Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Биоматериаловедение - междисциплинарный подход к изучению полимеров 10
1.2. Полимеры медико-биологического назначения 12
1.3. Тканевая инженерия 15
1.3.1 Принципы и методы тканевой инженерии 15
1.3.2 Основные требования, предъявляемые к полимерам в тканевой инженерии 17
1.3.3 Синтетические биодеградируемые полимеры 19
1.4. Строение кожи и способы лечения повреждений кожного покрова 24
1.4.1 Строение кожного покрова 24
1.4.2 Строение коллагена и его свойства 28
1.4.3 Подготовка клеточного продукта для трансплантаций 31
1.4.4 Формирование полимерных матриц для культивирования, клеток 35
1.5 Взаимодействие клеток с полимерной поверхностью скаффолда...39
1.6 Модификация полимерного субстрата 41
1.6.1 Физические способы модификации 41
1.6.2 Химические способы модификации полимерной поверхности 44
Глава 2. Объекты и методы исследования 48
2.1. Приготовление материалов и реагентов 48
2.1.1 Синтез поли(0,Ь-лактида) 48
2.1.2 Формирование плёнок методом отлива из раствора 48
2.1.3 Получение тонких полимерных плёнок 49
2.1.4 Гидрофобизация покровных стёкол 49
2.1.5 Получение пористых плёнок из смеси полилактида (ПЛ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) 50
2.1.6 Получение коллагена 51
2.2. Модификация поверхности полилактидных пленок 52
2.2.1 Нанесение коллагена на полимерный субстрат 52
2.2.2 Аминолиз полилактидных плёнок 53
2.3. Методы исследования поверхности 54
2.3.1 Измерение гидрофильно-гидрофобных характеристик поверхности полимерной плёнки методом пластинок Вильгельми 54
2.3.2 Оценка количества растворённого ПЭГ по потере массы...55
2.3.3 Определение концентрации полиэтиленгликоля в водных растворах 56
2.3.4 Определение оксипролина в коллагене 56
2.3.5 Определение концентрации коллагена 57
2.3.6 Выявление структуры коллагена 58
2.3.7 Нингидриновый метод анализа 58
2.3.8 Ядерный магнитный резонанс 58
2.3.9 Сканирующая электронная микроскопия 59
2.4. Выделение клеток кожи и анализ их поведения на исследуемых субстратах 59
2.4.1 Выделение и культивирование первичных фибробластов. 59
2.4.2 Выделение и культивирование первичных кератиноцитов...59
2.4.3. Оценка состояния клеток на полимерных плёнках 60
2.4.4 Адгезия фибробластов 61
2.4.5 Анализ структуры актинового цитоскелета 61
Глава 3. Результаты 62
3.1. Синтез поли(Б,Ь-лактида) 62
3.2. Получение полимерных плёнок из полилактида разными способами 63
3.2.1 Плёнки, полученные методом полива из раствора 63
3.2.2 Полимерные плёнки, полученные на покровном стекле 64
3.3. Влияние условий получения полимерных плёнок на взаимодействие фибробластов с полимерной поверхностью полилактидной плёнки 67
3.4. Исследование деградации полилактидных матриц in vitro 76
3.5. Исследование деградации полилактидных плёнок in vivo 79
3.6. Модификация полилактидных плёнок 82
3.6.1 Нанесение коллагена на поверхность полилактидных плёнок 82
3.6.2 Влияние покрытия полимерных пленок коллагеном на поведение культивируемых кератиноцитов 91
3.7. Формирование пористых плёнок на основе смеси полилактида и полиэтиленгликоля 104
3.7.1 Исследование скорости растворения ПЭГ 105
3.7.2 Культивирование кератиноцитов на плёнках на основе смеси ПЛ и ПЭГ 111
3.7.3 Модификация коллагеном пористых плёнок и культивирование на них кератиноцитов 115
3.8. Модификация полилактидных плёнок раствором лизина 121
Глава 4. Обсуждение результатов 127
Выводы 141
Список сокращений 142
Список литературы 143
- Основные требования, предъявляемые к полимерам в тканевой инженерии
- Получение пористых плёнок из смеси полилактида (ПЛ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ)
- Выделение клеток кожи и анализ их поведения на исследуемых субстратах
- Влияние условий получения полимерных плёнок на взаимодействие фибробластов с полимерной поверхностью полилактидной плёнки
Введение к работе
Разработка технологий лечения повреждённых органов и тканей методами заместительной клеточной терапии является перспективным направлением современной регенеративной медицины. В основе этого метода лечения лежит введение в организм пациента стволовых или дифференцированных клеток, которые замещают утраченные. Для этой цели используют культивируемые клетки, которые выделяют из костного мозга и тканей самого пациента или здоровых доноров.
