются, а их содержимое выводится из организма (Zuckerman et al., 2012; Naeye et al., 2013).
Создание генетических конструкций
Методика заключается в последовательном измерении "тлеющей" хемилюминесценции двух разных люцифераз: люциферазы светлячка (Firefly luciferase) и люциферазы коралла (Renilla luciferase). Оба фермента экспрессируются вектором psiCHECK-2, один из которых - люцифераза Renilla, - транскрибируется со вставкой-мишенью. Присутствие siPHK комплементарных мишени приводит к снижению экспрессии гена и соответственно к снижению активности люциферазы, при этом уменьшение люминесценции пропорционально уровню РНК интерференции. Ген другой люциферазы (Firefly luciferase) играет роль внутреннего контроля. Использование внутреннего контроля позволяет нормализовать вариации в экспериментальной системе: инструментальные ошибки автоматических пипеток, гибель клеток, торможение роста и различия стартовой численности в культуре. Для регистрации активности люциферазы Firefly в методике, производится добавление субстрата, специфичного для данной люциферазы. После запуска реакции и измерения активности люциферазы светлячка, эта реакция "гасится" добавлением реактива с субстратом для второй люциферазы Renilla. После трансфекции и инкубации клеток НЕК293 в 96-луночном планшете, среду удаляли и инкубировали планшет со 100 мкл смеси трипсина-версена (0,25% трипсина и версена в соотношении 1:1) при 37С. После перевода клеток в суспензию добавляли ещё по 100 мкл полной среды и, после тщательного перемешивания, содержимое лунок переносили в 0,5-мл микроцентрифужные пробирки. Пробирки центрифугировались 5 минут при 270xg (2000 rpm., MiniSpin, Eppendorf, Германия, ротор F45-12-11), после чего супернатант удаляли водоструйным насосом. К оставшемуся осадку добавляли по 70 мкл lxPBS (1.37М NaCl; 26.8 mM КС1; 43тМ NaH2P04; 14.7тМ КН2Р04; рН 7,4 при 25С) и растворяли осадок на Вортексе. Далее, для измерения люминесценции использовались реактивы из набора Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, США), приготовленные в соответствии с инструкцией производителя. Измерение люминисценции проводилось в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя набора на люминометре Veritas Microplate Luminometer (Turner BioSystems, США) с оригинальным программным обеспечением. Анализ данных проводился в программном пакете OriginPro 7.5 SR6 (OriginPro Corp., США). Относительную люминесценцию рассчитывали по следующей формуле: где Отн. люм. эксперим. - относительная люминесценция в лунке с изучаемой генетической конструкцией, вызывающей РНК интерференцию; Отн. люм. контр. -относительная люминеценция в контрольных пробах. Лунки с контрольными пробами содержат клетки, трансфецированные плазмидой, экспрессирующей siPHK не комплиментарные котранфецированной репортерной плазмиде. Использование экспрессирующей siPHK плазмиды вместо той же кольцевой плазмиды без вставки позволяет исключить неспецифические эффекты не связанные с РНК интерференцией. 3.4 Выделение тотальной РНК.
Выделение тотальной РНК проводили из культуры НЕК293Т, трансфецированной экспрессирующей плазмидой pGeneClip, содержащей кассетную конструкцию (см. 3.3.2). Полученную тотальную РНК использовали для детекции siPHK, экспрессирующеися генетической конструкции (см. п. 3.5), и для анализа возможной активации интерферон-зависимых генов (см. п. 3.6).
Для выделения РНК брали около 5х 106 клеток. Клетки НЕК293Т обрабатывали раствором трипсина с EDTA, инкубировали 5 минут в С02-инкубаторе и переносили в 1,5-мл микроцентрифужные пробирки. После центрифугирования при 200xg в течение 5 мин. (1700 rpm, Minispin, Eppendorf) супернатант удаляли и в пробирки добавляли по 0.3 мл реагента TRIzol (Ambion). Клетки тщательно гомогенизировали с помощью инсулинового шприца. Затем к полученой смеси добавляли по 60 мкл хлороформа, перемешивали и инкубировали 10 мин. на ротаторе. Водную фазу с РНК отделяли центрифугированием 12000xg при 4С в течение 15 минут (11400 rpm, Eppendorf 5415 R . К водной фазе (130 мкл) добавляли 185 мкл изопропонола, перемешивали на Вортексе и затем на ротаторе в течение 10 мин. РНК осаждали центрифугированием (12000xg, 10 мин, + 2С). Полученный осадок отмывали 3 раза этанолом, сушили на воздухе 5 минут и суспендировали в 25 мкл воды.
