Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 7
2.1. Применение генетических маркеров в животноводстве . 7
2.2. Методы осуществления маркер-зависимой селекции. 11
2.2.1. Полимерзная цепная реакция (ПЦР). 11
2.2.2. Исследование полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
2.3. Генетические маркеры, применяемые в свиноводстве. 16
2.3.1. Эстрогеновый рецептор (ER). 2 О
2.3.2. Ген белка, связывающего жирные кислоты (FАВР). 21
2.3.3. Ген рианодинового рецептора (Ryr 1). 21
2.3.4. ГенЕ. coli рецептораF18 (ECRF18/FUT1). 25
2.4. Колибактериоз свиней. 2 7
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 37
3.1. Животные. 37
3.2. Оборудование. 39
3.3. Реактивы. 40
3.4. Молекулярно-генетический анализ гена ECR F18. 41
3.5. Обработка полученных данных. 43
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. 44
4.1. Пополнение банка ДНК свиней . 44
4.2. Усовершенствование тест-системы для выявления
45 полиморфизма гена ECR F18/FUT1.
4.3. Анализ генетической структуры популяций свиней по 45
4.3.1. Анализ полиморфизма гена ECR F18/FUT1 у свиней
различных популяций.
4.3.1.1. Крупная белая порода. 4 8
4.3.1.2. Белорусская черно-пестрая порода. 50
4.3.1.3. Ландрас. 53
4.3.1.4. Эстонская беконная порода. 5 5
4.4. Анализ взаимосвязи reHaECRF18/FUTl и Ryrl. 57
4.5. Анализ связи гена ECR F18/FUT1 с проявлением диареи. 59
4.6. Исследование связи гена ECR F18/FUT1 с
60 продуктивностью свиней.
4.6.1. Анализ темпов роста. 6 0
4.6.2. Сохранность поросят. 6 7 4.7. Заключение. 71
5. ОБСУЖДЕНИЕ. 72
6. ВЫВОДЫ. 78
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ. 80
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 81
Введение к работе
Актуальность темы.
Основной целью подавляющего большинства отечественных научных
разработок в области животноводства является поиск путей к обеспечению населения России животноводческими продуктами, не прибегая к импорту их из-за рубежа.
В последнее время в свиноводстве проявляется четкая тенденция к
увеличению числа племенных хозяйств и товарных ферм, что стимулируется
государственными субсидиями. Одновременно снижается уровень
племенной и хозяйственной ценности животных. И в целом этот искусственный рост числа хозяйств неадекватен потребностям товарного производства.
Согласно современной концепции развития животноводства усилия сельскохозяйственных работников следует направить на увеличение получения продукции, используя научные разработки. Только это позволит сделать отрасль рентабельной и конкурентоспособной и обеспечит население качественными продуктами животноводства по приемлемым ценам.
В настоящее время повышение эффективности селекционной работы все больше связывают с развитием ДНК-технологий. Одним из основных направлений в этой работе является поиск и анализ генов, позволяющих маркировать локусы количественных признаков и вести направленную селекцию с помощью маркеров («маркер зависимая селекция»).
Как известно, на формирование продуктивности сельскохозяйственных животных оказывают влияние как генетические, так и не генетические (внешние) факторы. В этой связи, при традиционном отборе животных по фенотипическому проявлению признаков оценка истинного генетического потенциала животных может быть занижена.
Селекция по генотипу имеет преимущества перед традиционными методами. Она не учитывает изменчивость хозяйственно-полезных
4 признаков, обусловленную внешней средой, делает возможным оценку
животных в раннем возрасте независимо от пола животных и в конечном
итоге повышает эффективность селекционной работы.
Поэтому в настоящее время поиск, научное и экспериментальное
обоснование целесообразности использования молекулярно-генетических
маркеров признаков продуктивности является актуальной задачей
биотехнологии в животноводстве.
Научная новизна.
Усовершенствована методика определения аллельных вариантов гена ECR F18/FUT1 свиней. Определены частоты встречаемости аллелей и генотипов гена ECR F18/FUT1 у свиней восемнадцати популяций восьми пород (крупная белая, белая короткоухая, уржумская, белорусская черно-пестрая, ландрас, эстонская беконная, дюрок, белорусская мясная), разводимых в России и Беларуси. Изучено влияние вариантов исследуемого гена на хозяйственно-полезные признаки свиней.
Цели и задачи исследования.
Целью диссертационной работы явилось исследование полиморфизма гена рецептора Е. coli А18 (ECR F18/FUT1) у свиней различных пород и установление связи между аллельными вариантами гена и хозяйственно-полезными признаками.
Для достижения цели диссертационной работы были поставлены и решены следующие задачи:
Пополнить банк ДНК свиней различных пород.