Актуальность работы. Восстановление целостности повреждённой
ткани требует создания нормального микроокружения для
трансплантируемых клеток, способствующего их размножению, дифференцировке и созданию нормальных структур тканей. В организме создание такого микроокружения обеспечивают белки внеклеточного матрикса. Эти белки и в частности коллаген, используют, поэтому, при культивировании клеток и при создании клеточных композиций для дальнейшей трансплантации в поврежденные ткани пациента. При переносе клеток из культуральных сосудов в раны возникают, однако, проблемы сохранения их пространственной организации и функциональных свойств. Они связаны, прежде всего, с недостаточной механической прочностью клеточных ассоциаций и с неизбежным повреждением клеток в результате ферментативной обработки при отделении клеточных пластов от поверхности сосудов, в которых их культивируют.
Размножение и рост клеток на полимерных матрицах, обладающих достаточной механической прочностью и имеющих определённую пространственную архитектуру, может способствовать формированию структурной основы дифференцирующихся тканей. Поэтому в последнее время приходят к заключению о том, что при создании клеточных продуктов
и их трансплантации, необходимо использовать полимеры, для обеспечения сохранения исходного состояния межклеточных контактов и поверхностных рецепторов клеток. В зависимости от практических задач к таким полимерам предъявляется ряд требований, в том числе, биосовместимость и способность рассасываться в процессе восстановлении структуры ткани. Таким образом, в настоящее время сформировалась новая междисциплинарная область науки - тканевая инженерия, которая включает в себя принципы и методы инженерии, химии, физики и клеточной биологии. В основе тканевой инженерии лежит культивирование клеток на искусственных полимерных матрицах.
Одним из приоритетных направлений тканевой инженерии является восстановление структурной целостности повреждённых кожных покровов, возникающих в результате ожогов, трофических язв и другого рода повреждений. Культивирование кератиноцитов на полимерных матрицах и последующая трансплантация сформировавшегося клеточного пласта вместе с такой матрицей в организм позволяет исключить процедуру обработки клеток протеолитическими ферментами. Перенесённая в организм биодеградируемая полимерная матрица со временем рассасывается, а клетки способствуют восстановлению кожных покровов.
Целью диссертационной работы является изучение возможности формирования биодеградируемых полимерных плёнок из поли (D,L-лактида), предназначенных для культивирования и трансплантации эпителиальных клеток кожи.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Отработать условия синтеза поли(0,Ь-лактида) как основного полимера для формирования плёнок.
Отработать методику формирования полимерных плёнок различной толщины.
Сформировать полилактидные плёнки с нанесённым на их поверхность коллагеном в разных формах (молекулярной и фибриллярной).
Приготовить плёнки на основе смеси поли(0,Ь-лактида) и полиэтиленгликоля.
Модифицировать полилактидные плёнки для повышения основности и гидрофильности их поверхностей.
Исследовать адгезию и пролиферацию фибробластов и кератиноцитов на модифицированных плёнках.
Исследовать скорость деградации плёнок в условиях культивирования клеток и в организме.
Научная новизна работы. Впервые для формирования многослойного пласта кератиноцитов были использованы плёнки на основе аморфного поли(0,Ь-лактида), прикреплённые к поверхности покровного стекла. Такой способ позволяет отделить плёнку со сформированным клеточным пластом от подложки и перенести его на рану даже при толщине плёнки 5 мкм.
Показано, что решающим фактором, влияющим на прикрепление и распластывание кератиноцитов при модификации полилактидной матрицы коллагеном, является структура нанесенного белка. Фибриллярная структура коллагена способствует пролиферации кератиноцитов. Впервые разработаны условия, при которых фибриллообразование коллагена осуществляется в момент нанесения коллагена в молекулярной форме на поверхность полилактидной плёнки, что позволяет достичь равномерного распределения фибрилл коллагена на поверхности.
