Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Физиологические функции про- и антиоксидантых систем, роль окислительного стресса в развитии патологии 10
1.1.1 Дыхательная цепь митохондрий и образование активных форм кислорода 10
1.1.2 Пероксид водорода и его физиологическая роль 12
1.1.3 Повышение уровня активных форм кислорода в клетке — окислительный стресс, его роль в норме и патологии 14
1.1.4 Антиоксидантная система клетки. Каталаза как компонент антиоксидантной защиты 16
1.2 Дефекты каталазы и жизнеспособность клеток в условиях окислительного стресса. 18
1.3 Апоптоз как вариант реакции на окислительный стресс 21
1.3.1 Сигнальные пути апоптоза. 22
1.3.2 Роль нарушений апоптоза в процессах опухолевого роста 25
1.4 Изучение механизмов апоптоза. Роль митохондриального белка-транслокатора TSPO в реализации апоптоза 27
1.4.1 Периферический бензодиазепиновый рецептор (TSPO) как маркер митохондриального пути передачи апоптотического сигнала 27
Глава 2. Материал и методы исследования 30
2.1 Культивирование клеток 31
2.2 Индукция окислительного стресса 31
2.3 Методы морфологического исследования 33
2.3.1 Оценка уровня апоптоза 33
2.4 Методы молекулярно-генетического исследования 33
2.4.1 Выделение ДНК 33
2.4.2 ПДРФ анализ 35
2.4.3 Выделение мРНК 37
2.4.4 ПЦР в реальном времени 37
2.5 Биохимические методы исследования 38
2.5.1 Измерение активности антиоксидантных ферментов 38
2.6 Статистическая обработка результатов 40
Глава 3. Результаты собственных исследований 43
3.1 Формирование групп нормальных клеток с различной активностью каталазы 43
3.1.1 Распределение полиморфизма С-262Т гена CAT в мононуклеарных лейкоцитах 43
3.1.2 Определение активности каталазы в эритроцитах людей с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы 45
3.2 Сравнение распределения полиморфизма С-262Т гена каталазы в здоровых и опухолевых клетках 46
3.3 Определение активности каталазы в лейкоцитах периферической крови в состоянии окислительного стресса 50
3.4 Оценка выраженности апоптоза клеток при индукции окислительного стресса 51
3.5 Определение уровня экспрессии белка-транслокатора (TSPO) в лейкоцитах при индукции окислительного стресса в клетках в зависимости от полиморфизма С-262Т гена каталазы 60
Глава 4. Обсуждение результатов 63
Выводы 83
Практические рекомендации 84
Список литературы 85
- Повышение уровня активных форм кислорода в клетке — окислительный стресс, его роль в норме и патологии
- Роль нарушений апоптоза в процессах опухолевого роста
- Методы молекулярно-генетического исследования
- Сравнение распределения полиморфизма С-262Т гена каталазы в здоровых и опухолевых клетках
Повышение уровня активных форм кислорода в клетке — окислительный стресс, его роль в норме и патологии
В этой цепи восстанавливается 93 – 95% молекулярного кислорода, однако другие 5 – 7% могут оставаться не полностью восстановленными, формируя реакционно активные соединения, свободные радикалы. Другим путем возникновения активных форм кислорода называют дополнительные реакции в цепи, протекающие как спонтанно, благодаря разности окислительно-восстановительных потенциалов или возникновению побочных продуктов реакций, так и за счет вспомогательных реакций, осуществляющих окисление субстратов помимо цепи переноса электронов. Так, при измерении окислительно-восстановительного потенциала реакции преобразования O2 в O2 в нормальных условиях (pH 7,0) ученые показывают, что данное значение является промежуточным между потенциалами начального и конечного звена электрон-транспортной цепи и составляет -0,160 В.
