Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 15
1.1. Клетки, применяемые для клеточной терапии .15
1.2. Костный мозг как источник материала для клеточной терапии .16
1.2.1. Гемопоэтические клетки костного мозга 16
1.2.2. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга 19
1.3. Селезенка – основное депо зрелых лимфоидных клеток костномозгового происхождения 21
1.4. Миграционная активность клеток .22
1.4.1. Миграционная ось SDF-1/CXCR4 22
1.4.2. Миграционная ось VLA4/VCAM-1 23
1.4.3. Миграционная ось SCF\cKit 23
1.4.4. Миграционная ось VEGF/VEGFR .24
1.4.5. Миграционная ось HGF/c-Met 24
1.4.6. Миграционная ось MCP-1/CCR2 .25
1.5. Ниша стволовой клетки как регулятор миграции 26
1.6. Методы изучения миграции и распределения трансплантированных клеток 27
1.7. Особенности миграции и распределения гемопоэтических клеток костного мозга различной степени дифференцировки .30
1.8. Факторы, влияющие на миграцию и
распределение трансплантированных клеток .33
1.9. Трансплантация клеток при опухолевом росте .36
1.9.1. Влияние трансплантированных клеток на рост и метастазирование опухоли .36
1.9.2. Миграция и распределение трансплантированных клеток при опухолевом росте .39
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования .41
2.1. Лабораторные животные 41
2.2. Выделение клеток для трансплантации, их культивирование и характеристика .41
2.2.1. Индукция адипогенной дифференцировки ММСК 42
2.2.2. Индукция остеогенной дифференцировки ММСК. 43
2.2.3. Определение фенотипа ММСК костного мозга. 43
2.2.4. Окрашивание клеток витальным красителем Hoechst 33342 43
2.3. Выделение ДНК из органов реципиента и определение ее концентрации 44
2.4. Исследование миграции и распределения трансплантированных клеток .44
2.4.1 Изучение миграции и распределения трансплантированных клеток костного мозга и селезенки 44
2.4.2. Изучение миграции и распределения трансплантированных клеток нефракционированного костного мозга и ММСК .46
2.5. Исследование влияния роста опухоли на миграцию и распределение трансплантированных клеток костного мозга 27
2.6. Изучение влияния трансплантации клеток костного мозга на выживаемость животных-носителей меланомы В16 47
2.7. Оценка влияния трансплантации клеток на опухолевый рост 48
2.8 Флуоресцентная микроскопия срезов органов 48
2.9. Разработка микрочиповой методики анализа
распределения трансплантированных клеток 49
2.10. Статистическая обработка полученных результатов 50
ГЛАВА III. Результаты исследования .51
3.1. Динамика распределения трансплантированных клеток костного мозга и спленоцитов по органам интактного реципиента 51
3.1.1. Распределение трансплантированных клеток костного мозга...51
3.1.2. Распределение трансплантированных клеток селезенки 54
3.1.3. Сравнительный анализ временной динамики распределения трансплантированных клеток костного мозга и селезенки .56
3.2. Влияние меланомы В16 на миграционную активность неразделенной популяции клеток костного мозга и ММСК 61
3.2.1. Распределение трансплантированных клеток костного мозга по органам интактного реципиента 61
3.2.2. Распределение трансплантированных клеток костного мозга в организме реципиента-носителя меланомы В16 64
3.2.3. Сравнительный анализ распределения трансплантированных клеток костного мозга в организме интактного реципиента и реципиента-носителя меланомы В16 68
3.2.4. Влияние опухолевого роста на распределение трансплантированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга 72
3.2.5. Распределение нефракционированной популяции клеток костного мозга и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в организме реципиента-носителя меланомы В16 .74
3.3. Изучение распределения трансплантированных клеток в органах реципиента-носителя меланомы в при помощи флуоресцентной микроскопии 76
3.4. Анализ влияния трансплантации ККМ на выживаемость животных-носителей меланомы В16 и рост опухоли 84
3.5. Разработка биочипа для оценки миграционной активности изучаемых клеток 86
3.5.1. Количественная нормировка контрольного олигонуклеотида (Q4) 87
3.5.2. Модельный микрочиповый анализ специфической последовательности Y-хромосомы разной концентрации, иммобилизованной на аминослайды с нормиров кой по внешнему стандарту 88
3.6. Сравнительная оценка результатов, полученных при использовании ПЦР, ПЦР в режиме реального времени и биочипового анализа 90
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов исследования 92
Заключение 103
Выводы 105
Список сокращений .106
Список литературы
- Миграционная активность клеток
- Влияние трансплантированных клеток на рост и метастазирование опухоли
- Выделение ДНК из органов реципиента и определение ее концентрации
- Распределение трансплантированных клеток костного мозга по органам интактного реципиента
Миграционная активность клеток
Клеточная терапия – комплекс терапевтических подходов, основанных на трансплантации клеток в организм человека для лечения различных заболеваний. Для клеточной терапии на сегодняшний день применяются: эмбриональные стволовые клетки (Yang D., 2008), фетальные стволовые клетки (Sakai H., 2013), гемопоэтические стволовые клетки (Tse W, 2008), эндотелиальные стволовые клетки (Jiga J., 2013), мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (Davey G.C., 2014; Ng T.K., 2014), дендритные клетки (Cohn L., 2014), натуральные киллеры (NK-клетки) (Moretta L., 2014), Т- лимфоциты (Zang Y.W., 2014) и др. Наиболее перспективными материалом для трансплантации являются фетальные и эмбриональные клетки, однако их применение ограничено этическими нормами.