Впервые для модификации полимерной матрицы был использован лизин. Показано, что такая обработка способствует распластыванию кератиноцитов.
Практическая ценность. Сформированный клеточный продукт, который состоит из выращенного на биодеградируемой полилактидной матрице многослойного пласта кератиноцитов, может быть использован для трансплантации на повреждённый участок кожного покрова.
Предложенные методы модификации поверхности полилактидной матрицы, предназначенной для культивирования кератиноцитов, могут быть использованы и для других полимеров медико-биологического назначения. В частности разработанные методы модификации могут быть применены в процессе разработки трёхмерных пористых полимерных матриц. Такие матрицы позволят создать условия для формирования сложных клеточных композиций, максимально приближённых по их пространственной организации к условиям существования клеток в тканях организма.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ из них 2 статьи и 13 тезисов. Результаты исследования были представлены на 3 научной сессии У НИХ (Санкт-Петербург, 1-4 октября, 2004), международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», (Санкт-Петербург, 25-27 октября 2004 г.), С.-Петербургской конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 1-3 февраля 2005 г.), Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 12-15 апреля 2005 г.), 9-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2005 г.), Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 14-16 апреля, 2005), European Polymer Congress (Moscow, June 27-29, 2005), International conference "New polymer systems for biotechnological and biomedical applications" (Jerevan, Republic Armenia, July 12-14, 2005), International symposium"Biomaterials" (Hamburg October 1- 4, 2006), Международная конференция "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург 17-19 октября,
2006), IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 12-16 марта, 2007), British-Russian workshop"Stem cells: policy, research, and innovations. European Union -Russian Federation perspectives" (Moscow, March 15, 2007).
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (207 ссылок). Работа изложена на 163 страницах текста.
Основные требования, предъявляемые к полимерам в тканевой инженерии
К полимерным материалам, используемым в разных направлениях тканевой инженерии, предъявляются определённые требования, связанные с решением каждой конкретной задачи (21). Однако независимо от конкретных задач ко всем полимерным материалам предъявляются общие требования, которые состоят в следующем: они не должны быть токсичными, вызывать реакции отторжения, иными словами, они должны обладать биологической совместимостью с тканями организма; скорость их деструкции должна определенным образом коррелировать со скоростью формирования интегрированной ткани; продукты их деструкции не должны быть токсичными, более того, желательно, чтобы эти продукты могли служить питательными веществами для клеток растущей ткани; возможность контроля скорости деградации в зависимости от конкретной задачи; на основе полимера можно формировать изделия с необходимыми конструкционными параметрами в зависимости от конкретной задачи; лёгкость и технологичность изготовления полимерного материала; полимерный материал должен способствовать адгезии, пролиферации и росту клеток.
Этим требованиям в той или иной степени отвечает целый ряд натуральных и синтетических биодеградируемых полимеров. Поскольку в организме роль субстрата, создающего клеточное микроокружение и отвечающего за структурные и функциональные функции, выполняют белки внеклеточного матрикса: коллаген, ламинин, фибронектин и др., первые матрицы для культивирования клеток были приготовлены именно на основе таких белков (22-26). Помимо белков широкое применение находят другие натуральные полимеры, прежде всего, такие как хитозан, гиалуроновые кислоты, крахмал и ряд других полисахаридов (27-31). Так, например, мукополисахарид хондроитинсульфат применяется для создания биодеградируемого слоя многослойных плёночных покрытий, предназначенных для обработки ран (32-35). Клеточные субстраты на основе природных материалов и в настоящее время используются в медицине. Однако такие матрицы наряду с достоинствами, такими как нетоксичность, биосовместимость, высокая степень гидрофильности и способность непосредственно взаимодействовать с поверхностными рецепторами клеток, имеют и недостатки. Во-первых, это высокая скорость резорбции матрицы и сложность регулирования кинетики деградации. Во-вторых, малая механическая прочность, что приводит к контракции матрицы под действием клеточных сил (36, 37). В-третьих, это ограниченное число способов модификации таких матриц из-за низкой устойчивости к различного рода воздействиям. К этим недостаткам можно добавить технологическую сложность получения природных материалов и вытекающую отсюда высокую стоимость конечного продукта. Кроме того, недостаток натуральных материалов заключается в сложности формирования матриц с заданными параметрами, в том числе создание трёхмерных конструкций с требуемыми размерами и распределением пор. Поэтому альтернативой природным полимерам, которые могут быть использованы в тканевой инженерии являются синтетические полимеры. Преимуществами синтетических полимерных материалов являются высокая вероятность прогнозирования свойств конечного изделия на стадии синтеза исходных мономеров, относительная лёгкость изготовления и дешевизна конечного продукта. Однако, синтетических полимеров, которые полностью удовлетворяли бы всем перечисленным медико-биологическим требованиям, ещё не создано. Тем не менее, уже в настоящее время многие полимеры с успехом используются в различных областях практической медицины.