Дыхательная цепь включает окислительные центры с потенциалами от -0,320 В (NAD(P)H) до +0,39 В (цитохром а3). Следовательно, термодинамически дыхательные компоненты этих центров (железо-серные кластеры, се-михинон, флавопротеины) вполне способны к переносу электронов с образованием супероксид аниона. Кроме того, многие этапы переноса электронов содержат одноэлектронные переносчики, которые также способны осуществлять моновалентное восстановление кислорода (Turrens J.F., 2003). Согласно другим данным помимо системы цитохромов источником активных форм кислорода могут являться побочные реакции, такие как метаболизм ксанти-на, гипоксантина, L- и D-аминокислот: при этом происходит перенос протонов непосредственно на молекулярный кислород с образованием пероксида водорода (Чеснокова Н.П. и др., 2006а).
Таким образом, промежуточные формы восстановленного кислорода образуются на протяжении дыхательной цепи.
Под термином «активные формы кислорода» в различных источниках объединяют: супероксидный анион-радикал O2, пероксид водорода HOOH, гидроксильный радикал HO, синглетный кислород 1O2, озон O3, пероксиль-ные радикалы ROO-, гипохлорит ClO-, оксид азота NO, гидропероксил радикал НОО, пероксинитрит ONOO- и ряд других свободных радикалов. Перечень этих соединений варьирует от одной публикации к другой (Strzelczyk J. K., Wiczkowski A., 2012), однако все они оказывают влияние на клетку как в физиологическом состоянии, так и при возникновении окислительного стресса (Владимиров Ю.А., 2009). При этом наиболее изученными и представляющими наибольший интерес свободными радикалами в клетке остаются супероксидный анион-радикал O2, пероксид водорода HOOH и гидроксильный радикал HO. И поскольку известно, что образование этих соединений – процесс неизбежный для клетки, большее внимание было обращено к их роли в клетке и процессам их утилизации.
Пероксид водорода представляет большой интерес исследователей, поскольку выделяется среди других активных форм кислорода не высокой окислительной способностью, но большой продолжительностью жизни. Сам пероксид водорода не обладает свойствами сильного окислителя, однако легко преобразуется в другие, более агрессивные молекулы, такие как гипохло-рит или гидроксильный радикал. Кроме того, согласно одним исследованиям, в отличие от супероксидного анион-радикала, пероксид водорода обладает большей подвижностью и способностью проникать через мембраны. Однако на сегодняшний день существуют данные, опровергающие это утверждение (Grivennikova V.G., 2010).
Образование пероксида водорода в клетке происходит различными путями. Согласно исследованию Boveris и коллег, образование пероксида водорода в митохондриях клеток печени составляет лишь 15% от общего производства пероксида водорода в клетке (Boveris A. et al., 1972). Однако есть основания полагать, что в других типах клеток этот вклад может оказаться больше (Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д., 2013). При этом в целом в клетке пероксид водорода может образовываться посредством преобразования супероксидного анион-радикала как спонтанно, так и при каталитическом участии супероксиддисмутазы, а также в процессе прямого синтеза в реакциях с участием гликолатоксидаз или оксидаз D-аминокислот в перокси-сомах. В митохондриях описаны источники образования пероксида водорода – окисление сукцината и NADH (Комплексы I и II) (Jensen P.K., 1966).
Пероксид водорода в малых концентрациях выполняет ряд важных функций в клетке. Так, он используется фагоцитами в реакции, катализируемой миелопероксидазой, для образования гипохлорита, который, в свою очередь, обладает свойством разрушать клеточную стенку бактерий, тем самым защищая организм от чужеродной клетки (Владимиров Ю.А., 2000; Mayer G., 2006).
Однако кроме защитной функции большое внимание уделяется важной роли пероксида водорода в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза. Несмотря на слабые окислительные свойства, он способен окислять SH-группы белков, вызывая тем самым модификацию рецепторных белков, имитируя функцию лиганда (Reth M., 2002). Таким образом, он принимает участие в возникновении и передаче клеточных сигналов.