Источников клеток для трансплантации описано достаточно много. Мезенхи-мальные стволовые клетки выделяют из костного мозга, жировой ткани (Zuk P.A., 2001), скелетной мышцы (Williams J.T., 1999), синовиальной оболочки (De Bari C., 2001), периферической крови (Kuznetsov S.A., 2000), пульпы зуба (Kawanabe N., 2014), амниотической жидкости (Prusa A.R., 2003), волосяных фолликулов (Joachimiak R., 2012). Гемопоэтические стволовые клетки получают из костного мозга, периферической и пуповинной крови (Сериков В.Б., 2008). NK-клетки, Т-лимфоциты, дендритные клетки выделяют из костного мозга, периферической крови, селезенки (Xu W.l., 2013; Miller J.S., 2013; Chouaib S., 2014).
Несмотря на обилие источников клеточного материала, костный мозг остается наиболее изученным и традиционным источником клеток для трансплантации. Необходимо отметить, что в костном мозге функционально сосуществуют и взаимодействуют два основных типа стволовых клеток: гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки ММСК
Костный мозг представляет собой гетерогенную структуру, включающую популяции стволовых клеток, лимфоидных и кровяных клеток на различных этапах дифференцировки, а также клети ретикулярной стромы. В свою очередь клетки ретикулярной стромы включают: фибробласты, остеобласты, жировые и эндотелиальные клетки (Шиффман Ф. Дж., 2000).
В костном мозге происходит многостадийный процесс кроветворения, завершающийся выходом в циркулирующую кровь зрелых клеток (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов), родоначальником которых является гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК).
Гемопоэтические стволовые клетки составляют около 0,01% от всех ядросо-держащих клеток костного мозга. На рисунке 1 представлена современная схема гемо-поэза, основанная на классической модели, предложенной Чертковым И.Л. и Mathe с соавт. в 1973г.
На схеме представлены основные иммунофенотипические характеристики клеток. Источником всех кроветворных клеток является плюрипотентная гемопоэтиче-ская стволовая клетка (ГСК). Популяция полипотентных гемопоэтических стволовых клеток мышей характеризуются отсутствием клеточного маркера дифференцировки (Lin-), наличием антигена стволовых клеток (Sca+) и рецептора к ростовому фактору роста стволовых клеток (cKit) (Uchida N., 1992). А
Клеточный состав и фенотип гемопоэтических клеток человека и мыши. (Doulatov S., 2012). Примечания ГСК-гемапоэтические стволовые клетки, LT-ГСК – долгоживущая популяция ГСК, IT-ГСК – популяция ГСК средней продолжительности жизни ST-ГСК – короткоживущая популяция ГСК, ГМПК – гемопоэтическая мульти-потентная прогениторная клетка, Л/МПК –лимфопоэтическая/миелопоэтическая про-гениторная клетка, МПК – миелопрогениторная клетка, ЛПК – лимфопоэтическая прогениторная клетка, ГМП – гранулоцито/моноцитопоэтическая прогениторная клетка, МеП – мегакариоцитарная прогениторная клетка.
Популяции полипотентных ГСК человека имеют иммунофенотип: Lin-, CD38-, CD34+. ГСК человека характеризуются наличием антигена CD34+, CD49f+, CD90+ и CD133+, CD45RA-, однако ее гетерогенность изучена плохо (рис. 1А). Популяция ГСК мышей разделяют на долгоживущую популяцию (long time LT-ГСК), популяцию средней продолжительности жизни (intermediate time IT-ГСК) и короткоживущую популяцию ГСК (short time ST-ГСК), иммунофенотипы которых представлены на рисунке 1Б (Sutherland, 1989).
К уникальным свойствам ГСК относят их способность к самообновлению, дифференцировке во все зрелые клетки кровяной и лимфатической системы. Также показана способность ГСК дифференцироваться в не гемопоэтические клеточные линии: мышечные клетки (Abedi M., 2007), гепатоциты (Theise N.D., 2000), клетки легочного эпителия (Krause D.S., 2001), что дает основание считать ГСК перспективными для клеточной реконструктивной терапии.
