Введение к работе
Актуальность исследования. Меланома кожи является новообразованием, развивающимся в результате злокачественной трансформации меланоцитов и меланобластов (Goodson A.G. et al., 2009). Несмотря на то, что меланома относится к числу визуально диагностируемых опухолей, количество случаев позднего обращения за медицинской помощью остаётся по-прежнему высоким.
По гистогенезу, биологическим особенностям возникновения и роста, тяжести клинического течения, иногда непредсказуемому исходу опухолевого процесса меланома существенно отличается от новообразований другого генеза (Гилязутдинов И.А. и др., 2010). В связи с чем в последние годы неуклонно растёт интерес исследователей к изучению данного заболевания.
Исследования последних лет в области эпидемиологии меланомы кожи установили чёткий рост заболеваемости меланомой в разных странах мира, в том числе и в России, что делает чрезвычайно актуальной проблему повышения эффективности её лечения (Закурдяева И.Г. и др., 2010). Ранняя диагностика и своевременное удаление первичной меланомы кожи являются основными составляющими успешной терапии данного заболевания. Подавляющее большинство больных меланомой кожи - это взрослые люди, в основном трудоспособного возраста, что делает эту проблему социально значимой (Garbe С. et al., 2011). Более чем у половины больных меланома кожи развивается на фоне приобретенных или, реже, врожденных невусов (Menzies S.W., 2011).
Для этой злокачественной опухоли, независимо от степени местной распространенности, характерно частое развитие отдаленных метастазов (Каплан М.А. и др., 2011). Несмотря на применение различных видов комбинированного лечения метастатической меланомы: монохимиотерапии, полихимиотерапии, иммунотерапии, иммунохимиотерапии, результаты остаются неутешительными. Причиной тому является слабая чувствительность опухоли к химиотерапевтическим препаратам, многообразие путей метастазирования и стремительная скорость диссеминации (Kee D. et al., 2011).
Вышеуказанное подтверждает необходимость дальнейшего изучения механизмов развития, инвазии и метастазирования меланомы кожи. Известно, что важную роль в развитии злокачественных опухолей играют протеолитические ферменты, которые могут наделять опухолевые клетки способностью к инвазии и метастазированию (Keller U.et al., 2007). Большое значение в реализации данных функций отводится семейству матриксных металлопротеиназ (ММП). Основной функциональной ролью матриксных металлопротеиназ является деградация внеклеточного матрикса. Кроме того, ММП регулируют функции биологически активных молекул, таких как факторы роста, молекулы клеточной адгезии (Linch C.C., 2002). Благодаря всем этим характеристикам ММП реализуются такие свойства опухолевых клеток как инвазивный рост, метастазирование. Увеличенная продукция ММП клетками стромальной популяции способствует опухолевой инвазии и ангиогенезу (Кондакова И.В. и др., 2011).
В этой связи является актуальным дальнейшее уточнение роли ММП в патогенезе злокачественных новообразований кожи и в частности меланомы кожи.
Цель исследования – изучить роль матриксной металлопротеиназы-9 в реализации и регуляции процессов пролиферации и апоптоза клеток меланомы и эффекты её ингибирования для достижения противоопухолевого эффекта.
Задачи исследования:
1. Определить содержание матриксной металлопротеиназы-9 в клетках меланомы, в невусных клетках, а также в клетках метастазов меланомы кожи у больных с меланоцитарными новообразованиями кожи;
2. Определить взаимосвязь между экспрессией матриксной металлопротеиназы-9 в клетках меланомы и невусов и содержанием дермального коллагена в данных новообразованиях, выявляемых методом прижизненного интрадермального анализа;
3. Оценить эффект ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 на регуляцию пролиферации и апоптоза клеток меланомы и экспрессию в них N-кадгерина, индуцированного трансфекцией малых интерферирующих РНК к матриксной металлопротеиназе -9;
4. Оценить причастность ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 к реализации противоопухолевой активности клеток меланомы кожи in vivo;
5. Методом морфометрии изучить количество и структурную организацию сосудов, характер и размеры зон некроза в первичной опухоли, а также количество и характер метастазов опухоли на модели меланомы кожи in vivo, в условиях ингибирования матриксной металлопротеиназы-9.