Именно свойство пероксида водорода оказывать влияние на вступление клетки в апоптоз вызывает повышенный интерес исследователей, особенно в применении к клеткам злокачественных новообразований, имеющий нарушение в регуляции клеточного цикла и пролиферирующих без вступления в апоптоз.
Роль нарушений апоптоза в процессах опухолевого роста
Выраженность апоптоза оценивалась визуально при помощи окраски клеток акридиновым оранжевым/бромистым этидием (АО/ЕВ) (Gerbu Biohechnick GmbH, MP Biomedicals Inc.) согласно методу Ribble D., 2005 (Ribble D. et al., 2005). Концентрация красителей составляла 8 мг/мл каждого. Визуализация проводилась с использованием флуоресцентного микроскопа Мик-ромед 3 ЛЮМ (Микромед, Россия) при увеличении Х400, светофильтр 000. Подсчитывали число апоптотических клеток на 100 визуализируемых клеток. Живая клетка под микроскопом имела округлую форму, крупное ядро, имеющее относительно равномерную окраску и занимающее почти всю клетку, четкий ровный контур.
Апоптотическая клетка распознавалась по конденсированному содержимому, образующему скопление неправильной формы с фрагментарным или полным окрашиванием в зеленый, реже желтый, цвет. Цитоплазма апоптотических клеток за счет образования выпячиваний придавала клетке нечеткие очертания и имела более слабое зеленое или оранжевое окрашивание. В состоянии позднего апоптоза клетка представляла собой скопление фрагментов оранжевого цвета. Некротические клетки приобретали яркое красно-оранжевое окрашивание.
Живые клетки меланомы линии Bro при окраске акридиновым оранжевым/бромистым этидием отличались крупным размером и шероховатостью поверхности. Цитоплазма и ядро их также равномерно окрашивались в зеленый цвет. В апоптотических клетках ядро было желто-оранжевого цвета. Некротическая клетка имела красно-оранжевую окраску. тельно здоровых людей в качестве материала использовались образцы венозной крови, взятые у пациентов в возрасте от 18 до 60 лет, у которых на момент исследования не было выявлено заболеваний, в том числе связанных с нарушением окислительно-восстановительных процессов. Среди исследуемых было 82 женщины (средний возраст 24,35±6,80 лет) и 21 мужчина (средний возраст 22,14±3,60 лет).
Для определения полиморфизма в опухолевых клетках было исследовано 50 биоптатов меланомы кожи и 50 биоптатов плоскоклеточного рака, полученных от онкологических больных. Среди пациентов с меланомой кожи было 63% женщин и 37% мужчин. Средний возраст женщин составил 50,28±14,34 лет (18 – 76 лет), возраст мужчин — 53,07±12,17 лет (29 – 75 лет). Локализация меланомы была различной, от области лица и шеи до голеней и стоп. Среди поставленных диагнозов преобладала поверхностно распространенная меланома (72%). Кроме того, присутствовали образцы ленти-го меланомы (9%), веретеноклеточной меланомы (7%), узловой меланомы (5%) и других видов (7%).
Одним из важных диагностических признаков при оценке меланомы является классификация по уровню инвазии по Кларку. Согласно этой классификации, на первом уровне инвазии клетки меланомы распространяются в верхнем слое кожи (эпидермисе). Второй уровень инвазии характеризуется внедрением клеток во второй слой кожи, дерму, на третьем-четвертом уровне клеток меланомы заполняют всю толщу дермы, не выходя при этом за ее пределы. При пятом уровне инвазии распространение опухоли происходит за пределы дермы, в подкожно-жировую клетчатку. В исследуемой выборке образцов меланомы присутствовали образцы с первого по пятый уровень инвазии по Кларку. При этом образцы с 1–2 уровнем инвазии составили 7,3%, 2 уровнем – 26,8%, 3 уровнем – 39%, 4 уровнем – 19,5%, 5 уровнем – 7,3%.