По мере снижения пролиферативного потенциала ГСК дифференцируются в гемопоэтическую мультпотентную прогениторную клетку (ГМПК). Популяция ГМПК человека имеет иммунофенотип CD34+, CD150+, Flt3+. Иммунофенотип MPP мыши: CD34+, CD150-, Flt3+. Популяция мультипотентных прогениторных клеток составляет 1-5% ядросодержащих клеточных элементов костного мозга (Doulatov S., 2012).
Дальнейшая дифференцировка идет либо по лимфопоэтической ветке (комми-тированные лимфоидные прогениторные клетки ЛПК), либо по миелоидной ветке (коммитированные миелоидные прогениторные клетки МПК). Лимфоидная ветвь дает развитие Т-, В-лимфоцитам и NK клеткам. Миелоидная ветвь дает начало дифференцированным короткоживущим клеточным типам, включая гранулоциты, моноциты, эритроциты и мегакариоциты (рис. 1А, Б) (Doulatov S., 2012). Предполагается наличие трансдифференцировки лимфомультипотентных прогениторов и миелоидных проге-ниторных клеток (Kawamoto., 1999) (рис. 1Б).
Таким образом, стволовые полипотентные гемопоэтические клетки составляют лишь 0,01% клеток гемопоэтического ряда. Основную клеточную массу составляют клетки миелоидного, лимфоидного, эритроцитарного и мегакариоцитарного рядов различной степени дифференцировки. 0,1-2% составляют бластные клетки (низко дифференцированные клетки), 5-20% лимфоциты, 0,7-3,1% моноциты, 0,1-1,8% плазматические клетки.
Продолжительность жизни созревающих и зрелых клеток костного мозга различна. Время жизни Т-клеток памяти 20 лет и более. Около 85% вновь образовавшихся В-лимфоцитов являются короткоживущими клетками, длительность жизни которых не превышает 10 дней. Меньшая часть (около 14%) имеют среднюю продолжительность жизни 4-6 недель. Около 1% всех В-лимфоцитов составляют В-клетки памяти, которые могут жить годами и десятилетиями. Плазматические клетки являются ко-роткоживущими клетками (2-3 дня) и быстро элиминируются при отсутствии антигена. Моноциты тоже имеют короткий транзиторный период, находясь в крови 10-20 часов, затем выходят через мембраны капилляров в ткани. В тканях, становясь тканевыми макрофагами, где могут жить месяцами.
Соотношение фракций лимфоцитов в костном мозге различно. Фракция долго-живущих Т–лимфоцитов является рециркулирующей, мигрируя из костного мозга в кровь и обратно, составляет 10% клеток КМ. Эта фракция свободно перемещающихся Т-лимфоцитов между лимфоидными компартментами (Fauci A.S., 1975). Кроме того, костный мозг содержит В-лимфоциты различной степени дифференцировки, макрофаги (CD11b, Ly-71, CD14+), натуральные киллеры (NK-клетки CD161+,CD3-,CD16+, CD56+) (рис. 1) (Lai L, 1998). NK-клетки составляют третью по численности популяцию лимфоидных клеток костного мозга.
Влияние трансплантированных клеток на рост и метастазирование опухоли
Для изучения миграции и распределения клеток нефракционированного костного мозга и ММСК костного мозга был использован генетический маркер – специфическая последовательность хромосомы (ген Zfy), который был выявлен с помощью ПЦР в режиме реального времени. ПЦР в реальном времени выполнена на Authorized Termal Cycler – Light Cycler 480 II/96 (Roche). Для амплификации целевой последовательности были использованы следующие последовательности праймеров: 5` TCCAGGCTGGTCGCAAACTCATTT-3`, 5`- ACATGAACAACGCCTTGGGCTTCA -3` и зонд 5`- [FAM]- tccactggcctgtgttggcattgcagttat- BHQ1 -3`. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 20 пмоль каждого праймера, 20 пмоль зонда, 5 мкл ДНК. Условия реакции амплификации: денатурация 95C в течение 5 минут, 40 циклов: денатурация 95C 20 сек., отжиг праймеров 65C 20 сек., и элонгация 72 C 20 сек. Для определения абсолютного количества маркерного гена в образцах использовали серию разведений стандарта, в качестве которого была использована плазмида с наработанным геном Zfy Y –хромосомы. Результаты представлены в виде количества трансплантированных клеток на 100 тысяч клеток реципиента. Поскольку в клетках самца содержится по 2 копии гена Zfy Y–хромосомы, количество трансплантированных клеток в образце рассчитывалось по формуле: N=A/2, где N-количество Y-позитивных клеток, А-количество гена, определенного в образце. В реакцию брали ДНК образцов одинаковой концентрации, из 100 тыс. клеток.
