Введение к работе
Актуальность проблемы. Злокачественное перерождение клеток, обусловленное структурно-функциональными нарушениями различных генов, в первую очередь активацией протоонкогенов, лежит в основе развития онкологических заболеваний. Особое место среди злокачественных заболеваний человека и животных занимают лейкозы. В случае острых миелоидных лейкозов человека (ОМЛ) с высокой частотой выявляются мутации генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток крови. В злокачественных клетках больных ОМЛ с высокой частотой выявляют транслокацию между 8 и 21-ой хромосомами, приводящую к образованию химерного гена AML1-ET0, кодирующего слитный онкобелок AML1-ET0. Мутации гена c-kit у пациентов с ОМЛ встречаются значительно реже, однако гиперэкспрессия гена c-kit, кодирующего, рецепторную тирозин киназу KIT наблюдается более чем у 80% пациентов с ОМЛ. Активация этих онкогенов приводит к усилению пролиферативных свойств клеток и их выживаемости, что может лежать в основе злокачественного перерождения гемопоэтических клеток-предшественников, приводящего к развитию ОМЛ.
Три способа, применяемые в настоящее время для лечения лейкозов (пересадка костного мозга, химиотерапия, лучевая терапия), создают дополнительную опасность для жизни пациентов и являются малоэффективными в большинстве случаев. В связи с этим исследуются и разрабатываются новые возможные терапевтические подходы. Считается, что методы, основанные на принципе РНК-интерференции, могут быть эффективными для борьбы с онкологическими заболеваниями и лейкозами в частности.
В настоящее время механизм РНК-интерференции широко используется для подавления экспрессии генов на посттранскрипционном уровне с целью исследования функциональных свойств генов. Уже получены существенные результаты, представляющие интерес для фундаментальной биологии и
медицины. Во многих лабораториях мира ведутся биомедицинские исследования, нацеленные на изучение способов модуляции экспрессии генов, активация которых может приводить к развитию онкологических заболеваний. В ряде работ была показана принципиальная возможность использования синтетических siPHK для подавления экспрессии самых разных генов-мишеней, в том числе и активированных онкогенов.
Основными ограничениями для широкого применения ситетических siPHK, состоящих из природных нуклеотидов, остаются прежде всего недостаточная стабильность в условиях in vitro и in vivo, а также низкая эффективность их доставки в клетки мишени.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка подхода для эффективного подавления экспрессии активированных «лейкозных» онкогенов АМЫ-ЕТО, RUNX1(K83N) и С-ЩШ22К) на посттранскрипционном уровне с помощью РНК-интерференции. В задачи работы входило:
-
Создание модельной линии клеток, геном которых содержит «лейкозный» активированный онкоген АМЫ-ЕТО, RUNX1 или c-kit, с точечными мутациями;
-
Дизайн и оценка эффективности действия синтетических модифицированных олигонуклеотидных siPHK (РНК-дуплексов), предназначенных для подавления активности «лейкозных» онкогенов;
-
Получение лентивирусных векторных частиц (рекомбинантных лентивирусов), несущих в своем геноме последовательность, кодирующую shPHK (предшественник siPHK) и оценка эффективности их действия на модельных линиях клеток;
-
Оценка эффективности действия shPHK, направленных против АМЫ-ЕТО, на линии клеток от пациента с острым миелоидным лейкозом.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящий момент основным препятствием для использования интерферирующих РНК в терапевтических целях является несовершенство методов их доставки в клетки-мишени, их нестабильность, а также возможные неспецифические реакции ответа организма на введение чужеродных двуцепочечных последовательностей РНК. Для решения проблемы стабильности в данной работе были использованы оригинальные синтетические siPHK со специфическими химическими модификациями, которые делают их более устойчивыми по сравнению с немодифицированными siPHK.
Для обеспечения стабильного синтеза интерферирующих РНК в клетках-мишенях нами были использованы рекомбинантные ретро- и лентивирусные векторы, направляющие в трансдуцированных клетках синтез шпилечных РНК (shPHK), являющихся предшественницами малых интерферирующих РНК. В данной работе было впервые показано, что шпилечные конструкции, экспрессия которых направляется рекомбинантными лентивирусными векторами, могут быть успешно применены для подавления экспрессии активированных онкогенов AMLl-ETO(t8:21) и c-kit, выявляемых при острых миелоидных лейкозах. Показано, что используемые нами интерферирующие РНК, направленные против AML1-ETO, специфичны исключительно в отношении этого онкогена и никак не влияют на экспрессию эндогенного AML1. Кроме всего, важным этапом работы стало создание перевиваемых модельных клеточных линий, экспрессирующих активированные онкогены AMLI-ETO, RUNX1(K83N) или c-kit(N822K), которые могут быть использованы как для изучения функций этих онкогенов, так и для исследования эффективности потенциальных терапевтических препаратов, направленных на борьбу с лейкозом. Основой для этого стали оригинальные ретровирусные векторы, несущие экспрессирующую кассету: промотор - целевой ген ("лейкозный" онкоген) - IRES - маркерный ген (eGFP), позволяющие осуществлять эффективный перенос и экспрессию целевого и маркерного гена в клетках-мишенях.
Апробация работы. В ходе выполнения работы ее результаты обсуждались на лабораторных семинарах Лаборатории биологии клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Результаты работы были доложены на международных конференциях: Mechanisms of early differentiation: embryogenesis, myogenesis (cardiac differentiation) and hematopoiesisAymphopoiesis, Barsinghausen, Germany, September 1-5,2008; XVIII Wilsede Meeting, Modern trends in human leukemia and cancer, Wilsede, Germany, June 19-23, 2010; Пленарные лекция на конференции по молекулярной онкологии "Петровские чтения", Россия, Санкт-Петербург, 16 апреля 2010; Российско-французский семинар "Молекулярная биология клеток млекопитающих", Россия, Москва, 5-7 июля 2010.
По материалам диссертационной работы опубликовано 6 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных профильных журналах, а также тезисы 4 докладов на международных конференциях и съездах.
Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Работа изложена на 155 страницах машинописного текста и содержит 46 иллюстраций (фотографии, рисунки, таблицы и диаграммы). Библиография включает 243 наименования.