Среди пациентов с плоскоклеточным раком кожи преобладали мужчины (71,1 %). Средний возраст женщин составил 66,9±13,83 лет (48 – 82 года), мужчин – 62,03±14,50 лет (24 – 81 год). Основным местом локализации плоскоклеточного рака была голова (включая расположение на нижней губе, ушной раковине, нижней челюсти) – 76,0 %.
Нельзя не отметить, что в группах условно здоровых добровольцев и пациентов с меланомой и плоскоклеточным раком кожи средний возраст существенно различался. Однако в исследовании российских ученых показано, что распределение полиморфизма С-262Т гена каталазы значимо не изменяется в возрастных группах от 1 до 75 лет (Паук В.В. и др., 2008). Это сделало возможным сравнение полученных в данном исследовании распределений.
Для получения ДНК из биоптатов кожи производилась предварительная депарафинизация ксилолом с последующей спиртовой промывкой по стандартной методике. После этого образцы ткани инкубировались при температуре 55С в течение ночи с лизирующим раствором (комплект реагентов ДНК-сорб В, Amplisens, Россия). Для получения ДНК из лейкоцитов образцы крови центрифугировались на скорости 2700 об./мин в течение 15 мин, затем лейкоциты отбирались в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и заливались лизирующим раствором (комплект реагентов ДНК-сорб В, Am-plisens, Россия). Дальнейшее выделение ДНК осуществлялось при помощи комплекта реагентов ДНК-сорб В (Amplisens, Россия). Выделенные образцы ДНК хранились при температуре -20С.
Для выявления мутации использовали метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ), описанный Nagasaka T. et al. (2004).
Праймеры 5 -CTGATAACCGGGAGCCCCGCCCTGGGTTCGGATAT-3 и 5 -CTAGGCAGGCCAAGATTGGAAGCCCAATGG-3 (ООО «Сибэн-зим», Новосибирск) были созданы по последовательности, описанной Zar-bock R. et al. (2007) для представления сайта рестрикции EcoR V (BioLabs,
New England) в диком аллеле (GATATC). Амплификация проводилась на ам-плификаторе BIS Termocycler в объеме 25 мкл, содержащем ПЦР буфер, 1,5 ммоль/л MgCl2 (ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора), 0,2 мкмоль/л каждого праймера, 0,1ммоль/л dNTPs (5х dNTPs mix, ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребна-дзора), 0,625 единиц TaqF полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Ростпотребнадзора) и около 50 нг выделенной ДНК.
Условия ПЦР (Zarbock R. et al., 2007) были изменены в сторону увеличения количества циклов до 40: первоначальная денатурация при 95С – 15 мин, и 40 циклов денатурации при 94С – 1 мин, отжига праймеров при 68С – 1 мин, элонгация при 72С – 1 мин; 15 мин при 72С для конечной элонгации. Длина полученного ПЦР-продукта составляла 190 п.н.
Полученные ампликоны переосаждали по стандартной методике с 5М хлоридом натрия и этанолом и подвергали рестрикции с помощью рестрикта-зы EcoR V. Рестрикция производилась в объеме 25 мкл с использованием буферного раствора для рестриктазы SE W и бычьего сывороточного альбумина (БСА) в концентрации 100 мкг/мл (СибЭнзим, Россия) при температуре 37С в течение 20 ч. В качестве положительного контроля на этапе рестрикции использовали геномную ДНК человека (Applied Biosystems, США).
Для определения длин полученных продуктов рестрикции осуществляли электрофоретическое разделение в 10% полиакриламидном геле (камера для электрофореза Helicon, BioRad, США) при следующих параметрах: сила тока – 50 мА, напряжение – 400 В, мощность – 15 Вт (источник тока Эльф-8, ДНК-Технология, Россия). Для определения длин фрагментов на дополнительную дорожку геля наносили маркерную ДНК 100 bp Ladder (Медиген, Россия) в объеме 1 мкл. После завершения электрофореза гель окрашивался раствором бромистого этидия в течение 5 мин. Визуализация продуктов рестрикции в геле осуществлялась с использованием прибора ChemiDoc (Bio-Rad, США).