Усовершенствовать методику анализа полиморфизма гена ECR F18/FUT1.
Определить частоты встречаемости аллелей и генотипов гена ECR F18/FUT1 у свиней различных пород.
Провести исследования взаимосвязи полиморфизма генов ECR F18/FUT1 nRyrl.
Выполнить исследования связи вариантов гена ECR F18/FUT1 с восприимчивостью поросят к диарее.
Изучить связи между вариантами данного гена и хозяйственно-полезными признаками свиней (среднесуточными привесами в период от рождения до отъема, сохранностью поросят).
Практическая значимость работы.
Пополнен банк ДНК свиней 1027 образцами, отобранными от свиней
семи пород, и созданы базы данных хозяйственно-полезных признаков. Проведена оценка свиней восьми пород на носительство нежелательного аллеля G гена ECR F18/FUT1. Изучена связь гена ECR F18/FUT1 с геном рианодинового рецептора (Ryrl) - главным геном, обуславливающим чувствительность свиней к стрессам. Исследовано влияние генотипов гена ECR F18/FUT1 на рост поросят в период от рождения до отъема и их сохранность.
Основные положения, выносимые на защиту.
Пополнен банк ДНК свиней 1027 образцами, отобранными от племенных свиней семи пород.
С использованием усовершенствованной тест-системы дана характеристика генетической структуры популяций свиней восьми пород по гену ECRF18/FUT1.
3.Выявлена тенденция взаимосвязи гена ECR F18/FUT1 с геном рианодинового рецептора свиней (Ryrl), обуславливающим чувствительность свиней к стрессам.
4. Изучены связи между генотипами гена ECR F18/FUT1 и хозяйственно-полезными признаками свиней (устойчивость поросят к
послеотъемнои диарее, среднесуточные привесы в период от рождения до отъема, сохранность).
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на:
международной конференции «ДНК-технологии в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2001 г.;
научно-практической конференции «Перспективы и развитие свиноводства в XXI веке», РАМЖ, п. Быково, 2001;
конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, 2002 г.;
2-ой международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2002 г.;
конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, 2003 г.;
3-ей международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВИЖ, 2003 г.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ.
Структура и объем работы
Диссертационная работа написана на 95 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа включает 22 таблицы и 18 рисунков. Список литературы включает 120 источников, в том числе 75 на иностранных языках.
7 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Применение генетических маркеров в животноводстве
Причинами полиморфизма ДНК в большинстве случаев являются точковые мутации, которые или создают новый сайт рестрикции или приводят к потере уже существующего. Ранние работы по обнаружению потенциальных маркеров были сфокусированы на анализе белков и групп крови, но использование этих достижений в качестве генетических маркеров на фоне развивающихся ДНК-технологий становится целесообразным [Drinkwater and Hetzel, 1991].
В отличие от групп крови и белков, анализ которых имеет широкое применение в генном картировании, полиморфизм ДНК распределен по всему геному. В этой связи, вероятность наличия локуса, тесно сцепленного с генами наследственных пороков или признаков продуктивности, многократно повышается.
Генетические маркеры могут применяться не только для диагностики наследственных аномалий, но и при выявлении важных для животноводства генов. С целью анализа генома может быть использовано три типа маркеров: функциональные гены, сегменты ДНК с неизвестными функциями и наследуемые хромосомные маркеры. Маркерные гены особенно актуальны для оценки признаков, фенотипическое проявление которых происходит относительно поздно или ограничено полом, а также для признаков, на проявление которых большое влияние оказывают негенетические факторы (факторы окружающей среды). Примерами таких признаков являются резистентность или предрасположенность к болезням, плодовитость, молочная и мясная продуктивности и ряд других.
Целью маркер-зависимой селекции (MAS, Marker-assisted selection) является замена селекции по фенотипу на селекцию на уровне ДНК. В идеале MAS должна базироваться на выявлении на уровне ДНК специфических вариантов каждого QTL (локусы количественных признаков), которые положительно влияют на проявление признака. Практически, достаточно идентифицировать маркер или группу маркеров, связанных с QTL, и определить связь сцепления между специфическими аллелями (гаплотипами) в маркерном локусе и предпочтительными аллелями в QTL [Зиновьева Н.А. и др., 1998]. Так как при селекции по генотипу можно не дожидаться фенотипического проявления, отбор может проводиться уже на эмбриональных стадиях, а для признаков, ограниченных полом, выполняться у обоих полов. MAS делает возможным так называемую предселекцию индивидуумов, при которой, исходя из продуктивности родоначальниц и сибсов, теоретически рассчитывается племенная ценность животных, что способствует усилению интенсивности отбора и избежанию его нежелательных эффектов [Брем Г. и др., 1995].