Как уже было ранее сказано, одно из главных требований, предъявляемых к полимерам, разрабатываемых для тканевой инженерии, является их биодеградация, на скорость которой существенное влияние оказывает природа связи. Исходя из этого все полимеры, предназначенные для использования в этой области можно разделить по типу связей между мономерными звеньями. Основными типами деструктируемых химических связей в таких полимерах являются алифатические сложноэфирные и алифатические амидные группировки, то есть те связи, которые могут подвергаться гидролитическому расщеплению, как в биотических, так и в абиотических условиях. Первую группу обычно принято называть полиалконоатами, а вторую - полиамидами. Анализ литературы показывает, что наиболее интенсивно используемыми синтетическими полиалканоатами в качестве искусственной полимерной матрицы являются полигликолевая и полимолочная кислоты или их сополимеры (38-49). Широкое применение полимерных материалов этого класса в тканевой инженерии обусловлено их доступностью в экономическом плане и возможностью промышленного получения полимеров с высокой степенью чистоты, необходимой для полимеров медицинского назначения. Немаловажным обстоятельством является технологическая лёгкость получения изделий требуемой формы и подходящей степени пористости. Полигликолевая кислота (полигликолид) имеет высокую степень кристалличности (45-55%) при температуре плавления 225-230С (50) и температуре стеклования 35-40С. Волокна из этого полимера отличаются высокой прочностью, но обладают высокой жёсткостью. Период полураспада полигликолида составляет от 60 до 90 суток в зависимости от формьї и размеров образца, а также условий деградации (51). Полный распад изделий наблюдается через 4-6 месяцев, в зависимости от формы и объёма изделий (52). Полимолочная кислота (полилактид) обладает гораздо большим разнообразием химических структур и, соответственно, свойств. В природе молочная кислота синтезируется животными, растениями, микроорганизмами. Наличие в молочной кислоте хирального атома углерода определяет возможность существования двух стереоизомеров - D и L. Соответственно цепи полилактида могут состоять из звеньев D-изомера, L-изомера или рацемической смеси двух изомеров (D,L). Поли(О-лактид) и поли(Ь-лактид) представляют собой кристаллические полимеры. Поли(0,Ь-лактид) -аморфный полимер, но его свойства существенным образом определяются микроструктурой цепей, а именно, характером распределения D- и L-звеньев 53, 54). Это распределение может быть от случайного до распределения с высокой степенью блочности стереомерных звеньев.