Методы молекулярно-генетического исследования
TSPO рассматривается как маркерный белок митохондриального сигнального пути апоптоза (Corsi L. et al., 2008, Xiaolong Q. et al., 2012). Поэтому определение уровня TSPO в лейкоцитах с различными вариантами полиморфизма в условиях окислительного стресса вызывает большой интерес.
В нашем исследовании наблюдалось отсутствие корреляции между вариантом полиморфизма C-262T в промоторной части гена каталазы и уровнем TSPO для всех исследуемых образцов. Более того, данные об изменении уровня мРНК белка-транслокатора относительно такового -актина были индивидуальными для каждого из 9 исследуемых лиц и не поддавались единому объяснению. Для многих образцов был отмечен значимый дозозависимый эффект концентрации пероксида водорода на уровень экспрессии TSPO.
На рис. 14 в качестве примера приведены графики зависимости относительного количества мРНК TSPO (RQ) для трех исследуемых лиц с полиморфизмом -262СТ. Измерения проведены в 4 повторах, данные представлены в виде медианных значений и верхнего и нижнего квартилей. В образце CT1 отмечалось достоверное повышение относительного количества TSPO после инкубации с 700 мкмоль/л пероксидом водорода по сравнению с контролем (p = 0,018). При повышении концентрации пероксида водорода до 1000 мкмоль/л относительное количество TSPO снова резко снижалось (p = 0,018) (см. рис. 14, график CT1).
В образце CT2 также наблюдалось изменение относительного количества TSPO в присутствии 700 мкмоль/л пероксида водорода, однако, в этом случае, мы отмечали не повышение, а снижение уровня экспрессии данного белка (p = 0,023). При 1000 мкмоль/л H2O2 значимых различий с контролем не отмечалось. В образце CT3 статистически значимое повышение относительного количества TSPO наблюдалось именно при максимальной из представленных концентраций пероксида водорода – 1000 мкмоль/л (p = 0,031). Рис. 14. Относительное количество мРНК TSPO к -актину (RQ) в трех образцах моно-нуклеарных лейкоцитов с вариантом -262СТ гена каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре. Цифрами 1 – 5 отмечены значения, имеющие достоверные различия при p 0,05.
Рис. 15. Относительное количество мРНК TSPO к -актину (RQ) в культурах мононукле-арных лейкоцитов с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре. При статистической обработке данных по группам с различными вариантами полиморфизма С-262Т получены медианные значения, не имеющие достоверных различий ни при изменении концентрации пероксида водорода, ни между вариантами полиморфизма для каждой концентрации (рис. 15). Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Влияние мутации С-262Т в промоторной части гена каталазы на изменение активности данного фермента неоднократно подтверждалось исследованиями ученых и подробно обсуждалось и их исследованиях (Forsberg L. et al., 2001; Nadif R. et al., 2005; Bastaki M. et al., 2006; Ahn J. et al., 2006). С одной стороны, было показано, что данная мутация снижает активность катала-зы, с другой – приводит к повышению уровня самой каталазы в эритроцитах, предположительно за счет повышения транскрипционной активности мутантного гена каталазы (Forsberg L. et al., 2001).
Полученные нами данные активности каталазы в эритроцитах согласуются с результатами зарубежных исследователей: активность каталазы в клетках с генотипами СС и СТ достоверно ниже таковой в клетках с диким вариантом генотипа – СС. Таким образом, метод использования полиморфизма каталазы для разделения образцов на группы по активности оказался успешным. В результате этого было получено три группы с двумя достоверно различными уровнями активности каталазы. Однако, опираясь на исследования, связанные с влиянием изменений в гене каталазы на риски развития заболеваний, обнаружено, что, несмотря на снижение активности фермента в случаях как с гомозиготной мутацией -262ТТ, так и с гетерозиготной мутацией -262СТ в гене CAT, достоверные изменения в рисках развития связанных с ней заболеваний отмечаются лишь для мутации в двух аллелях гена.