Решающим фактором для использования сцепления между специфическими маркерами и генами признаков продуктивности (или QTL) в животноводстве является сила сцепления (способность рекомбинации). Сцепление между специфическими маркерами и основными генами определяется на основе семейного анализа и должно контролироваться от поколения к поколению. Затраты окупаются только в случае тесного сцепления, предпосылкой чего является наличие плотной генной карты с маркерными локусами. Если гены (структурные или регуляторные), влияющие на продуктивность, конституцию и признаки плодовитости, известны и выделены, становится возможным выявление их желаемых вариантов.
Все признаки, в зависимости от числа генов, влияющих на их проявление, могут быть подразделены на две группы:
1. Моногенные или олигогенные признаки (главные гены).
2. Полигенные признаки (локусы количественных признаков, QTL).
Для моногенных признаков в случае приблизительной локализации гена существует возможность идентификации ДНК-маркеров, расположенных внутри главного гена или в непосредственной близости от него.
Животные
В исследованиях были использованы свиньи из 12 хозяйств России и Беларуси: э/х «Кленово-Чегодаево» Московской области; ГПЗ «Соколовка» Кировской области; совхоза-комбината «Заря» Гомельской области; ГПЗ «Нива» Московской области; ЗАО «Заречье» Кировской области; ЗАО «Дражно» Витебской области; ГПЗ «Сампурский» Тамбовской области; ПЗ «Сож» Гомельской области; ГПЗ «Мухинский» Кировской области; ГПЗ «Талдом» Московской области; СГЦ «Заднепровский» Витебской области; свинокомплекса «Борисовский» Минской области.
Всего в исследованиях участвовало 8 пород свиней:
1) крупная белая порода (351 голова)
экспериментальное хозяйство «Кленово-Чегодаево» Московской области (п=127);
ГПЗ «Соколовка» Кировской области (п=33);
совхоз-комбинат «Заря» Гомельской области (п=64);
ГПЗ «Талдом» Московской области (п=80);
ЗАО «Заречье» Кировской обл. (п=35);
свинокомплекс «Дражно» Витебской области (п=12).
2) белая короткоухая порода (64 головы)
ГПЗ «Сампурский» Тамбовской области (п=64).
3) белорусская мясная порода (47 голов)
ПЗ «Сож» Гомельской области (п=30);
ЗАО «Дражно» Витебской области (п=17).
4) уржумская порода (162 головы)
ГПЗ «Мухинский» Кировской области (п=162).
5) дюрок (65 голов)
ГПЗ «Талдом» Московской области (п=65);
6) ландрас (298 голов)
ГПЗ «Нива» Московской области (п=254)
СГЦ «Заднепровский» Витебской области (п=26);
совхоз-комбинат «Заря» Гомельской области (п=18).
7) белорусская черно-пестрая порода (169 голов)
свинокомплекс «Борисовский» Минской области (п=150);
совхоз-комбинат «Заря» Гомельской области (п=19).
8) эстонской беконной (66 голов)
совхоз-комбинат «Заря» Гомельской области (п=41);
ЗАО «Дражно» Витебской области (п=25).
От животных отбирали пробы крови или кожи (ушные выщипы). При взятии проб крови в качестве антикоагулянта использовали гепарин. При взятии проб кожи и длительной ее транспортировке в качестве консерванта использовали 96% этиловый спирт.
Выделение ДНК и постановку ПЦР проводили согласно «Методическим рекомендациям по использованию метода полимеразнои цепной реакции в животноводстве» [Зиновьева НА., Попов А.Н., Эрнст Л.К. и др., 1998].
. Оборудование.
Автоматические дозаторы переменного объема: ОД-20 ці; 20-200 ці; 200-1000 ці.
Амплификатор: «Терцик», ДНК-технология, Россия; Аналитические весы: Sortorius ВР 310S, Германия; Би дистиллятор: Millipore, Франция; Водяная баня: PolyScience, США;
Магнитная мешалка: Cimares2; Thermoline, США;
Микроцентрифуга: Kubota KM 15200, Япония;
рН-метр: ORION model 320, США;
Источник тока для электрофореза: Biskom, Россия;
Компьютер Pentium IV;
Микроволновая печь: LG MS-192A, Корея;
Программное обеспечение: MS Office 2000, BioTest;
Система для документации гелей: Biokom, Россия;
Спектрофотометр: GeneQuant, Pharmacia Biotech, Великобритания;
Электрофорезная камера: Biokom ЕС 13x12, Россия;
Трансиллюминатор: UVT1, Biokom, Россия;
Термостаты: W.C. Heraeus Hanau, Япония; Thermostat 5320 Eppendorf,
США; Techne Hybridizer HB-1, Великобритания.