В качестве внутреннего контроля был использован ген «домашнего хозяйства» -актина, присутствующий в одинаковых количествах во всех клетках. 2.5. Исследование влияния роста опухоли на миграцию и распределение трансплантированных клеток костного мозга
Для исследования влияния роста опухоли на миграцию и распределение трансплантированных клеток костного мозга, животные были разделены на 4 группы случайным образом 12 мышей в каждой группе. Самкам мышей линии C57Bl в правую заднюю лапу подкожно вводили суспензию клеток меланомы B16 в дозе 250 103 клеток/мышь в 200 мкл фосфатно-солевого буфера. Степень прививаемости опухоли животным составила 100%.
На третьи сутки после трансплантации опухоли самкам первой и второй групп внутривенно вводили ММСК и ККМ самцов, соответственно, в дозе 1х106 клеток/мышь в питательной среде ИГЛА МЕМ объемом 0,25 мл. Мышам третьей и четвертой групп внутривенно вводили ММСК и ККМ, меченные красителем Hoechst 33342, в той же дозе. Мышей-опухоленосителей забивали методом дислокации шейного отдела позвоночника через 1 час, 3, 7 и 14 суток после трансплантации клеток. Для исследования забирали легкие, кожу, опухоль, лимфатические узлы, сердце, печень, селезенку, костный мозг, головной мозг самок-реципиентов.
Изучение влияния трансплантации клеток костного мозга на выжи ваемость животных-носителей меланомы В16.
Животные были разделены на 4 группы случайным образом, по 10 животных в каждой группе. Прививка опухоли животным 1, 2 и 3 групп производилась путём подкожного введения 250х103 клеток меланомы В16/мышь в растворе питательной среды Игла МЕМ объемом 0,2 мл. На третьи сутки после трансплантации опухолевых клеток животным 1-й опытной группы внутривенно вводили ММСК в дозе 1х106 клеток/мышь в питательной среде ИГЛА МЕМ объемом 0,25 мл. Животным 2-й группы вводили ККМ в той же дозе. Животным третьей группы внутривенно вводили физиологический раствор в том же объеме. Четвертая групп – интактные животные. Живот ные находились в эксперименте до естественной гибели, после чего проводилась оценка достоверных различий выживаемости животных 4-х групп с помощью метода Ка-план-Майера.
Животные были разделены на три группы случайным образом, по 10 животных в каждой группе. Прививка опухоли животным первой, второй и третьей групп производилась путём подкожного введения 250х103 клеток/ мышь в растворе питательной среды Игла МЕМ объемом 0,2 мл. На третьи сутки после трансплантации опухолевых клеток животным первой опытной группы внутривенно вводили ММСК в дозе 1х106 клеток/мышь в питательной среде ИГЛА МЕМ объемом 0,25 мл. Животным 2-й группы вводили ККМ в той же дозе. Животным 3-й группы внутривенно вводили физиологический раствор в том же объеме.
Начиная с 13 дня, когда опухоль определялась визуально, проводили ежедневное измерение объема опухоли при помощи калипера.
В качестве флуоресцентной метки был использован витальный ДНК-связывающий краситель Hoechst 33342. Для гистологического анализа органы фиксировали в 4% растворе параформальдегида. Детекцию флуоресцентно меченых трансплантированных клеток в тканях проводили в ультрафиолетовом свете с длиной волны 350 нм при помощи люминесцентного микроскопа («Axioplan - 2 MOT», Zeiss) на срезах толщиной 5-7 мкм, изготовленных на микротоме - криостате «HM 560 MV» (Германия, Microm). 2.9. Разработка микрочиповой методики анализа распределения трансплантированных клеток
Ампликоны, полученные после двураундовой ПЦР (см. пункт 2.4) очищались от компонентов буфера и праймеров на колонках (Promega, UK). В каждую пробу добавлялся нормировочный олигонуклеотид (табл. 1). Пробы с общей ДНК наносились на стандартные слайды для микрочипового анализа с аминомодифицированной поверхностью. Печать слайдов осуществлялась контактным методом на споттере SpotArray 24 Mcroarray Printing System (Perkin Elmer, США). Закрепление ДНК-проб проводилось фотохимически, путем облучения слайдов в течение одной мин. в UV диапазоне ( =240 нм). Обработка слайдов осуществлялась по методике, описанной в (Ryabinin V.A., 2006).