Научная новизна.
1. Впервые в условиях in vitro установлено, что трансфекция малых интерферирующих РНК к матриксной металлопротеиназе-9 в клетки меланомы кожи снижает экспрессию в них ядерного антигена пролиферирующих клеток и N-кадгерина, не оказывая воздействия на выраженность апоптоза.
2. Обнаружен факт экспрессии лимфоцитами матриксной металлопротеиназы-9 в метастазах меланомы кожи, что может быть связано с усилением продукции клетками меланомы кожи индукторов синтеза матриксной металлопротеиназы-9, действующих паракринным путём.
3. Установлено, что при селективном ингибировании матриксной металлопротеиназы-9 на биомодели меланомы кожи происходит снижение экспрессии ядерного антигена пролиферирующих клеток и количества сосудов в опухоли, уменьшение процесса изъязвления первичной опухоли, увеличение продолжительности жизни животных, снижение количества метастазов в печень и селезёнку.
4. Установлена отрицательная корреляционная связь между экспрессией матриксной металлопротеиназы-9 и содержанием дермального коллагена при меланоме кожи, что подтверждает факт участия матриксной металлопротеиназы-9 в деградации внеклеточного матрикса и реализации инвазивных характеристик опухоли.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные о характере и выраженности изменений противоопухолевого эффекта в клетках меланомы кожи при ингибировании матриксной металлопротеиназы-9 могут быть использованы для уточнения патогенеза меланомы кожи, при разработке перспективных молекулярных мишеней для терапии данного заболевания.
Внедрение результатов исследования. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре патологической физиологии ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого. Технология блокирования ММП-9 в клетках меланомы кожи in vivo и in vitro внедрена в лаборатории биохимии опухолей НИИ Онкологии СО РАМН (г. Томск).
Апробация работы. Материалы исследований доложены и обсуждены на VI региональной конференции молодых учёных онкологов «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011); на открытой межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2011); на всероссийской конференции «Актуальные вопросы онкологии» (Красноярск 2010); на 17 научно-практической конференции «Актуальные проблемы клинической онкологии и преканцерогенеза» (Якутск, 2010); на научно-практической конференции «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (Новосибирск, 2011); на заседании проблемной комиссии «Фундаментальная медицина» (Красноярск, 2011), на 36 Международном конгрессе «The 36 th Annual Meeting of the Japanese Society for Investigative Dermatology» (Киото, 2011).)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикаций материалов диссертационных исследований.
Положения, выносимые на защиту:
1. С увеличением уровня инвазии по Кларку у больных с меланомой кожи увеличивается экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 как в опухолевых клетках, так и в клетках окружающей стромы. Имеется отрицательная корреляция между экспрессией матриксной металлопротеиназы-9 и содержанием дермального коллагена при меланоме кожи (r=-0,87 p<0,05).
2. Особенностями биологического поведения клеток меланомы кожи в условиях ингибирования матриксной металлопротеиназы-9 является снижение их пролиферативной активности и способности к инвазивному росту, опосредованной изменением уровня N-кадгерина и уменьшением неоангиогенеза.
3. При селективном ингибировании матриксной металлопротеиназы-9 на биомодели меланомы кожи достигается выраженный антиметастатический эффект, проявляющийся увеличением продолжительности жизни животных, снижением количества метастазов в печени и селезёнке, а также уменьшением их размеров. Происходит снижение пролиферативной активности клеток меланомы, а также уменьшение количества сосудов в опухоли.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, включающего 191 работу, из них -11 отечественных и 180 зарубежных, работа иллюстрирована 5 таблицами и 33 рисунками.