Пополнение банка ДНК свиней
В рамках выполнения данной работы нами были взяты пробы и выделена ДІЖ от 1027 свиней 16 популяций семи пород. Характеристика породной принадлежности свиней, используемых в исследованиях, дана в таблице 6.
Таблица 6.
Характеристика породной принадлежности свиней, используемых в исследованиях.
Порода Популяция Число голов
Крупная белая ГПЗ «Соколовка» Кировской обл. 33
Примечание: серым цветом указаны популяции свиней, от которых
пробы ДНК были получены в ходе выполнения диссертационной работы.
По данным таблицы 6, в работе использовалось 1222 пробы ДНК свиней восьми пород, в том числе: крупная белая (6 популяций) 351 голова; белая короткоухая (1 популяция) 64 головы; уржумская (1 популяция) 162 головы; белорусская черно-пестрая (2 популяции) 169 голов; ландрас (3 популяции) - 298 голов; эстонская беконная (2 популяции) - 66 голов; дюрок (1 популяция) - 65 голов; белорусская мясная (2 популяции) - 47 голов.
Образцы ДНК хранятся при температуре -20С и могут быть использованы для проведения молекулярно-генетических и популяционно-генетических исследований.
4.2. Усовершенствование тест-системы для выявления
полиморфизма гена ECR F18/FUT1.
Следующим этапом в работе явилось усовершенствование тест-системы для анализа аллельного полиморфизма гена ECR F18/FUT1.
Предлагаемые нами праймеры позволяют легко идентифицировать как фрагменты ДНК после ПЦР-амплификации, так и рестрицированные фрагменты, образующиеся в результате ПДРФ-анализа.
Как следует из данных, представленных на рисунке 5, наличие нерестрицированного фрагмента длиной 378 п.о. соответствует генотипу АА, двух фрагментов длиной 291 и 87 п.о. - GG, в то время как наличие трех фрагментов длиной 378, 291 и 87 п.о. соответствует генотипу AG.
Анализ генетической структуры популяций свиней по гену ECR F18/FUT1.
Анализ полиморфизма гена ECR F18/FUT1 у российских и белорусских пород свиней различного направления продуктивности выявил наличие двух аллелей у всех исследованных пород. Как и ожидалось, частота встречаемости мутантного аллеля G была относительно высокой (табл. 7).
Генотип ирование свиней по гену ECR F18/FVT1.
Гель-электрофорез продуктов ПЦР после энзима тического гидролиза рестриктазогі BstHHl в 2% агарозном геле в буфере ТАЕ с добавлением бромида дгшидиума до конечной концентрации 30 нг/мл. Верхний нерестрицированный фрагмент длиной 378 п.о. соответствует аллелю А, два нижних фрагмента длиной 291 п.о. и 87 п.о. соответствуют аллелю G. Дорожки /, 2, 4, 6-генотип GG, дорожки 3, 5-генотип AG.
Таблица 7 Частоты встречаемости аллелей гена ECR F18/FUT1 у свиней
различных пород.
Породы животных указаны по возрастающей в зависимости от частоты встречаемости аллеля G.
Как показывают данные таблицы 7, наибольшая частота встречаемости предположительно чувствительного к колибактериозу аллеля G была выявлена у свиней уржумской породы (0,980), а наименьшая - у животных белорусской мясной породы (0,649).
Следует отметить, что наиболее высокая частота желательного аллеля А отмечалась у свиней мясных и беконных пород. Так, в исследованных популяциях свиней белорусской мясной, белой короткоухой, белорусской черно-пестрой и эстонской беконной пород, а также свиней пород дюрок и ландрас она колебалась от 0,216 до 0,351.
Распределение генотипов гена ECR F18/FUT1 в исследованных породах свиней схематично представлено на рисунке 6.
Рисунок 6.
Частоты встречаемости генотипов ECR F18/FUT1.
Породы животных указаны в порядке уменьшения частоты встречаемости предположительно чувствительного в колибактериозу генотипа GG.
Как следует из данных, представленных на рисунке 6, частота нежелательного генотипа GG была относительно высокой у всех исследованных пород и составляла от 44% у свиней белой короткоухой породы до 96% у свиней уржумской породы. У свиней крупной белой породы средняя частота встречаемости генотипа GG составляла 65,2%. У свиней мясных и беконных пород этот показатель колебался от 50,0 до 65,2%.
Анализ генного равновесия показал, что во всех исследованных породах свиней достоверно сохраняется генное равновесие по локусу ECR F18/FUT1 (р 0,05). Сохранение генного равновесия по исследуемому гену указывает на отсутствие давления селекции на увеличение или,, наоборот, уменьшение частоты определенного аллеля ECR F18/FUT18. Объяснением этому может служить тот факт, что устойчивость к колибактериозу не является селекционным признаком.