Гетерозиготная мутация -262СТ рассматривается скорее как промежуточный вариант между исходным диким и гомозиготным мутантным вариантами. В работе Forsberg L. et al. (2001), оценивших не только активность ка-талазы, но и изменение уровня транскрипционной активности гена при наличии мутации, было показано, что при наличии варианта -262СТ гена каталазы уровень этого фермента в крови выше, чем при диком варианте -262СС, но ниже гомозиготного мутантного варианта -262ТТ. Все эти данные позволили нам предположить, что функционирование каталазы, определяемое гетерозиготной мутацией С-262Т в промоторной части гена CAT может быть отличным от такового каталазы гомозиготного мутанта -262ТТ. Поэтому в дальнейшем исследовании осуществлялся анализ всех трех групп образцов, которые были обозначены в соответствии с вариантом полиморфизма гена ката-лазы в положении -262: СС, СТ и ТТ.
Определение активности каталазы в клетках опухолей может вызвать затруднения по причине трудной доступности этого биологического материала для лабораторных исследований. Сохранение опухолевых тканей производится с применением формалиновой фиксации и заключения в парафиновый блок. В этом случае нельзя говорить об изучении живых процессов в клетке, в том числе измерении активности белка. В этом случае определение генотипа позволяет предположить уровень конститутивной активности фермента. Сравнение частот полиморфизма С-262Т, оказывающего влияние на активность каталазы, в группах раковых и здоровых клеток позволит сделать вывод об особенностях протекания процессов, связанных с данной мутацией, и их участии в развитии заболевания.
Исследования распределения данного полиморфизма проводились неоднократно для ряда заболеваний, связанных с действием окислительного стресса на клетку. При этом результаты исследований распределения полиморфизма С-262Т в гене каталазы среди пациентов давали различные ответы о влиянии данной мутации на риск развития заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Так, с одной стороны, отмечен эффект повышения риска развития таких заболеваний, как гипертензия (Mansego M.L. et al., 2011; Hebert-Schuster M. et al., 2012), атеросклероз (Letonja M. et al., 2011), язвенный колит (Khodayari S. et al., 2013) и пр. при наличии гомозиготной мутации С-262Т в гене САТ, снижающей ее активность.
Сравнение распределения полиморфизма С-262Т гена каталазы в здоровых и опухолевых клетках
Несмотря на отсутствие явных проявлений в физиологическом состоянии, в ряде работ отмечено повышение риска развития ряда заболеваний, связанных с действием активных форм кислорода для людей со сниженной активностью каталазы. Это позволяет предположить, что существенные изменения в работе антиоксидантной системы в этом случае возникают именно в ответ на окислительный стресс. Потому как именно в условиях окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода, роль каталазы становится ключевой (Чеснокова Н.П. и др., 2006б). Поэтому задачей следующего этапа данной работы было разъяснение характера изменений, которые происходят в антиперекисной защите у лиц со снижающей активность мутацией и без нее под действием окислительного стресса, индуцированного перокси-дом водорода.
Полученные данные, не содержащие достоверного изменения активности каталазы, позволяют предположить, что в нормальном состоянии моно-нуклеарные лейкоциты обладают хорошим резервом в отношении антипере-кисной защиты. Потому в первые часы возникновения окислительного стресса, вызванного заданными концентрациями пероксида водорода, имеющихся ресурсов фермента оказывается вполне достаточно для того, чтобы противостоять действию активной формы кислорода. В то же время, если вспомнить данные активности каталазы в физиологическом состоянии в эритроцитах, то можно утверждать, что абсолютное значение активности каталазы в клетках с вариантами генотипа -262СТ и -262ТТ по каталазе все же остается пониженным в сравнении с диким вариантом СС. Поэтому для обеспечения равноценного ответа на окислительный стресс клеткам в группах СТ и ТТ необходимо было бы достоверное повышение активности каталазы.