Получение пористых плёнок из смеси полилактида (ПЛ) и полиэтиленгликоля (ПЭГ)
Для получения плёнок толщиной 50 мкм навески массой 500мг, содержащие смесь полимеров из полилактида и 10 или 30 массовых % полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 или 15000, растворяли в 15 мл хлористого метилена. Растворение смеси полимеров проходило при периодическом перемешивании в течение 2 часов. По истечение указанного времени раствор полимера отливали на фторопластовую подложку площадью 130 75 = 9750 мм . После испарения растворителя плёнки высушивали в эксикаторе при комнатной температуре в течение 2 суток при температуре 20-25 С. Плёнки толщиной 5 мкм получали на вращающемся покровном стекле по методике, описанной в пункте 2.1.3. Для этой цели готовили раствор смеси полимеров с концентрацией 50 мг/мл, содержащей 10 или 30 массовых % ПЭГ с молекулярной массой 6000 или 15000. 85 мкл раствора наносили на вращающееся покровное стекло размером 18x18 мм. После испарения растворителя плёнки высушивали в эксикаторе при комнатной температуре в течение 2 суток. Для растворения ПЭГ плёнки, прикреплённые к стеклу, выдерживали в воде, объёмом 50 мл. 1. Крысиные хвосты промывали дистиллированной водой, после чего вынимали сухожилия, которые главным образом состоят из коллагена типа 1 (183). Сухожилия промывали несколько раз физиологическим раствором (0.9% раствор NaCl), чтобы отмыть остатки крови и мышечных волокон, затем промывали 2-3 раза деионизованной водой (после промывания в дистиллированной воде сухожилия становятся упругими и эластичными). Масса промытых и высушенных сухожилий составила 10 грамм. Сухожилия измельчали и оставляли в 0.5 М уксусной кислоте на ночь для растворения коллагена. На следующий день раствор гомогенизировали и доводили до 2.7 литра 0.5 М уксусной кислотой и оставляли перемешиваться ещё на сутки. 2. После перемешивания раствора в течение суток и растворения коллагена, раствор крутили на центрифуге для удаления нерастворившихся частиц. К супернатанту добавляли сухой NaCl, чтобы получить 0.9 М раствор (именно при этой концентрации хлористого натрия идёт осаждение коллагена) и оставляли на ночь для осаждения осадка.
Калибровочный коллаген (одиночные не агрегированные молекулы белка) необходим для определения точной концентрации белка. Такой белок получали высаживанием раствором соли меньшей концентрации -0.6 М NaCl. 3. Полученный раствор центрифугировали, осадок промывали 0.95 М NaCl в 0.5 М СЦСООН и повторно центрифугировали ещё 30 минут. 4. Следующим этапом работы является избавление от NaCl. Для этого полученный осадок смешивали с 0.1 М СН3СООН и диализовали против раствора уксусной кислоты этой же концентрации. После двух суток диализа, раствор меняли на 0.5 М СН3СООН. 5. Растворённый в кислом растворе уксусной кислоты коллаген высаживали центрифугированием и ставили на диализ против 0.02 М раствора Na2HP0412НгО. Диализные растворы меняли каждый день в течение 4 суток. 6. Выпавший осадок коллагена осаждали центрифугированием, растворяли в 0.5 М СНзСООН и диализовали против раствора уксусной кислоты этой же концентрации с хлороформом для стерилизации. Диализный раствор меняли каждые сутки, постепенно уменьшая концентрацию уксусной кислоты до 1:1000. Выход коллагена составил 2 грамма. Способ 1. (Обычный лабораторный способ, применяемый при культивировании многих типов клеток). Покровное стекло с полимерной пленкой помещали в чашку Петри. Затем на него наносили раствор коллагена в концентрации 100 мг/мл. Через 30 мин инкубации при комнатной температуре раствор удаляли, и стёкла дважды промывали PBS (субстрат 1). В случае трёхкратного нанесения раствора коллагена образец после каждого нанесения дважды промывали PBS. Способ 2. На полимерную пленку наносили 30 мкл раствора коллагена в 0.1 % растворе уксусной кислоты (0,1 мг/мл).
После нанесения 53 раствора плёнки высушивали на воздухе в течение 1 суток при комнатной температуре (субстрат 2) (184). Способ 3. В раствор коллагена с концентрацией 2 мг/мл добавляли 1,0 М раствор NaH2P04 до конечной концентрации соли 0.02М (рН=7.4). Полученную смесь немедленно наносили на полимерную пленку и помещали в атмосферу аммиака на 15 мин. Перевод кислого раствора молекулярного коллагена в нейтральную среду приводит к фибриллобразованию молекул коллагена. После инкубации образцы дважды промывали PBS и стерилизовали УФ-облучением в течение 2 ч (субстрат 3)(184). Образцы плёнок толщиной 50 мкм и площадью 300-400 мм инкубировали в 10 мл 0.1 М растворе лизина (0.1 М гидрохлорид лизина, 0.2 моль NaHCCb в смеси вода/спирт=1/1, где спирт: метиловый, этиловый, изопропиловый) при температуре 55-60С. После выдерживания полимерных плёнок в растворах в течение 1, 2, 5 и 10 мин их вынимали, трижды промывали в большом количестве дистиллированной воды и высушивали. Затем запаивали в ампулы с 1 мл 6М HCL и гидролизовали при 120С в течение 24 часов. Для исследования влияния такой модификации на поведение кератиноцитов, обработку раствором лизина проводили полилактидных плёнок, прикреплённых к покровному стеклу в течение 5 минут и также тщательно промывали в дистиллированной воде.