Для получения флуоресцентной гибридизационной картины микрочипа проводилась гибридизация с использованием олигонуклеотида, модифицированного по 5 -концу красителем Су3 с добавлением нормировочного олигонуклеотида, модифицированного красителем Су5 (табл. 1). Гибридизация и отмывка микрочипа проводилась по методике, описанной в (Ryabinin V.A., 2006). Сканирование микрочипа осуществлялось с использованием конфокального сканера ScanArray Express (Perkin Elmer) на двух длинах волн возбуждения флуоресценции ( =543 и 633 нм) для получения флуоресцентной картины гибридизации и нормировки флуоресценции соответственно. Ко личественный анализ интенсивности свечения спотов микрочипа проводился с помощью стандартного программного обеспечения ScanArray Express (Perkin Elmer).
Статистическая обработка результатов проводилась при помощи программы Statistica 6,0 (StatSoft, США). Полученные данные проверяли на нормальность распределения согласно критериям Колмогорова-Смирнова, результаты описаны в виде среднего арифметического и стандартного отклонения. Достоверность различий оценивали по критериям Манна-Уитни (в независимых группах). Различия считали достоверными при p 0,01. Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для исследования миграционной активности и распределения трансплантированных дифференцированных лимфоидных клеток селезенки и клеток костного мозга, клетки самца-донора мышей линии СВА (содержащие эндогенный маркер – Y-хромосому) трансплантировали самкам-реципиентам линии СВА. Через 1 час, 24 часа, 1 и 3 месяца проводили полуколичественный анализ содержания Y-позитивных клеток в органах самки при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве маркера трансплантированных клеток была использована специфическая последовательность Y-хромосомы, конститутивно присутствующая исключительно в клетках самца.
Для полуколичественного анализа использовали анализ электрофореграмм ам-пликонов после вложенной ПЦР при помощи программного пакета Quantity One, интенсивность свечения полосы ампликона прямо пропорциональна концентрации маркера в исследуемых образцах. Данная программа осуществляет анализ изображений, конвертируя сигналы от биологических образцов в цифровой формат. Результаты представлены в относительных единицах (отн.ед.) оптической плотности, в виде М±.
Нами установлено, что максимальные показатели накопления маркера клеток костного мозга обнаружены через один и три месяца после трансплантации в костном мозге (137,9±17,4 и 131,9±7,9 отн. ед. опт. пл, соответственно). Минимальное накопление Y-позитивных клеток за весь период исследования было обнаружено в коже (рис. 3). Рис. 3. Распределение трансплантированных клеток костного мозга по органам реципиента. Примечания: Клетки самца донора (содержащие Y – хромосому) внутривенно вводили самкам – реципиентам. Через 1 час (А), 24 час (Б), 1 месяц (В) и 3 месяца (Г) в органах определяли количество Y–позитивных клеток при помощи полиме-разной цепной реакции, с последующим анализом электрофореграмм. По оси ординат – относительные единицы оптической плотности ампликонов электрофореграмм. Данные представлены в виде М±. Достоверными различия считались при р 0,01. Сокращения: п – печень, с – селезенка, км – костный мозг, сер – сердце, лу – лимфатические узлы, гм – головной мозг.
В первый час после введения максимальное количество маркера имплантированных клеток было обнаружено в печени и селезенке (111,0±13,4 и 107,9±13,2 отн. ед. опт. пл, соответственно). В течение первых суток происходит равномерное перераспределение трансплантированных клеток в, селезенке, костном мозге, сердце, головном мозге, поскольку достоверных различий содержания маркера между данными органами не обнаружено. Минимальное количество Y-позитивных клеток обнаружено в коже (рис. 3, табл. 2). Максимальные показатели накопления донорских клеток костного мозга через 1 месяц определяются в костном мозге и в селезенке (130,75 и 119,65 отн. ед. опт. пл., соответственно).
Выделение ДНК из органов реципиента и определение ее концентрации
Клеточная терапия основана на трансплантации клеток в организм человека с целью лечения патологических состояний и является быстро развивающимся и перспективным терапевтическим подходом. Эффективность клеточной терапии напрямую зависит от миграционной активности трансплантированных клеток, поскольку для осуществления своих терапевтических функций, клетки должны мигрировать в патологический очаг. Поэтому изучение распределения трансплантированных клеток после трансплантации является обязательным этапом при разработке клеточной терапии (Senseb L., 2013; Terrovitis J.V., 2010).
На миграционную активность клеток влияет множество факторов, таких как тип трансплантированных клеток, их микроокружение (ParkS.K., 2007; Li Q., 201; Burst V., 2013), количество (Sergeev S.A., 2011), тканевое происхождение (MoritaY., 2011), отсутствие либо наличие патологического очага (воспаление, повреждение, опухолевый рост и др.). Микроокружение клеток является одним из основных факторов, влияющих на миграционную активность клеток, контролирует баланс между активацией, диффе-ренцировкой и мобилизацией стволовых клеток (Schofield R., 1978; Morrison S.J., 2008).