Таким образом, следует заключить, что активность каталазы в клетках, содержащих мутацию С-262Т в гене CAT, не повышается в состоянии окислительного стресса, оставаясь на уровне ниже дикого варианта.
Измерение активности каталазы в состоянии окислительного стресса в лейкоцитах с различными вариантами полиморфизма гена каталазы С-262Т ранее не производилось, хотя изменение активности каталазы под действием окислительного стресса вызывает интерес ученых, изучающих как животные, так и растительные и бактериальные клетки (Shim Ie-S. et al., 2003; Nakamura K. et al., 2012).
Среди исследований модуляции окислительного стресса и оценки активности каталазы в клетках крови чаще описываются эксперименты с эритроцитами. При этом в силу сложностей культивирования эритроцитов эксперимент и оценка изменения активности осуществляется в короткие сроки. Поскольку данная работа преследовала цель сравнить уровень активности каталазы с последующей устойчивостью клетки к окислительному стрессу, объектом не могли стать только эритроциты. Было произведено сравнение полученных нами результатов с некоторыми данными для эритроцитов, позволяющими объяснить полученные результаты.
В ряде работ выявлено увеличение активности каталазы в условиях окислительного стресса в эритроцитах людей больных раком почки (Герасименко М.Н. и др., 2012). Однако в этом исследовании время воздействия на клетки факторов окислительного стресса составляет сутки и более. Можно предположить, что и в нашем случае можно было бы наблюдать достоверное изменение активности каталазы после более длительной инкубации клеток в присутствии пероксида водорода. Одним из косвенных подтверждений этому становятся результаты исследования клеток на выраженность апоптоза через 24 ч после добавления пероксида водорода в культуру.
При модуляции относительно кратковременного окислительного стресса в эритроцитах в исследовании Гидуляновой К.В. (2008) было показано достоверное увеличение активности каталазы в этих клетках через 1 ч инкубации для исследуемых лиц в возрасте от 8 до 14 лет, тогда как для людей 30 – 40 лет такого увеличения не наблюдалось. Miranda-Vilela A.L. et al. (2010) сделали сходное заключение для лейкоцитов в связи с наличием другого полиморфизма в промоторной части гена каталазы – А-21Т: эффект от окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, зависит от возраста исследуемого человека.
В нашем случае возраст исследуемых носителей полиморфизмов составил 20 – 31 год. Следовательно, можно предположить, что отсутствие быстрого ответа на окислительный стресс в лейкоцитах может объясняться возрастными особенностями исследуемых лиц. В то же время, нельзя не отметить, что уровень значимости p при оценке изменения относительной активности каталазы в клетках с вариантом полиморфизма СС был близок к пороговому (p = 0,067). Возможно, при увеличении выборки и использовании более чувствительного метода измерения активности каталазы можно было наблюдать достоверное увеличение активности каталазы для мононуклеар-ных лейкоцитов в группе СС (с высокой активностью каталазы) уже через час.
Таким образом, полученные данные требуют уточнения, но все же дают возможность предположить, что в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, работа системы антиперекисной защиты мононуклеарных лейкоцитов с различными уровнями активности катала-зы, обусловленными полиморфизмом С-262Т в промоторной части гена CAT, достоверно не меняется, оставаясь на своем физиологическом уровне.
Изменения не в активности фермента, а в поведении клеточных культур стали заметны после 24 ч инкубации мононуклеарных лейкоцитов с пе-роксидом водорода. Об этом свидетельствуют полученные нами достоверные различия в реакции клеток на окислительный стресс посредством вступления в апоптоз.