Выделение клеток кожи и анализ их поведения на исследуемых субстратах
Фибробласты кожи человека были получены путем миграции из кусочков кожи, взятой от здоровых доноров в ходе косметологических операций. Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки в атмосфере 5 % ССЬ при температуре 37 С. Питательную среду меняли каждые 3 дня. В опыт брали клетки после 4-6 пассажей культивирования.
Первичную культуру кератиноцитов человека получали из кожи здоровых взрослых доноров, подвергшихся косметической операции. Выделение кератиноцитов проводили по модифицированной методике (185). Кожу промывали PBS и после отделения подкожной клетчатки нарезали на небольшие (5-Ю мм) фрагменты и помещали на 14-16 ч при 4 С в раствор PBS, содержащий 0.2 % коллагеназы (ОАО "Технология", Санкт-Петербург) и 0.5 % диспазы (Roche Diagnostics GmbH Mannheim, Германия). После обработки ферментами эпидермис отделяли и инкубировали в растворе, содержащем 25 % трипсина и 25 % версена (Биолот, Санкт-Петербург), в течение 7 мин при температуре 37 С. Фермент инактивировали путем добавления 10 % сыворотки и оставляли еще на 20 мин. Суспензию клеток 20 раз пипетировали с помощью пипетки с широким отверстием. Затем её фильтровали через нейлоновую сетку, после чего клетки осаждали центрифугированием. Осадок ресуспендировали в смеси сред DMEM и F12 (3:1) с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки коров. Суспензию клеток вносили в чашки Петри диаметром 3 см из расчета 2.5-3 млн на чашку.
Клетки культивировали в смеси сред DMEM и FJ2 (3 : 1), с добавлением 10 % FBS, 5 мкг/мл инсулина, 5 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, холерного токсина 10 "10 М (Sigma, США), 5 мг/мл трансферрина, 1.8x10 "4 М аденина (ISN-Flow, США), 2x10 А М лиотиронина (Koch-Light, США). Питательную среду меняли через каждые 2-3 дня.
Одним из критериев взаимодействия клеток с полимером служит морфология клеточной популяции. За изменением формы клеток в процессе культивирования их на поверхности наблюдали под инвертированным микроскопом. Кроме того, оценивали скорость пролиферации клеток путём подсчёта их в камере Горяева через 1 или 2 недели после посева. Контролем в этой серии экспериментов служили клетки, культивировавшиеся на поверхности покровного стекла (для фибробластов) или на поверхности покровного стекла, покрытого коллагеном (для кератиноцитов) в среде с 10 % эмбриональной сыворотки коров.
Суспензию фибробластов с концентрацией 3x104 кл/мл наносили на покровные стекла (8-Ю тыс кл/см), покрытые полилактидом в чашки Петри. Перед нанесением клетки дважды промывали средой DMEM без сыворотки, чтобы исключить неспецифическое влияние белков сыворотки на их прикрепление к субстрату. По истечении 20, 40 и 90 мин питательную среду и не прикрепившиеся клетки удаляли, а стёкла промывали 2 раза физиологическим фосфатным буфером. Прикрепившиеся клетки фиксировали 70 % этанолом в течение 10 мин, а затем окрашивали в течение 10 мин толуидиновым синим. Число прикрепившихся клеток подсчитывали визуально под микроскопом в 10 полях зрения. Затем определяли процентное соотношение числа клеток на поверхности полилактидной плёнки к их числу в контрольном варианте . В качестве контроля было взято чистое гидрофильное покровное стекло.