Костный мозг является наиболее изученным и традиционными источником клеточного материала для трансплантации. В его состав входят стволовые клетки, низ-кодифференцированные клетки лимфоидной и кровеносной системы. Судьба и функции клеток после выхода из костного мозга в кровеносное русло до сих пор не поняты до конца. Для исследования влияния степени дифференцировки на миграционную активность, а также влияние микроокружения клеток на их миграцию и распределение в организме, мы провели сравнение миграции трансплантированных клеток костного мозга и селезенки, поскольку селезенка в основном состоит из зрелых, дифференцированных клеток, тогда как костный мозг состоит главным образом из низкодифферен-цированных прогениторных клеток. Для количественного определения трансплантированных клеток в организме реципиента мы использовали эндогенный генетический маркер – Y-хромосому, который отличается высокой стабильностью, отсутствием влияния на функциональную активность клеток и возможностью использования в долгосрочных экспериментах.
Нами установлено, что клетки костного мозга и селезенки мигрируют во все исследуемые органы во все сроки после трансплантации. Интенсивность миграции клеток костного мозга и селезенки варьирует в зависимости от органа и срока после введения. Наиболее явные отличия распределения клеток из различных источников отмечены в лимфатических узлах и костном мозге. Количество мигрировавших спленоци-тов в лимфатические узлы значительно больше по сравнению с клетками костного мозга на всех исследуемых сроках после введения. В течение первого месяца миграция спленоцитов в лимфоузлы увеличивается, в последующем оставаясь на высоком уровне. Тогда как количество трансплантированных клеток костного мозга в лимфатические узлы через три месяца достоверно меньше по сравнению с начальной точкой. Трансплантированные клетки костного мозга мигрируют в костный мозг реципиента интенсивнее по сравнению со спленоцитами в отдаленные сроки после трансплантации. Однако через 1 и 24 часа после трансплантации количество спленоцитов в костном мозге сравнимо с количеством ККМ, вероятно это связано с наличием в селезенке ГСК и рециркулирующего пула лимфоцитов, которые мигрируют в костный мозг реципиента (Fauci A.S., 1975; Lai L, 1998).
В таких органах, как селезенка, печень, кожа была обнаружена в целом схожая динамика накопления трансплантированных клеток имеющая, однако, количественные различия. В селезенке во все исследуемые сроки уровень маркера спленоцитов достоверно выше маркера клеток костного мозга. Так как клетки костного мозга и селезенки содержат популяции лимфоидных клеток, возможно схожая динамика их распределения в селезенке связана с явлением хоуминга, а также может быть обусловлена участием селезенки в гематопоэзе во взрослой жизни у мышей (KondoM., 2003).
Очевидно, что миграция зависит от особенностей запроса клеток микроокружения того или иного органа, от запаса пула собственных стволовых клеток в каждом органе. На сегодняшний день описано существование ниш стволовых клеток во многих тканях организма: быстро обновляемые эпителиальные ткани (кожа, желудочно кишечный тракт, воздухоносные пути), волосы, высшая нервная система (ButtiE., 2014), печень, селезенка (Petvises S., 2014), сердце (Bruneau B.G., 2014) и др. Предполагается, что именно ниши периферических тканей обеспечивают миграционную активность и выживаемость стволовых клеток вне костного мозга (Kaplan R.N., 2007).
Вероятно, распределение трансплантированных клеток по всем исследуемым органам реципиента опосредованно сигналами микроокружения резидентных стволовых клеток периферических тканей. Поскольку нами показано, что трансплантированные клетки костного мозга определяются во всех исследуемых органах, вероятно, что резидентные тканевых СК, имеют костномозговое происхождение. Однако состав периферических ниш стволовых клеток значительно отличаются по влиянию на активность стволовых клеток по сравнению с костномозговой нишей, что может служить причиной более интенсивного хоминга стволовых клеток в костный мозг. Миграционная активность мезенхимальных и гемопоэтических клеток костного мозга в органы и ткани организма может быть связана с выполняемыми ими функциями. В связи с этим стромальные клетки (их в костном мозге около 0,01 %) мигрируют в органы и ткани для поддержания пула регионарных стволовых клеток, участвующих в процессах пролиферации, дифференцировки и репарации органов и тканей, а гемопоэтические (их в костном мозге около 1%) – в костный мозг и, возможно, в лимфоузлы. Именно гетерогенность трансплантированных клеток костного мозга обусловливает особенности их ремиграции в костный мозг. Показано, что селезенка у мышей не только содержит лимфоидную ткань, фагоциты, удаляющие старые клетки крови, но и наряду с костным мозгом участвует в процессах кроветворения. Таким образом, селезенка рассматривается как важнейшее депо как зрелых клеточных элементов крови, используемых организмом при кровопотере, так и стволовых клеток, однако процентное содержание их гораздо ниже по сравнению с костным мозгом.