Для подтверждения экспрессии siPHK, кодируемых созданными нами кассетными конструкциями был проведён анализ тотальной клеточной РНК (см. 3.4) методом защиты от РНКазы (RNAse protection assay). В исследовании использовался набор реактивов mirVana miRNA Detection Kit (Ambion, Life technologies, США). 3.4.1. Приготовление меченной РНК
Меченую РНК, комплементарную ожидаемым siPHK получали in vitro транскрипцией последовательности кассетной вставки в плазмиде pGEM-І или pGEM-2 (Promega) с помощью РНК полимеразы Т7. Мечение проводилось радиоактивным рибоуридинтрифосфатом (1,11 МБк, [a-32P]rUTP, 6000 Ci/mmmol, ИМБ). В 20 мкл реакционной смеси находилось 1 мкг матричной ДНК, 40 мМ Tris»HCl (рН 7,5), 6 мМ MgCl2, 2 мМ спермидина, 10 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 1 ед/мкл RNAsin (Promega), 10 ед Т7 РНК полимеразы (Fermentas), по 500 мкМ гАТР, rGTP, гСТР, 0,75 мкМ [a-32P]rUTP. Смесь инкубировали 2 часа при 37С. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 0,1 М EDTA. РНК осаждали этанолом, центрифугировали и суспендировали в воде.
Для получения строго гомогенного по длине препарата меченной РНК ее фракционировали в 12% ПААГ. После электрофореза и короткой экспозиции геля в темноте на рентгеновской пленке определяли полосу РНК для вырезания и элюции с помощью набора реактивов mirVana miRNA Detection Kit (Ambion, Life technologies, США). После осаждения, РНК растворяли и использовали для гибридизации с образцами тотальной РНК, содержащими молекулы siPHK.
Около 2-5 мкг тотальной РНК (см. 3.4) смешивали с 50000 срт меченной РНК в 20 мкл гибридизационного буфера (mirVana miRNA detection kit, Ambion, Life technologies, США). Отрицательные контроли "зонд без пробы" и "зонд без пробы и без РНКазы" вместо раствора тотальной РНК содержали эквивалентное количество дрожжевой РНК (из набора). После предварительного прогрева при 100С в течение 3 мин, смесь инкубировали 16 ч при 42С в термостате.
После гибридизации РНК переваривали смесью нуклеаз для расщепления незащищенных дукплексами РНК-РНК одноцепочечных участков. Раствор RNAse А/ТІ (mirVana miRNA detection kit, Ambion, Life technologies, США) смешивали с буфером для нуклеаз из набора в оптимальном соотношении 1:100, определённом в предварительных экспериментах. Обработку РНКазами проводили 40 минут при 37С, после чего добавляли по 225 мкл инактивирующего раствора из набора для остановки реакции. Защищенную РНК осаждали этанолом. После префореза ПААГ (12%, 5М мочевина), препараты РНК наносились на гель и фракционировали с РНК маркером. Молекулярный маркер представляет собой продукт мягкого щелочного гидролиза двух РНК (25 н. и 14 н.), синтезированной in vitro T7 полимеразой с плазмиды pGEM-1 (Promega), обработанной Smal или EcoRI (Fermentas), в присутствии радиоактивно меченного АТР. Деградация транскриптов проводилась в присутствии 80 мМ NaHCCb и 160 мМ МагСОз в течение 40 минут при 60С.
После электрофореза (12 ч, 1800 В в приборе Macrophor, LKB ghb 55 С) гель отмывали в 10% уксусной кислоте, сушили и экспонировали на рентгеновской фотоплёнке (Retina) или на экранах фосфоимеджера (Cyclone, Packard Instruments Company, Япония).