Кератиноциты снимали с поверхности сосудов смесью растворов трипсина и версена, дважды промывали средой без сыворотки, наносили на приготовленные субстраты и оставляли прикрепляться при 37 С в атмосфере 5 % СОг в течение 1 ч. После указанного времени неприкрепившиеся клетки удаляли, а прикрепившиеся к субстрату промывали PBS. Клетки фиксировали 4 %-ым раствором формалина в течение 10 мин и трижды промывали PBS. Затем их обрабатывали 0,1 % Тритоном Х-100 в течение 15 мин и после аналогичной промывки PBS препараты окрашивали в течение 10 мин Тритс-фаллоидином. Организацию актинового цитоскелета наблюдали с помощью конфокального микроскопа.
Влияние условий получения полимерных плёнок на взаимодействие фибробластов с полимерной поверхностью полилактидной плёнки
Помимо влияния свойств растворителя важно было также установить, влияет ли на поверхностные свойства пленок степень гидрофильности того субстрата, на который наносится раствор полимера (в данном исследовании сравнивали гидрофильные и гидрофобизированные покровные стёкла).
Степень гидрофильности полилактидных плёнок, полученных из раствора в хлористом метилене и ацетоне и нанесенных на разные стёкла, была оценена методом измерения водного контактного угла. Полученные значения представлены в таблице 3.
Плёнка из полилактида, растворенного в ацетоне (а, б), в хлористом метилене (в, г), нанесенного на гидрофобные (а, в) и гидрофильные (б, г) покровные стекла.
В случае нанесения раствора ПЛ в хлористом метилене на гидрофобное и гидрофильное стекла заметной разницы в значениях угла смачивания обнаружено не было. В то же время при нанесении раствора в ацетоне полимер, нанесенный на гидрофобное покровное стекло, распределяется неравномерно, и на стекле остаются не покрытые полимером участки. Напротив, при нанесении раствора полимера в ацетоне на гидрофильное стекло полимер покрывает поверхность равномерно. При нанесении полимера из раствора в ацетоне на гидрофобное стекло было получено самое высокое значение угла смачивания и наблюдался волнистый водный мениск, который также указывал на неоднородность распределения полимера по поверхности. Общий вид поверхности ПЛ из растворов в хлористом метилене и ацетоне, как на гидрофобном, так и на гидрофильном стекле представлен на рис. 8.
В результате проведённых исследований было установлено, что полярность растворителя незначительно оказывает влияние на степень гидрофильности поверхности полимера. Лучший результат был получен при формировании полилактидной плёнки из раствора в ацетоне на гидрофильном покровном стекле.
Для того, чтобы установить в какой степени измеренная разница в углах смачивания оказывает влияние на поведение клеток, необходимо проанализировать способность к прикреплению, распластыванию и росту фибробластов, при нанесении их на разные подложки. Степень адгезии клеток к субстрату оценивали в питательной среде без сыворотки. Через 20, 40 или 90 мин препараты фиксировали, окрашивали красителем - толуидиновым синим, а затем подсчитывали число прикрепившихся клеток.
Количество клеток прикрепившихся к полимерной плёнке, полученной в ацетоне на гидрофобном стекле, существенно меньше, чем на гидрофильном. Как и можно было ожидать, клетки не прикреплялись к непокрытым полимером участкам гидрофобного стекла, что проиллюстрировано на приведенных фотографиях (рис. 9, б). а - контроль (покровное стекло), б - плёнка из ПЛ, полученная из раствора в ацетоне на гидрофобном стекле, в - плёнка из ПЛ, полученная из раствора в ацетоне на гидрофильном стекле, г - плёнка из ПЛ, полученная из раствора в хлористом метилене на гидрофобном стекле, д - плёнка из ПЛ, полученная из раствора в хлористом метилене на гидрофильном стекле.
Анализ показал, что по числу прикрепившихся клеток плёнка, полученная из раствора в ацетоне на гидрофильной подложке действительно в большей степени сравнима с контролем. На подложке, полученной из раствора полимера в хлористом метилене, число прикрепившихся клеток существенно меньше. При этом различий между влиянием гидрофильного и гидрофобного стекол на свойства поверхности пленки обнаружено не было (рис. 9, г, д). На полимере, полученном из раствора в ацетоне на гидрофобной подложке, прикрепившихся клеток было очень мало и они находились только на