В литературе описаны механизмы миграции клеток, связанные с цитокинами, хемокинами и их клеточными рецепторами. Важным цитокином, регулирующим миграцию клеток служит фактор стромальных клеток-1 (stromalcell-derived factor-1, SDF-1), решающую роль в синтезе которого играет тканевая гипоксия (Hitchon C., 2002). Блокада индуцируемого гипоксией фактора 1 (HIF-1) приводит к снижению синтеза SDF-1 и снижению адгезивной способности стволовых клеток в культуре. Взаимодействие хемокина SDF-1 и рецептора CXCR4 (C-X-C chemokinereceptortype 4) является ключевым в регуляции хоминга и миграции стволовых клеток, оно контролирует прикрепление, заселение костного мозга стволовыми клетками развития и выход зрелых клеток костного мозга в циркуляцию крови. Активация SDF-1/CXCR4 происходит в ответ на воспалительные, хемотактические стимулы, такие как ИЛ-6, выделяющиеся в очаге воспаления, инфаркте, инсульте, травме, опухоли, при образовании новых сосудов, для рекрутирования эндотелиальных клеток предшественников. Хемотаксис по градиенту концентрации SDF-1/CXCR4 демонстрируют около 18% мононуклеарных клеток костного мозга и примерно 22% мононуклеаров селезенки, которая также является «резервуаром» CXCR4+ клеток предшественников (Григорян А.С., 2006). Миграционная активность в печень, легкие, кости и др. нелимфоидные органы вероятно также связано с высокой экспрессией в данных органах хемокина SDF1.
Распределение трансплантированных клеток костного мозга по органам интактного реципиента
Клетки костномозгового происхождения постоянно рециркулируют по пути костный мозг – кровяное русло – периферический орган – кровь – костный мозг. Данный процесс носит динамический характер, на который влияют множество факторов, к которым относятся патологические состояния, в том числе опухолевый рост. Необходимо отметить, что циркулирующие клетки костного мозга принимают непосредственное участие в указанных патологических состояниях. Одни авторы утверждают, что клетки костномозгового происхождения стимулируют рост опухоли, в основном за счет участия в формировании стромы опухоли, неоангиогенеза, стимуляции метаста-зирования (Zhang T., 2013; DeBoeck A., 2013), установление иммунологической толерантности (Xiao C.X., 2013; Stockmann C., 2014). Результаты исследования других авторов свидетельствуют о ингибирующем влиянии клеток костного мозга на тумороге-нез (KobayashiA.,2007; Finnberg N.K., 2011). Противоречивые данные о участии ММСК, гемопоэтических клеток в канцерогенезе указывают на зависимость эффекта трансплантации клеток от времени введения (стадия развития опухоли), клеточного состава, пути введения, дизайна эксперимента, метода детекции трансплантированных клеток. Костный мозг содержит различные популяции клеток, которые применяются для лечения онкологических заболеваний. Например, натуральные киллеры (NK-клетки) и эффекторные Т-клетки имеют сильный противоопухолевый потенциал. Оба типа клеток относятся к противоопухолевому иммунитету (Wrzesinski C., 2005; Sublesk J.J., 2009). Дендритные клетки костного мозга также способны вызывать апоптоз опухолевых клеток (Huang J. 2005; Nicolas A., 2007). Некоторыми авторами также показано, что ММСК костного мозга введенные внутривенно мигрируют в опухоль и подавляют ее рост (Klopp A.H., 2011). Клетки костного мозга секретируют различные биологически активные молекулы, которые могут оказывать влияние на пролиферацию, ми грацию опухолевых клеток, а также на ангиогенез: интерлейкины 2, 3 , 6, 8 (IL), CC-хемокинывлиганд (CCL2); фактор роста фибробластов (FGF); инсулиноподобный фактор роста (IGF-1); моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP -1); тромбоци-тарный фактор роста- (-PDGF); остеонектин (кислый белок, богатый цистеином,SPARC); трансформирующий фактор роста (TGF); ингибиторы металло-протеиназ 1 (TIMP - 1); сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), матриксная металлопротеиназа-2, 9 ( ММР 2, 9), фактор некроза опухоли- (TNF- ) и др. (KloppA.H.,2011; Przybyla B.D., 2014). Эти цитокины могут как поддерживать, так и подавлять рост опухоли. Этот процесс зависит от соотношения цитокинов, секрети-руемых клетками костного мозга, а также от их взаимодействия.