Новый метод создания кассетных генетических конструкций с использованием олигонуклеотидов, не образующих шпильки
Для того чтобы экспериментально проверить, как выбор промотора влияет на эффективность РНК-интерференции в клетках человека, мы использовали две разные шпильки ДНК, транскрибируемые с трех разных промоторов. Эти шпильки ДНК кодируют биологически активные siPHK и соответствуют двум мишеням РНК-интерференции в транскриптах HTV-1 (генетические конструкции anti-HIV-1-27 и anti-GAG-1). Данные шпильки клонировали в трех векторах - psiSTRIKE ("Promega"), pEGFP-Nl("Clontech") и pGeneClip ("Promega"). Первый вектор экспрессирует шпильки РНК с помощью промотора U6 РНК-полимеразы III, а два других содержат промоторы CMV и U1, транскрибируемые с помощью РНК-полимеразы П. Промотор U1 связан с синтезом малых ядерных РНК человека (Hernandez, 2002). Правильность шести созданных генетических конструкций (Рис. 8) подтверждена секвенированием. anti-GAG-1
Количественный анализ эффективности РНК-интерференции, запускаемой данными шестью конструкциями, мы проводили с использованием так называемой невирусной системы. Эта система использует котрансфекцию и включает в себя две плазмиды. Одна из них экспрессирует siPHK под одним из трех промоторов. Шесть таких плазмид схематически показаны на Рис. 8. Для экспрессии двух мишеней РНК-интерференции, соответствующих этим siPHK, мы выбрали вектор psiCHECK-2 ("Promega"), содерщий два гена люциферазы - из светлячка (Photinus pyralis) и из коралла (Renilla reniformis). В З -некодирующую область гена Renilla мы вставляли небольшие фрагменты генома вируса, которые соответствуют мишеням РНК-интерференции. Деградация таких рекомбинантных мРНК гена Renilla при РНК-интерференции нарушает его экспрессию. При котрансфекции плазмиды psiCHECK-2 и плазмиды, экспрессирующей siPHK, наблюдается снижение экспрессии гена Renilla, тогда как экспрессия гена светлячка не изменяется и служит контролем (Рис. 8). Чем большее снижение экспрессии гена Renilla наблюдается в этой системе, тем эффективнее РНК-интерференция, запускаемая конструкцией, экспрессирующей шпильки РНК под разными промоторами. Получены две плазмиды, кодирующие мишени РНК-интерференции в составе вектора psiCHECK-2, их соответствие siPHK anti-HIV-1-27 и anti-GAG-1 подтверждено секвенированием (области RT и GAG на Рис. 8).
На Рис. 9а представлены результаты анализа эффективности siPHK anti-HIV-1-27, экспрессируемой тремя конструкциями с трех разных промоторов - CMV, U1 и U6. Видно, что в наших опытах эффективность РНК-интерференции зависит от того, с какого промотора считывается данная siPHK. Наибольшая активность обнаружена при транскрипции с промотора U6, меньшую активность обеспечивал промотор CMV и самую слабую - Ul (U6 CMV U1), несмотря на то, что этот вектор содержит энхансер. Аналогичные результаты получены и при анализе эффективности РНК-интерференции, наблюдаемой при экспрессии siPHK anti-GAG-1 тремя конструкциями, имеющими три разных промотора (Рис. 96). Эта siPHK имеет большую биологическую активность, чем siPHK anti-HIV-1-27 (см. Рис. 9), однако промотор U6 и в этом случае обеспечивает большую эффективность РНК-интерференции. Аналогичные данные по подавлению продукции вируса этими конструкциями получены и в вирусной системе при трансфекции лимфоидных клеток МТ-4 (данные не представлены).
В наших генетических конструкциях основными элементами, обеспечивающими активность транскрипции, служат промоторы, а также энхансер в конструкции, содержащей промотор U1. Поэтому мы считаем, что полученные данные убедительно свидетельствуют о том, что в клетках человека активно работающие промоторы обеспечивают более мощную РНК-интерференцию. По всей видимости, более активная транскрипция приводит к наработке больших количеств siPHK. Ранее показали, что выбор промотора важен для эффективности РНК-интерференции, и даже разные варианты промотора РНК-полимеразы III могут существенно влиять на эффективность РНК-интерференции (Boden et al., 2003). Наши данные свидетельствуют о том, что вектор si STRIKE, содержащий промотор U6, более предпочтителен для эффективной искусственной РНК-интерференции в клетках данного типа, чем векторы, содержащие промоторы CMV и U1. В генной терапии выбор промотора имеет большое значение для надежной экспрессии siPHK генетическими конструкциями еще и потому, что этот выбор одновременно означает и выбор того или иного механизма регуляции экспрессии. Известно, что разные промоторы связаны с разными механизмами регуляции транскрипции, и активность одного и того же промотора в клетках разного типа значительно отличается. Например, в клетках, активно продуцирующих р53, репрессируется транскрипция, направляемая РНК-полимеразой III (Cairns and White, 1998). следовательно в таких клетках может оказаться использовать экспрессию под контролем промотора U6 не целесообразно, из-за снижения транскрипции с участием РНК-полимеразы III. Более того, даже присутствие больших количеств смысловых и антисмысловых транскриптов в одних и тех же тканях и органах не всегда приводит к запуску РНК-интерференции (Чуриков и Кретова, 2003; Tchurikov and Kretova, 2007).
Несмотря на низкую эффективность запускаемой РНК-интреференции, генетические конструкции, экспрессирующие siPHK под контролем промоторов CMV и U1, могут быть также полезными. В данной работе все остальные эксперименты проведены с использованием генетических конструкций на основе psi STRIKE, экспрессирующих siPHK под контролем промотора U6 или двух промоторов - U1 и U6.