Поскольку для внедрения клеточной терапии в клиническую практику необходимо изучить безопасность применяемых методов. Была проведена оценка влияния трансплантации клеток костного мозга на среднюю продолжительность жизни животных реципиентов-опухоленосителей и на скорость роста опухоли. Было показано, что внутривенная трансплантация ККМ и ММСК на третьи сутки после прививки опухоли по сравнению с контрольной группой достоверно не повлияла на выживаемость животных–носителей меланомы В16.
Нами показано, что при трансплантации ММСК на третьи сутки после прививки опухоли, размер 12-ти дневной опухоли был достоверно больше по сравнению с группой ККМ и контрольной группой. Вероятно, трансплантированные ММСК в период интенсивного роста опухоли участвуют в формировании стромы опухоли, неоан-гиогенезе (Zhang T., 2013; DeBoeck A., 2013). Также отмечается достоверное увеличение опухоли на 19 сутки в группе ММСК по сравнению с группой ККМ., что может свидетельствовать скорее о ингибирующем влиянии на опухолевый рост трансплантированных ККМ, что может быть обусловлено противоопухолевой активностью NK-клеток, Т-лимфоцитов, дендритных клеток костного мозга (Subleski J.J.,2009; WrzesinskiC., 2005). Трансплантация ККМ не влияет на рост опухоли, поскольку достоверных отличий с контрольной группой не обнаружено. Однако отмечена динамика снижения объема опухоли на поздних стадиях в группе ККМ по сравнению с контрольной группой.
Также в литературе имеются ограниченные и противоречивые сообщения о распределении клеток костного мозга при опухолевом росте на различных сроках развития опухоли (Мелешина А.В., 2013; Xiao C.X., 2013; Mou Y., 2011). Взаимоотношение клеток костного мозга и опухолевых клеток основано на миграционной способности ККМ, изучение которой необходимо для решения данных противоречий. Для исследования влияния опухолевого роста на миграционную активность клеток костного мозга мы сравнили количественное соотношение мигрировавших клеток в органах интактного реципиента и реципиента–носителя меланомы В16.
Наиболее значимые отличия миграции и распределния трансплантированных клеток костного мозга обнаружено в костном мозге, селезенке и лимфатических узлах. При опухолевом росте преобладает миграция трансплантированных клеток в костный мозг, тогда как при нормальных условиях миграционная активность выше в селезенку реципиента.
Вероятно, опухолевые клетки стимулируют ремиграцию трансплантированных клеток костного мозга в костный мозг и снижают в селезенку и лимфатические узлы. Также показано увеличение количества трансплантированных клеток в опухолевой ткани. Дискутируется участие в миграции стволовых клеток в опухоль таких факторов, как IL 1-6, 1 и 2 интегринов, L-селектина и белков внеклеточного матрикса (Son B.R., 2006; Kendal S.E., 2008). Основная роль в этом вопросе отводится миграционной оси CXCR4 – SDF-1 (Kucia M., 2005; Брюховецкий И.С., 2013). Усиленная миграция трансплантированных клеток в костный мозг возможно объясняется влиянием опухолевых клеток. На настоящий момент показана миграция опухолевых клеток в костный мозг, что может служить причиной высокого накопления в нем трансплантированных клеток за счет выделения опухолевыми клетками, мигрировавшими в костный мозг, цитокинов, хемокинов, факторов роста (SemesiukN.I., 2013; BubnovskayaL., 2014). Предполагается, что накопление раковых клеток в костном мозге является основополагающим фактором метастазирования опу холи, такие клетки обозначаются диссеминированными опухолевыми клетками (Bubnovskaya L., 2014). Возможно, интенсивная миграция трансплантированных клеток в костный мозг реципиентов-носителей меланомы В16 опосредована хемоаттрак-тантами диссеменированных опухолевых клеток. Существует также теория, согласно которой метастазирование опухолевых клеток происходит путем слияния костномозговых лимфоидных клеток с опухолевыми клетками, такие гибридные клетки обладают способностью к направленной миграции и неконтролированным ростом (Pawelek J.M., 2014). Вероятно, накопление трансплантированных клеток костного мозга в легких реципиента-опухоленосителя может свидетельствовать о метастазирования опухолевых клеток.
Костный мозг содержит ММСК, ГСК, эндотелиальные прогениторные клетки, которые функционально взаимодействуют и при их котрансплантации влияют на распределение друг друга, а соответственно на эффективность приживления, дифферен-цировки и выработку цитокинов и ростовых факторов. Поэтому для поиска оптимального материала для трансплантации, необходимо изучать свойства клеток при котрансплантации на различных моделях. При сравнении распределения неразделенной клеточной популяции костного мозга и популяции ММСК возможно описать влияние окружения клеток при котрансплантации на их распределение в условиях роста опухоли.
